实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
高二年级 班 姓名 实验日期:____月 日 【知识准备】 1.背景知识
酶是生物体内各种化学反应的催化剂,它有高度的专一性和高效性。但酶在水溶液中很不稳定,且不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。将固定化酶装柱,当底物经过该柱时,在酶作用下转变为产物。 2.实验原理
本实验是采用吸附法制备固定化酶。
(1)使用的吸附剂是石英砂 ,石英砂是由天然矿石粉碎而成,它的化学成分是二氧化硅,其化学反应活性很低。
(2)使用的α-淀粉酶通常由枯草杆菌深层发酵制备,具有较强的液化淀粉的能力,可用于制备糊精,其最适pH5.5~7.5,最适温度50℃~75℃。 3.各种淀粉酶水解淀粉的反应如下:
α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精 ,淀粉溶液加入KI-I 2指示溶液时显现蓝色,而转变成糊精后显现红色。
将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱,使淀粉溶液流过柱,若柱的流出液在加入KI-I 2溶液时可看到溶液呈现红色,表明水解产物中有糊精。
α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后,酶的稳定性增加 ,包括酶对热的稳定性,对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。由于稳定性增加,保存期也相应延长,数日内酶活力不减。 4.思考题
① 为什么使用石英砂作为酶的吸附剂?
② 如何证明α-淀粉酶已将淀粉水解?
③ 如何证明洗涤固定化酶的流出液中没有淀粉酶?
【实验目的】
1.制备固定化的α-淀粉酶
2.固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定
【材料用具】
α-淀粉酶溶液,0.5%淀粉溶液,石英砂,5mmol/L KI-I2溶液,蒸馏水 5ml 层析柱 50mL 烧杯, 250mL 烧杯,滴管,玻璃棒,点样板 铁架台
【实验步骤】
一、新制淀粉固定化酶
1.用50ml 小烧杯称取5g 石英砂,加入2ml α–淀粉酶溶液,浸泡10分钟,使α–淀粉酶固定到石英砂上。在等候期间可以先完成实验步骤“二”。
2.用10~15ml 的蒸馏水清洗石英砂后,取清洗液2滴加到点样板上,同时滴加0.5%淀粉溶液混匀,再加入1滴KI-I 2溶液,若溶液变为蓝色,说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已完全除去。反之,需要重复这一步骤。
3.固定有α–淀粉酶的石英砂装入层析柱,将酶柱固定在铁架台上,用滴管加0.5 % 淀粉溶液,使淀粉溶液约以10滴/ 分的流速过柱。
4.将5滴淀粉溶液加入1号点样孔,再滴加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(对照1)。将5滴清水加入2号点样孔,再滴加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(对照2)。
5.将流出的反应液每5滴按顺序加在3-12号点样孔中,再加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(待测样品)。记录实验结果。
6.实验后,用10倍柱体积的蒸馏水洗涤酶柱,放置在4℃冰箱中保存,几天后再重复上述实验,看是否有相同的结果。
二、检验其他班同学几天前制作的固定化酶的催化效果
【结果分析和实验结论】
1.本实验为什么要确定10滴/分的流速?加快流速是否能出现相同的结果?
2.石英砂是怎样固定α-淀粉酶的?你得出此结论的依据是什么?
3.本实验中对照1和对照2各有什么作用?
4.根据实验步骤二的结果,评价一下α-淀粉酶固定化酶的稳定性,并陈述你的理由。
实验结束时,请清理桌面。不要清洗用于固定淀粉酶的烧杯。凡是被发现水池中有石英砂的桌子,学号与该桌号相同的同学,将被扣减一定的分数。 【实验考核】 检查人:
【预习作业】
实验步骤
1.用50ml 小烧杯称取g 石英砂,加入 α–淀粉酶溶液,缓慢搅拌 分钟,使α–淀粉酶固定到 上。
2.用10~15ml 的蒸馏水清洗石英砂,取最后流出的清洗液滴加到点样板上,同时滴加 溶液混匀,再加入KI-I 2溶液,若溶液变为 色,说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已。
3.先把放入层析柱中,再装入固定有的石英砂;将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上,用滴管加 溶液,使淀粉溶液约以 的流速过柱。
4.取加入1-2滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(样品1)。此份样品的作用是做
5.接收流出的反应液至点样板小孔中,每滴加在一个孔中,再加入1滴。
【课后习题】
1.下列有关酶与一般化学催化剂共同特点的叙述中,不正确的是( ) A .用量少而催化效率高 B .改变了反应的平衡点 C .反应前后不发生变化 D .可降低反应的活化能
2.下列有关固定化酶优点的叙述中,不正确的是 ( ) A .由于固定化酶有一定的机械强度,易实现催化过程的连续化 B .不太容易从反应体系中有效的分离回收 C .固定化酶可反复使用 D .固定化酶的稳定性高
3.用唾液淀粉酶催化淀粉水解实验时,将唾液稀释十倍与用唾液原液实验效果基本相同,这说明酶具有 ( ) A .专一性 B .高效性 C .多样性 D .稳定性 4.酶是生物催化剂,与非生物催化剂相比,它具有的突出特性是( ) A .多样、专一、高效 B .只在细胞内起作用 C .化学本质属蛋白质 D .只能在核酸指导下合成
实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
高二年级 班 姓名 实验日期:____月 日 【知识准备】 1.背景知识
酶是生物体内各种化学反应的催化剂,它有高度的专一性和高效性。但酶在水溶液中很不稳定,且不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。将固定化酶装柱,当底物经过该柱时,在酶作用下转变为产物。 2.实验原理
本实验是采用吸附法制备固定化酶。
(1)使用的吸附剂是石英砂 ,石英砂是由天然矿石粉碎而成,它的化学成分是二氧化硅,其化学反应活性很低。
(2)使用的α-淀粉酶通常由枯草杆菌深层发酵制备,具有较强的液化淀粉的能力,可用于制备糊精,其最适pH5.5~7.5,最适温度50℃~75℃。 3.各种淀粉酶水解淀粉的反应如下:
α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精 ,淀粉溶液加入KI-I 2指示溶液时显现蓝色,而转变成糊精后显现红色。
将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱,使淀粉溶液流过柱,若柱的流出液在加入KI-I 2溶液时可看到溶液呈现红色,表明水解产物中有糊精。
α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后,酶的稳定性增加 ,包括酶对热的稳定性,对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。由于稳定性增加,保存期也相应延长,数日内酶活力不减。 4.思考题
① 为什么使用石英砂作为酶的吸附剂?
② 如何证明α-淀粉酶已将淀粉水解?
③ 如何证明洗涤固定化酶的流出液中没有淀粉酶?
【实验目的】
1.制备固定化的α-淀粉酶
2.固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定
【材料用具】
α-淀粉酶溶液,0.5%淀粉溶液,石英砂,5mmol/L KI-I2溶液,蒸馏水 5ml 层析柱 50mL 烧杯, 250mL 烧杯,滴管,玻璃棒,点样板 铁架台
【实验步骤】
一、新制淀粉固定化酶
1.用50ml 小烧杯称取5g 石英砂,加入2ml α–淀粉酶溶液,浸泡10分钟,使α–淀粉酶固定到石英砂上。在等候期间可以先完成实验步骤“二”。
2.用10~15ml 的蒸馏水清洗石英砂后,取清洗液2滴加到点样板上,同时滴加0.5%淀粉溶液混匀,再加入1滴KI-I 2溶液,若溶液变为蓝色,说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已完全除去。反之,需要重复这一步骤。
3.固定有α–淀粉酶的石英砂装入层析柱,将酶柱固定在铁架台上,用滴管加0.5 % 淀粉溶液,使淀粉溶液约以10滴/ 分的流速过柱。
4.将5滴淀粉溶液加入1号点样孔,再滴加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(对照1)。将5滴清水加入2号点样孔,再滴加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(对照2)。
5.将流出的反应液每5滴按顺序加在3-12号点样孔中,再加1滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(待测样品)。记录实验结果。
6.实验后,用10倍柱体积的蒸馏水洗涤酶柱,放置在4℃冰箱中保存,几天后再重复上述实验,看是否有相同的结果。
二、检验其他班同学几天前制作的固定化酶的催化效果
【结果分析和实验结论】
1.本实验为什么要确定10滴/分的流速?加快流速是否能出现相同的结果?
2.石英砂是怎样固定α-淀粉酶的?你得出此结论的依据是什么?
3.本实验中对照1和对照2各有什么作用?
4.根据实验步骤二的结果,评价一下α-淀粉酶固定化酶的稳定性,并陈述你的理由。
实验结束时,请清理桌面。不要清洗用于固定淀粉酶的烧杯。凡是被发现水池中有石英砂的桌子,学号与该桌号相同的同学,将被扣减一定的分数。 【实验考核】 检查人:
【预习作业】
实验步骤
1.用50ml 小烧杯称取g 石英砂,加入 α–淀粉酶溶液,缓慢搅拌 分钟,使α–淀粉酶固定到 上。
2.用10~15ml 的蒸馏水清洗石英砂,取最后流出的清洗液滴加到点样板上,同时滴加 溶液混匀,再加入KI-I 2溶液,若溶液变为 色,说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已。
3.先把放入层析柱中,再装入固定有的石英砂;将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上,用滴管加 溶液,使淀粉溶液约以 的流速过柱。
4.取加入1-2滴KI-I 2溶液,观察颜色变化(样品1)。此份样品的作用是做
5.接收流出的反应液至点样板小孔中,每滴加在一个孔中,再加入1滴。
【课后习题】
1.下列有关酶与一般化学催化剂共同特点的叙述中,不正确的是( ) A .用量少而催化效率高 B .改变了反应的平衡点 C .反应前后不发生变化 D .可降低反应的活化能
2.下列有关固定化酶优点的叙述中,不正确的是 ( ) A .由于固定化酶有一定的机械强度,易实现催化过程的连续化 B .不太容易从反应体系中有效的分离回收 C .固定化酶可反复使用 D .固定化酶的稳定性高
3.用唾液淀粉酶催化淀粉水解实验时,将唾液稀释十倍与用唾液原液实验效果基本相同,这说明酶具有 ( ) A .专一性 B .高效性 C .多样性 D .稳定性 4.酶是生物催化剂,与非生物催化剂相比,它具有的突出特性是( ) A .多样、专一、高效 B .只在细胞内起作用 C .化学本质属蛋白质 D .只能在核酸指导下合成