蛋白质组学相关技术的研究进展
生物111班 2号 邬龙祺
摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。
关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学
2001年人类基因草图正式发表并于2003年4月最终完成。随着人类基因组计划的实施和发展，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的中心任务是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学。近几年来，人们对蛋白质组学的认识日益加深，对蛋白质组学的研究也取得了不错的进展，尤其是其研究技术方面取得了空前硕果，而这些成果，必将对人类健康水平的提高产生深源的影响。
一、概念及相关内容
随着人类基因组测序计划的完成，生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究，并产生了一门新的学科——蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Williams[1]最早提出的，是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同，它着重于全面性和整体性，研究的对象不是单一或少数的蛋白质，而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者——蛋白质水平。蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务。
二、蛋白质组研究的主要技术
相对于基因组的研究，蛋白质组的研究相对滞后，主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类，一类是蛋白质组的分离技术，包括双向电泳、双向高效柱层析等；另一类是蛋白质组的鉴定技术，包括质谱技术、生物信息技术等，其核心是质谱技术。由于，蛋白质的研究和发现是不断进步的，对于数据的储存处理是生物信息学成为蛋白质组的又一大研究技术。
1、蛋白质组的分离技术
1.1双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法之一。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率高和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。
双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽
指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。
根据第一项等电聚焦条件和方式的不同，可将双向电泳分为三种系统。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行，载体两性电解质（Carrier ampholyt ）在外加电场的作用下形成梯度，这一系统被称为ISO-DALT 。它的最大缺点是不稳定，易发生阴极漂移。第二种系统称为IPG-DALT ，主要是采用丙烯酰胺和不同PH 值的固定化电解质共聚所形成的具有PH 梯度的IPG 胶。第三种系统是非平衡PH 梯度电泳，常常被用来分离碱性蛋白。
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点的显色，显色重现性好，容易操作，但灵敏度较低；银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的显色，灵敏度较考马斯亮蓝染色法高两个数量级，最低检测限可达0.1ng ，但该法重现性较差，显色的浅性范围较窄；放射性检测方法灵敏度很高，但若不及时使用磷光成像分析技术，则耗时过长；使用荧光试剂染色相对来说灵敏度较高，线性范围宽，且可以实现不同蛋白表达样品在同一块凝胶板上进行显色，克服了方法重现性差的弱点，同时减少了对质谱鉴定的影响。
1.2差异凝胶电泳
为改进双向电泳的重复性和灵敏度，最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术(DIGE)，即差异凝胶电泳。传统的双向电泳胶间差异大，甚至难于区分系统误差还是样品间的表达差异，难以进行蛋白质差异研究。Ettan DIGE 荧光差异凝胶电泳技术在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法，可在同一块胶上同时分离多个分别由不同荧光标记的样品。由于不同的荧光标记样品有不同的激发波长，可通过不同的滤光片记录互不干扰的胶图结果。由于有了多色荧光标记，使得在同一块胶中分离并分析多个样本成为可能。这样有效避免了不同胶间的系统误差，特别适合比较不同样本间差异。
1.3色谱分离技术
色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之问不同的分配系数，使其在相对运动着的两相问经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法(Gas Chromatography，GC) 和液相色谱法(Liquid Chromatography，LC) 两种，而其中的Lc 是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。
多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特的液相分离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具
[2]有快速、高通量、自动化、重复性好等优点。常见的多维液相分离系统有二维液相色
谱(Two-dimensional Liquid Chromatography ，2D-LC) 、二维毛细管电泳(Two-dimensional Capillary Electrophoresis ，2D-CE) 、液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。Nielsen 等应用LC-MS/MS技术成功分离和鉴定了海马组织中的1685种蛋白质[3]。
毛细管电泳(CE)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，CE 由于其侧面 截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数/m以上。CE 在蛋白质组分析中用于蛋白
质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。CE 在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质
1.4同位素包被亲和标记（ICAT ）
ICAT 是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准， 与另一状态的蛋白混合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用LC-MC 分析或用LC-MC/MC直接由蛋白序列信息来确定蛋白。这一技术克服了2DGE 的缺点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组" 可以精确检测疏水的膜蛋白、PI 和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序列使它的分析范围远大于2DEG [4]。有人用这一方法精确鉴定了体外和自然状态下分化的人HL60细胞微粒体片段中491个蛋白及其相对量，其中大部分是膜或膜相关蛋白。ICAT 在定量及差异表达检测上有巨大的优势，但也面临一些问题。ICAT 最大的挑战在于样品高度复杂，质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足。但随着ICAT 技术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。
2、蛋白质组鉴定技术
2.1质谱技术
其原理是对2DE 所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman 降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。它需要三个步骤，首先通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比（m/z）的不同进行分离，最后转化到离子检测装置[5]。目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱(MALDI)和电子喷射离子化质谱(ESI)。MALDI 通常与飞行时间质谱(TOF)相结合。TOF 主要用来测量分析物飞过固定的路径所需的时间。另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱(MS/MS)。在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息。
质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序N 末端封闭或共价修饰肽段的方法。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[6]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[7]，在一些情况下，仅需10-15 fmol 的蛋白，这对鉴别蛋白是很有用的，特别是在只能得到极少量蛋白的情况下[7，8]。在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与Edeman 微测序技术相结合，MALDI 质谱与纳米电子喷射质谱相结合，这些技术相互互补，为分析2DE 所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。
2.2表面等离子共振技术(SPR)
SPR 是研究蛋白质相互作用的新技术，其原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时反射光强度最小时的入射角SPR 角[9]。与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵”蛋白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面加入“猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR 角的改变来反映“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作用。SPR 技术因其高效灵敏、无需额外标记等优势，广泛应用于蛋白检测和蛋白(蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布、结合动力学及浓度变化等功能信
息，为蛋白质组研究开辟了全新的模式。细胞粗提液或上清液中存在未知配体，配体垂钓可以筛选并确定新配体。目前，此技术己广泛应于蛋白质组学、细胞信号传导、受体/配体、抗体/抗原分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域。
2.3串联亲和纯化（TAP)
TAP 是由德国和法国的两家实验室开发出的一套研究蛋白质生理条件下相互作用的新方法。TAP 技术可以说是在研究蛋白质相互作用的方法学上获得了巨大的突破， 其基本原理是在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记【主要由蛋白A 的IgG 结合区(ProtA)和钙调蛋白结合区(CBP)构成，中间被一个TEV 蛋白酶的酶切位点隔开】。经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与目标蛋白发生真实作用的蛋白质便可被洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Edman 降解法进行鉴定。该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点，既吸收了经典亲和纯化可以得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体，也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用。可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质。目前，TAP 技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上已成为可能。
2.4蛋白质芯片
蛋白质芯片或称蛋白质微阵列，有几种形式一种形式称为“捕获蛋白质芯片”，捕获表面矩阵点的直径为1-2mm ，捕获表面可以有疏水的、亲水的、阳离子的或阴离子的层析支持物，小量的蛋白质标本直接加在捕获表面。洗涤去除了非特异结合蛋白质后，表面捕获的蛋白质应用飞行时间质谱进行分析， 就得到了基于不同相互作用的多维蛋白质图谱。这种技术称为表面加强的激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS ）方法，这种方法能够获得可重复的、统一的质谱图，因而可用于定量蛋白质研究，是目前国外进行蛋白质测定所使用的最多的方法。在乳腺癌的研究中SELDI-TOF 被寄予厚望，能补充mRNA 分析，并且在蛋白质水平和翻译后修饰方面能提供关键信息。
另一种称为靶蛋白芯片，其原理与cDNA 微阵列相似，是将特殊的蛋白分子如抗体排列于载体表面，作为探针检测相应的靶和相关的复合物，既可以用于研究蛋白质图谱，也可以用于检查不同蛋白质之间、 蛋白质和DNA 片段之间、蛋白质和RNA 分子之间的相互作用。靶蛋白芯片的典型代表是抗体微阵列，在卵巢癌的研究中，此芯片对血清蛋白质表达类型的敏感性达到100%，特异性达98%，此芯片也用于检测膀胱移行细胞癌蛋白质标志物、寻找胰腺癌标志物[10]。
2.5酵母双杂交系统
酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular)， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成， 其中有DNA 结合结构域(DB)和转录激活结构域(AD)， 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB 虽然能和启动子结合， 但是不能激活转录，而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白具有激活转录的功能。DB 与AB 分别能与多肽X 和Y 结合，由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在X 和Y 之间存在相互作用， 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能形成有活性的转录激活因子， 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene) 。 通过对报道基
因表达产物的检测， 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用[11]。用酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用通常会存在假阳性或假阴性的问题，已有许多学者对此系统进行了改进，并且将其扩展到检测DNA-蛋白质，RNA-蛋白质，小分子-蛋白质之间的相互作用上[12]。
2.6生物信息学
生物信息学是以生物大分子为研究目标，辅以计算机为工具，运用信息学和数学理论方法来研究生命现象，通过对生物大分子信息的获取、加工、分类、检索、分析与比较，最终获得其生物学意义的一门科学和研究方法。可用于寻找蛋白质家族保守序列，并可对蛋白质高级结构进行预测，是蛋白质组学的重要组成部分。
目前，生物信息学在蛋白质组学方面的应用主要有：构建与分析双向凝胶电泳图谱；数据库的建立和搜索；蛋白质结构的预测；各种分析及检索软件的开发与应用。这些都大大提高了蛋白质组学的研究效率。功能蛋白质组学将2-DE 图谱通过因特网对现有的蛋白质数据库进行检索，以识别蛋白质、描述其理化性质并预测可能的翻译后调节方式、三维结构与功能等，蛋白质数据库的主要代表是由瑞是生物信息学研究所和欧洲生物信息学研究所共同维护的SWISSPORT 数据库等。
三、展望
在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。
在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之
一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。
在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。
参考文献： 【1】Pandey A，Mann M，Proteomics to study genes and genomes[J]，Nature ，2000 Jun 15，405：837-46。
【2】snlyth W F ，Brooks P ，A critical evaluation of HPLC-ESI-MS and CE-ESI-MS for the detection and determination of small molecules of significancein clinical andforensic science[J]，Electrophoress ，2OO4，25:l413-l446。
【3】Nielsen P A ，Olscn J V ，Pedtel~nlkov A V ，Andersen J R ，Mann M ，Wisniewski J R ．Proteoraic mapping of brain plasma membrane proteins[J]，Md Cell Proteomlcs ，2005，4：402-408。
【4】Hu S，Dovichi N J，Capillary dectrophoresis for the analysis of biapolymers[J]，Ana2 Chem，20O2，74：2833-2850。
【5】Figeys D ，McBroom LD ，Moran MF ，Masss Spectry for the Study of Protein Interactions ，Methods ，2001，24：230-239。
【6】Hall SC，Smith DM，Masiarz FR，et al.Mass spectrometric and Edman sequencing of lipocortin I isolated by two-dimensional SDS/PAGE of human melanoma lysates，Proc Natl Acad Sci USA，1993 Mar 1，90:1927-1931。
【7】Perrot M，Saglicocco F，Mini T，et al.Two-dimensional gel protein database of Saccharomyces cerevisiae，Electrophoresis ，1999，20：2280-98。
【8】Clauser KR, Hall SC, Smith DM, et al.Rapid mass spectrometric ·peptide sequencing and mass mathing for characterization of human melanoma proteins isolated by two-dimensional PAGE ，Proc Natl Acad Sci ，1995 May 23，92：5072-5076。
【9】Wilson W ，Analyzing biomolecular interactions[J]，Scirnce ，2002，295：2103-2105。
【10】Petriconin EF ，Ardekani AM ，Hitt BA ，et al.Use of proteomics patterns in serum to identify ovarian cancer[J]，Lancet ，2002，359：572-577。
【11】Legrain P，Selig L，Genome-wide protein interaction maps using two-hybrid systems，FEBS letters，2000，0：32-36。
【12】Vidal M，Legrain P，Yeast forward and reverse‘n ’-hybrid systems，Nucleic Acids Research，1999，27：919-929。
蛋白质组学相关技术的研究进展
生物111班 2号 邬龙祺
摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。
关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学
2001年人类基因草图正式发表并于2003年4月最终完成。随着人类基因组计划的实施和发展，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的中心任务是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学。近几年来，人们对蛋白质组学的认识日益加深，对蛋白质组学的研究也取得了不错的进展，尤其是其研究技术方面取得了空前硕果，而这些成果，必将对人类健康水平的提高产生深源的影响。
一、概念及相关内容
随着人类基因组测序计划的完成，生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究，并产生了一门新的学科——蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Williams[1]最早提出的，是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同，它着重于全面性和整体性，研究的对象不是单一或少数的蛋白质，而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者——蛋白质水平。蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务。
二、蛋白质组研究的主要技术
相对于基因组的研究，蛋白质组的研究相对滞后，主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类，一类是蛋白质组的分离技术，包括双向电泳、双向高效柱层析等；另一类是蛋白质组的鉴定技术，包括质谱技术、生物信息技术等，其核心是质谱技术。由于，蛋白质的研究和发现是不断进步的，对于数据的储存处理是生物信息学成为蛋白质组的又一大研究技术。
1、蛋白质组的分离技术
1.1双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法之一。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率高和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。
双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽
指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。
根据第一项等电聚焦条件和方式的不同，可将双向电泳分为三种系统。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行，载体两性电解质（Carrier ampholyt ）在外加电场的作用下形成梯度，这一系统被称为ISO-DALT 。它的最大缺点是不稳定，易发生阴极漂移。第二种系统称为IPG-DALT ，主要是采用丙烯酰胺和不同PH 值的固定化电解质共聚所形成的具有PH 梯度的IPG 胶。第三种系统是非平衡PH 梯度电泳，常常被用来分离碱性蛋白。
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点的显色，显色重现性好，容易操作，但灵敏度较低；银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的显色，灵敏度较考马斯亮蓝染色法高两个数量级，最低检测限可达0.1ng ，但该法重现性较差，显色的浅性范围较窄；放射性检测方法灵敏度很高，但若不及时使用磷光成像分析技术，则耗时过长；使用荧光试剂染色相对来说灵敏度较高，线性范围宽，且可以实现不同蛋白表达样品在同一块凝胶板上进行显色，克服了方法重现性差的弱点，同时减少了对质谱鉴定的影响。
1.2差异凝胶电泳
为改进双向电泳的重复性和灵敏度，最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术(DIGE)，即差异凝胶电泳。传统的双向电泳胶间差异大，甚至难于区分系统误差还是样品间的表达差异，难以进行蛋白质差异研究。Ettan DIGE 荧光差异凝胶电泳技术在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法，可在同一块胶上同时分离多个分别由不同荧光标记的样品。由于不同的荧光标记样品有不同的激发波长，可通过不同的滤光片记录互不干扰的胶图结果。由于有了多色荧光标记，使得在同一块胶中分离并分析多个样本成为可能。这样有效避免了不同胶间的系统误差，特别适合比较不同样本间差异。
1.3色谱分离技术
色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之问不同的分配系数，使其在相对运动着的两相问经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法(Gas Chromatography，GC) 和液相色谱法(Liquid Chromatography，LC) 两种，而其中的Lc 是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。
多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特的液相分离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具
[2]有快速、高通量、自动化、重复性好等优点。常见的多维液相分离系统有二维液相色
谱(Two-dimensional Liquid Chromatography ，2D-LC) 、二维毛细管电泳(Two-dimensional Capillary Electrophoresis ，2D-CE) 、液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。Nielsen 等应用LC-MS/MS技术成功分离和鉴定了海马组织中的1685种蛋白质[3]。
毛细管电泳(CE)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，CE 由于其侧面 截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数/m以上。CE 在蛋白质组分析中用于蛋白
质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。CE 在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质
1.4同位素包被亲和标记（ICAT ）
ICAT 是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准， 与另一状态的蛋白混合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用LC-MC 分析或用LC-MC/MC直接由蛋白序列信息来确定蛋白。这一技术克服了2DGE 的缺点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组" 可以精确检测疏水的膜蛋白、PI 和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序列使它的分析范围远大于2DEG [4]。有人用这一方法精确鉴定了体外和自然状态下分化的人HL60细胞微粒体片段中491个蛋白及其相对量，其中大部分是膜或膜相关蛋白。ICAT 在定量及差异表达检测上有巨大的优势，但也面临一些问题。ICAT 最大的挑战在于样品高度复杂，质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足。但随着ICAT 技术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。
2、蛋白质组鉴定技术
2.1质谱技术
其原理是对2DE 所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman 降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。它需要三个步骤，首先通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比（m/z）的不同进行分离，最后转化到离子检测装置[5]。目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱(MALDI)和电子喷射离子化质谱(ESI)。MALDI 通常与飞行时间质谱(TOF)相结合。TOF 主要用来测量分析物飞过固定的路径所需的时间。另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱(MS/MS)。在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息。
质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序N 末端封闭或共价修饰肽段的方法。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[6]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[7]，在一些情况下，仅需10-15 fmol 的蛋白，这对鉴别蛋白是很有用的，特别是在只能得到极少量蛋白的情况下[7，8]。在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与Edeman 微测序技术相结合，MALDI 质谱与纳米电子喷射质谱相结合，这些技术相互互补，为分析2DE 所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。
2.2表面等离子共振技术(SPR)
SPR 是研究蛋白质相互作用的新技术，其原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时反射光强度最小时的入射角SPR 角[9]。与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵”蛋白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面加入“猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR 角的改变来反映“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作用。SPR 技术因其高效灵敏、无需额外标记等优势，广泛应用于蛋白检测和蛋白(蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布、结合动力学及浓度变化等功能信
息，为蛋白质组研究开辟了全新的模式。细胞粗提液或上清液中存在未知配体，配体垂钓可以筛选并确定新配体。目前，此技术己广泛应于蛋白质组学、细胞信号传导、受体/配体、抗体/抗原分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域。
2.3串联亲和纯化（TAP)
TAP 是由德国和法国的两家实验室开发出的一套研究蛋白质生理条件下相互作用的新方法。TAP 技术可以说是在研究蛋白质相互作用的方法学上获得了巨大的突破， 其基本原理是在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记【主要由蛋白A 的IgG 结合区(ProtA)和钙调蛋白结合区(CBP)构成，中间被一个TEV 蛋白酶的酶切位点隔开】。经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与目标蛋白发生真实作用的蛋白质便可被洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Edman 降解法进行鉴定。该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点，既吸收了经典亲和纯化可以得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体，也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用。可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质。目前，TAP 技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上已成为可能。
2.4蛋白质芯片
蛋白质芯片或称蛋白质微阵列，有几种形式一种形式称为“捕获蛋白质芯片”，捕获表面矩阵点的直径为1-2mm ，捕获表面可以有疏水的、亲水的、阳离子的或阴离子的层析支持物，小量的蛋白质标本直接加在捕获表面。洗涤去除了非特异结合蛋白质后，表面捕获的蛋白质应用飞行时间质谱进行分析， 就得到了基于不同相互作用的多维蛋白质图谱。这种技术称为表面加强的激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS ）方法，这种方法能够获得可重复的、统一的质谱图，因而可用于定量蛋白质研究，是目前国外进行蛋白质测定所使用的最多的方法。在乳腺癌的研究中SELDI-TOF 被寄予厚望，能补充mRNA 分析，并且在蛋白质水平和翻译后修饰方面能提供关键信息。
另一种称为靶蛋白芯片，其原理与cDNA 微阵列相似，是将特殊的蛋白分子如抗体排列于载体表面，作为探针检测相应的靶和相关的复合物，既可以用于研究蛋白质图谱，也可以用于检查不同蛋白质之间、 蛋白质和DNA 片段之间、蛋白质和RNA 分子之间的相互作用。靶蛋白芯片的典型代表是抗体微阵列，在卵巢癌的研究中，此芯片对血清蛋白质表达类型的敏感性达到100%，特异性达98%，此芯片也用于检测膀胱移行细胞癌蛋白质标志物、寻找胰腺癌标志物[10]。
2.5酵母双杂交系统
酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular)， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成， 其中有DNA 结合结构域(DB)和转录激活结构域(AD)， 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB 虽然能和启动子结合， 但是不能激活转录，而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白具有激活转录的功能。DB 与AB 分别能与多肽X 和Y 结合，由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在X 和Y 之间存在相互作用， 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能形成有活性的转录激活因子， 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene) 。 通过对报道基
因表达产物的检测， 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用[11]。用酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用通常会存在假阳性或假阴性的问题，已有许多学者对此系统进行了改进，并且将其扩展到检测DNA-蛋白质，RNA-蛋白质，小分子-蛋白质之间的相互作用上[12]。
2.6生物信息学
生物信息学是以生物大分子为研究目标，辅以计算机为工具，运用信息学和数学理论方法来研究生命现象，通过对生物大分子信息的获取、加工、分类、检索、分析与比较，最终获得其生物学意义的一门科学和研究方法。可用于寻找蛋白质家族保守序列，并可对蛋白质高级结构进行预测，是蛋白质组学的重要组成部分。
目前，生物信息学在蛋白质组学方面的应用主要有：构建与分析双向凝胶电泳图谱；数据库的建立和搜索；蛋白质结构的预测；各种分析及检索软件的开发与应用。这些都大大提高了蛋白质组学的研究效率。功能蛋白质组学将2-DE 图谱通过因特网对现有的蛋白质数据库进行检索，以识别蛋白质、描述其理化性质并预测可能的翻译后调节方式、三维结构与功能等，蛋白质数据库的主要代表是由瑞是生物信息学研究所和欧洲生物信息学研究所共同维护的SWISSPORT 数据库等。
三、展望
在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。
在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之
一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。
在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。
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