溶菌酶的工程改造及其应用
摘要：溶菌酶普遍存在于动物、植物和微生物中。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白, 长期以来一直被作为一种“模型”体系, 用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。介绍了溶菌酶的来源、结构、性质、作用机制。并对近年来其在食品工业、医学和酶工程中的应用进行了综述; 分析了溶菌酶应用中存在的主要问题, 并对其应用前景进行了展望。
关键词：溶菌酶、工程改造、应用
溶菌酶( lysozyme) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 又称胞壁质酶( muram-i dase) 。人们对溶菌酶的研究始于上世纪初, 英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6 年( 1922 年) 发现人的唾液、 眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶, 因其具有溶菌作用, 故命名为溶菌酶。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织, 且本身无毒无害, 因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂, 将可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在我国, 溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,因此溶菌酶的功能特性需要一些改善，其中主要是抗菌范围的扩大和热稳定性的提高。
一、溶菌酶的结构与性质
在过去很长一段时间中, 溶菌酶一直被当作一种研究蛋白质空间构象、酶动力学及分子进化的理想模型。其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究进展都是利用溶菌酶获得的[ 1]。溶菌酶是一种葡萄糖苷酶, 其化学性质稳定, 干燥条件下在室温可长期保存, 其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末, 无嗅, 味甜, 易溶于水, 不溶于丙酮、乙醚。其中鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，它由18种129 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质， 在分子中的4对含硫氨基酸Cys 间形成4个S-S 键。Phillips 等人1965 年用x 射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构, 溶菌酶分子近椭圆形, 大小为4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm, 其构象复杂, α螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构, 研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的, 疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用, 其分子表面有一个容纳多糖底物6 个单糖的裂隙, 这是溶菌酶的活性部位【2】
二、溶菌酶的功能
2．1溶菌酶的抑菌作用
溶菌酶具有广泛的抑菌谱。蛋清溶菌酶能分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等许多革兰氏阳性菌。不同来源的溶菌酶的抑菌谱不同。杨向科等通过实验研究表明， 海洋微生物溶菌酶对多种鸡蛋蛋清溶菌酶不能直接作用的微生物如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、
变形链球菌等都有溶菌作用； 并且海洋微生物溶菌酶对一些革兰氏阴性菌也具有明显的抑制作用［3］。W.H.Holzapfel等推测革兰氏阴性菌可能拥有一层外膜能保护细胞免遭蛋清溶菌酶作用， 这层膜可以被螯合剂EDTA 破坏从而使细菌对溶菌酶敏感；Morrison 等认为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖对蛋清溶菌酶有很强的亲和性，从而阻止溶菌酶的渗透， 使蛋清溶菌酶不能分解革兰氏阴性菌。不同来源的溶菌酶的酶学性质也有很大差别，人溶菌活性比鸡蛋溶菌酶高3 倍， 而植物溶菌活性比鸡蛋溶菌酶低。微生物产生的溶菌酶通常是几种相关酶的混合物，由于彼此间的协同作用使其对细菌细胞壁的溶解能力增强［4］。在溶菌酶上连接疏水基团能明显扩大其抑菌谱，增强对革兰氏阴性菌的抑制作用，并随配基疏水能力的增强而增强，但对革兰氏阳性菌的抑制作用减弱［5］。
溶菌酶还具有抗炎消肿和增强免疫力的作用。肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成成分, 溶菌酶可水解肽聚糖中N- 乙酰胞壁酸( NAM)和N- 乙酰葡萄糖胺( NAG) 中的B- 1, 4 糖苷键, 在渗透压作用下导致革兰阳性菌细胞壁破裂, 发生溶菌作用[ 6]. 溶菌酶水解细胞壁时所释放的肽聚糖碎片是合成与分泌各种抗菌蛋白包括溶菌酶的诱导物，溶 菌酶可清除其它抗菌因子作用后所残余的细菌细胞壁并增强其它免疫因子的抗菌敏感性， 协同抵制外来病原的入侵[7]。溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用。小儿急性鼻窦炎是一种与病毒、细菌感染、免疫功能异常及遗传因素等有密 切关系的疾病。柴向华等通过向小儿急性鼻窦炎患者处方药中添加溶
菌酶来研究溶菌酶的功效时发现， 服用溶菌酶的患儿的治愈时间明显短于未服溶菌酶的患儿，证明溶菌酶能明显增强机体免疫力[8]。
2.2溶菌酶的抑菌机制
目前已知的几种溶菌酶有: 内- N - 乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β- 1, 3、β- 1, 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰 壳多糖酶[ 9] 。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N - 乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β-1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键, 使糖苷键断裂, 破坏细胞壁的分子结构, 而酰胺酶等则主要作用于多肽, 使多肽断裂。以内- N - 乙酰己糖胺酶为例, 内- N - 乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N - 乙酰胞壁酸( NAM )与N - 乙酰葡萄糖氨( NAG) 之间的β- 1, 4糖苷键, 使肽聚糖分子发生断裂, 使细胞壁内外两侧渗透压失衡, 造成细胞破裂, 导致微生物因细胞壁溶解而被杀死[ 10] 。溶菌酶对革兰氏阳性菌(G+ ) 细胞与革兰氏阴性菌( G- ) 的溶菌作用,由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差异,G+ 细胞壁含80%肽聚糖, 而G- 细胞壁只有在内壁层含有少量肽聚糖, 因此, 溶菌酶能有效杀死G+ 菌, 而对G- 细胞破坏很小。
三、溶菌酶的工程改造
溶菌酶是一种比较稳定的蛋白质, 通过下列措施可以进一步改善溶菌酶的功能特性。
3.1抗菌范围的扩大
溶菌酶能快速有效的催化细菌细胞壁中肽聚糖的水解，因而被广泛用
于消炎药中，但溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对绝大多数的革兰氏阴性菌不显示抗菌效果。因为革兰氏阴性菌的细胞外膜能阻碍溶菌酶接触其底物肽聚糖。采用有效的手段提高溶菌酶突破外膜障碍接触肽聚糖，则有可能把溶菌酶的抗菌范围扩大到革兰氏阴性菌。 Kato等证实在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段或在多肽链的侧链上引进糖基可有效扩大溶菌酶的抗菌能力【11】
3.2热稳定性的提高
3.2.1六环水可以提高溶菌酶的热稳定性
赵林等的研究表明[12], 水经低温超声定频谱振后, 大多数呈六环和六笼形水分子簇存在。这种水在生物蛋白、核酸、细胞与组织活动中起到重要作用。经DSC法实验证明, 用六环水合溶菌酶时, 每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数258 个增加了150 个, 达到408 个, 相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6 个水分子, 这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六笼形的动态氢键网络, 这种六笼形机构具有最为稳定的结构能。结构水物化特性的改变有助 于溶菌酶中疏水相互作用力的加强, 溶菌酶周围有序的结合水量和水化层强度增加, 从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力, 因此增加了溶菌酶的稳定性。
3.2.2定点突变改变溶菌酶的稳定性
Song 等[13] 在鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白产生突变体I55T 和D66H的基础上, 应用定点突变构建了具有在49 位用门冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信号序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉样蛋白生产突变体
于消炎药中，但溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对绝大多数的革兰氏阴性菌不显示抗菌效果。因为革兰氏阴性菌的细胞外膜能阻碍溶菌酶接触其底物肽聚糖。采用有效的手段提高溶菌酶突破外膜障碍接触肽聚糖，则有可能把溶菌酶的抗菌范围扩大到革兰氏阴性菌。 Kato等证实在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段或在多肽链的侧链上引进糖基可有效扩大溶菌酶的抗菌能力【11】
3.2热稳定性的提高
3.2.1六环水可以提高溶菌酶的热稳定性
赵林等的研究表明[12], 水经低温超声定频谱振后, 大多数呈六环和六笼形水分子簇存在。这种水在生物蛋白、核酸、细胞与组织活动中起到重要作用。经DSC法实验证明, 用六环水合溶菌酶时, 每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数258 个增加了150 个, 达到408 个, 相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6 个水分子, 这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六笼形的动态氢键网络, 这种六笼形机构具有最为稳定的结构能。结构水物化特性的改变有助 于溶菌酶中疏水相互作用力的加强, 溶菌酶周围有序的结合水量和水化层强度增加, 从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力, 因此增加了溶菌酶的稳定性。
3.2.2定点突变改变溶菌酶的稳定性
Song 等[13] 在鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白产生突变体I55T 和D66H的基础上, 应用定点突变构建了具有在49 位用门冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信号序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉样蛋白生产突变体
( I55TPG49N, D66HPG49N) , 这些糖基化突变体比非糖基化突变体在酵母表达系统S . cerevisiae 的分泌大大增加, 糖基化突变体在37 e 、pH7. 4 条件下, 仍保持40% 的酶活性, 而非糖基化突变体在同样条件下最后失去全部活性, 说明糖基化链能掩蔽淀粉样蛋白生产的溶菌酶分子的B- 折叠, 增加了淀粉样蛋白生产的溶菌酶的稳定性。
四、溶菌酶的应用
4.1溶菌酶在食品工业中的应用
溶菌酶对牛奶中革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等作用非常强。由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬间杀菌奶， 其方法为在包装前添加或在杀菌前添加。每吨牛奶加入0.05～0.1mg 溶菌酶，37℃保温3h，可使牛奶中双歧杆菌的含量与人奶无显著差别， 从而保证婴儿肠道内双歧杆菌的良好增殖。在半硬干酪中加入0.001%的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，同时能阻止由于厌氧孢子增殖体（如酪梭杆菌）的作用所引起的胀气等[14]。张德权等选取Nisin、溶菌酶、乳酸钠、茶多酚、壳聚糖等5 种天然保鲜剂对冷却羊肉进行保鲜处理， 结果发现溶菌酶的保鲜效果优于乳酸钠、茶多酚、壳聚糖[15]。在低度酒中添加溶菌酶不仅对酒的风味无任何不良影响, 还可防止产酸菌生长, 是低度酒良好的防腐剂。在日本清酒中大部分微生物不能生存, 但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长, 并产酸使酒发臭, 添加溶菌酶后火落菌被有效抑制, 成功代替水杨酸作防腐剂用于清酒中[ 16] 。倪瑛等[ 17] 报道, 向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶,可以大大减少SO2 的使用量,
减小了SO2 使用过多可能对人体造成的毒害作用。此外, 溶菌酶还 可以添加到果汁中作为防腐剂使用。
4.2在医疗中的应用
溶菌酶对G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用, 对大肠杆菌、普通变球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳, 因而, 溶菌酶广泛应用于医药行业, 如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症, 尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显
[18]。戴清源等[19]报道, 正常情况下, 人体尿液中一般只存在少量溶菌酶, 因此测量尿中溶菌酶含量, 有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时, 烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍, 也可在尿液中检出, 有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。
4.3在畜禽饲料中的应用
溶菌酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用; 对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一 定的杀灭作用; 与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用, 具有良好的防腐作用。在饲料中添加溶菌酶可防止霉变,延长饲料的贮存期, 减少不必要损耗[ 20]。沈彦萍等[21]报道, 溶菌酶对防治仔猪腹泻有显著作 用, 可达到抗生素的使用效果, 治愈率达80%以上。溶菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系, 体内溶菌酶主要来自嗜中性白细胞、单核细胞及吞噬细胞溶酶体, 可进入机体补体系统并增强抗体活性, 从而杀灭有害微生物。
五、展望
由于溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、无毒性、无残留、无污染的特点, 因此, 可广泛应用于食品添加剂、饲料防腐剂、医疗等方面。但是它也存在抗菌谱窄、提取造价高等问题, 所以如何开发出抗菌谱广、稳定性高、价格低廉的产品, 是未来一段时间需要深入研究的问题。尽管我国对溶菌酶开发应用十分有限, 但随着科学技术的不断发展和人民生活水平的不断提高, 人们对食品和医药的安全性要求会越来越高, 这势必会促进科学工作者致力于进一步研发天然溶菌酶。
参考文献：
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[ 13] Youtao Song, et al. In vivo glycosylation suppresses the aggration of amyloidogenic hen egg white lysozymes expressed in yeast. FEBS Letters.2001, 491: 63- 66.
溶菌酶的工程改造及其应用
摘要：溶菌酶普遍存在于动物、植物和微生物中。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白, 长期以来一直被作为一种“模型”体系, 用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。介绍了溶菌酶的来源、结构、性质、作用机制。并对近年来其在食品工业、医学和酶工程中的应用进行了综述; 分析了溶菌酶应用中存在的主要问题, 并对其应用前景进行了展望。
关键词：溶菌酶、工程改造、应用
溶菌酶( lysozyme) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 又称胞壁质酶( muram-i dase) 。人们对溶菌酶的研究始于上世纪初, 英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6 年( 1922 年) 发现人的唾液、 眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶, 因其具有溶菌作用, 故命名为溶菌酶。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织, 且本身无毒无害, 因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂, 将可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在我国, 溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,因此溶菌酶的功能特性需要一些改善，其中主要是抗菌范围的扩大和热稳定性的提高。
一、溶菌酶的结构与性质
在过去很长一段时间中, 溶菌酶一直被当作一种研究蛋白质空间构象、酶动力学及分子进化的理想模型。其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究进展都是利用溶菌酶获得的[ 1]。溶菌酶是一种葡萄糖苷酶, 其化学性质稳定, 干燥条件下在室温可长期保存, 其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末, 无嗅, 味甜, 易溶于水, 不溶于丙酮、乙醚。其中鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，它由18种129 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质， 在分子中的4对含硫氨基酸Cys 间形成4个S-S 键。Phillips 等人1965 年用x 射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构, 溶菌酶分子近椭圆形, 大小为4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm, 其构象复杂, α螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构, 研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的, 疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用, 其分子表面有一个容纳多糖底物6 个单糖的裂隙, 这是溶菌酶的活性部位【2】
二、溶菌酶的功能
2．1溶菌酶的抑菌作用
溶菌酶具有广泛的抑菌谱。蛋清溶菌酶能分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等许多革兰氏阳性菌。不同来源的溶菌酶的抑菌谱不同。杨向科等通过实验研究表明， 海洋微生物溶菌酶对多种鸡蛋蛋清溶菌酶不能直接作用的微生物如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、
变形链球菌等都有溶菌作用； 并且海洋微生物溶菌酶对一些革兰氏阴性菌也具有明显的抑制作用［3］。W.H.Holzapfel等推测革兰氏阴性菌可能拥有一层外膜能保护细胞免遭蛋清溶菌酶作用， 这层膜可以被螯合剂EDTA 破坏从而使细菌对溶菌酶敏感；Morrison 等认为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖对蛋清溶菌酶有很强的亲和性，从而阻止溶菌酶的渗透， 使蛋清溶菌酶不能分解革兰氏阴性菌。不同来源的溶菌酶的酶学性质也有很大差别，人溶菌活性比鸡蛋溶菌酶高3 倍， 而植物溶菌活性比鸡蛋溶菌酶低。微生物产生的溶菌酶通常是几种相关酶的混合物，由于彼此间的协同作用使其对细菌细胞壁的溶解能力增强［4］。在溶菌酶上连接疏水基团能明显扩大其抑菌谱，增强对革兰氏阴性菌的抑制作用，并随配基疏水能力的增强而增强，但对革兰氏阳性菌的抑制作用减弱［5］。
溶菌酶还具有抗炎消肿和增强免疫力的作用。肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成成分, 溶菌酶可水解肽聚糖中N- 乙酰胞壁酸( NAM)和N- 乙酰葡萄糖胺( NAG) 中的B- 1, 4 糖苷键, 在渗透压作用下导致革兰阳性菌细胞壁破裂, 发生溶菌作用[ 6]. 溶菌酶水解细胞壁时所释放的肽聚糖碎片是合成与分泌各种抗菌蛋白包括溶菌酶的诱导物，溶 菌酶可清除其它抗菌因子作用后所残余的细菌细胞壁并增强其它免疫因子的抗菌敏感性， 协同抵制外来病原的入侵[7]。溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用。小儿急性鼻窦炎是一种与病毒、细菌感染、免疫功能异常及遗传因素等有密 切关系的疾病。柴向华等通过向小儿急性鼻窦炎患者处方药中添加溶
菌酶来研究溶菌酶的功效时发现， 服用溶菌酶的患儿的治愈时间明显短于未服溶菌酶的患儿，证明溶菌酶能明显增强机体免疫力[8]。
2.2溶菌酶的抑菌机制
目前已知的几种溶菌酶有: 内- N - 乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β- 1, 3、β- 1, 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰 壳多糖酶[ 9] 。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N - 乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β-1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键, 使糖苷键断裂, 破坏细胞壁的分子结构, 而酰胺酶等则主要作用于多肽, 使多肽断裂。以内- N - 乙酰己糖胺酶为例, 内- N - 乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N - 乙酰胞壁酸( NAM )与N - 乙酰葡萄糖氨( NAG) 之间的β- 1, 4糖苷键, 使肽聚糖分子发生断裂, 使细胞壁内外两侧渗透压失衡, 造成细胞破裂, 导致微生物因细胞壁溶解而被杀死[ 10] 。溶菌酶对革兰氏阳性菌(G+ ) 细胞与革兰氏阴性菌( G- ) 的溶菌作用,由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差异,G+ 细胞壁含80%肽聚糖, 而G- 细胞壁只有在内壁层含有少量肽聚糖, 因此, 溶菌酶能有效杀死G+ 菌, 而对G- 细胞破坏很小。
三、溶菌酶的工程改造
溶菌酶是一种比较稳定的蛋白质, 通过下列措施可以进一步改善溶菌酶的功能特性。
3.1抗菌范围的扩大
溶菌酶能快速有效的催化细菌细胞壁中肽聚糖的水解，因而被广泛用
于消炎药中，但溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对绝大多数的革兰氏阴性菌不显示抗菌效果。因为革兰氏阴性菌的细胞外膜能阻碍溶菌酶接触其底物肽聚糖。采用有效的手段提高溶菌酶突破外膜障碍接触肽聚糖，则有可能把溶菌酶的抗菌范围扩大到革兰氏阴性菌。 Kato等证实在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段或在多肽链的侧链上引进糖基可有效扩大溶菌酶的抗菌能力【11】
3.2热稳定性的提高
3.2.1六环水可以提高溶菌酶的热稳定性
赵林等的研究表明[12], 水经低温超声定频谱振后, 大多数呈六环和六笼形水分子簇存在。这种水在生物蛋白、核酸、细胞与组织活动中起到重要作用。经DSC法实验证明, 用六环水合溶菌酶时, 每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数258 个增加了150 个, 达到408 个, 相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6 个水分子, 这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六笼形的动态氢键网络, 这种六笼形机构具有最为稳定的结构能。结构水物化特性的改变有助 于溶菌酶中疏水相互作用力的加强, 溶菌酶周围有序的结合水量和水化层强度增加, 从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力, 因此增加了溶菌酶的稳定性。
3.2.2定点突变改变溶菌酶的稳定性
Song 等[13] 在鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白产生突变体I55T 和D66H的基础上, 应用定点突变构建了具有在49 位用门冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信号序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉样蛋白生产突变体
于消炎药中，但溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对绝大多数的革兰氏阴性菌不显示抗菌效果。因为革兰氏阴性菌的细胞外膜能阻碍溶菌酶接触其底物肽聚糖。采用有效的手段提高溶菌酶突破外膜障碍接触肽聚糖，则有可能把溶菌酶的抗菌范围扩大到革兰氏阴性菌。 Kato等证实在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段或在多肽链的侧链上引进糖基可有效扩大溶菌酶的抗菌能力【11】
3.2热稳定性的提高
3.2.1六环水可以提高溶菌酶的热稳定性
赵林等的研究表明[12], 水经低温超声定频谱振后, 大多数呈六环和六笼形水分子簇存在。这种水在生物蛋白、核酸、细胞与组织活动中起到重要作用。经DSC法实验证明, 用六环水合溶菌酶时, 每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数258 个增加了150 个, 达到408 个, 相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6 个水分子, 这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六笼形的动态氢键网络, 这种六笼形机构具有最为稳定的结构能。结构水物化特性的改变有助 于溶菌酶中疏水相互作用力的加强, 溶菌酶周围有序的结合水量和水化层强度增加, 从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力, 因此增加了溶菌酶的稳定性。
3.2.2定点突变改变溶菌酶的稳定性
Song 等[13] 在鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白产生突变体I55T 和D66H的基础上, 应用定点突变构建了具有在49 位用门冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信号序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉样蛋白生产突变体
( I55TPG49N, D66HPG49N) , 这些糖基化突变体比非糖基化突变体在酵母表达系统S . cerevisiae 的分泌大大增加, 糖基化突变体在37 e 、pH7. 4 条件下, 仍保持40% 的酶活性, 而非糖基化突变体在同样条件下最后失去全部活性, 说明糖基化链能掩蔽淀粉样蛋白生产的溶菌酶分子的B- 折叠, 增加了淀粉样蛋白生产的溶菌酶的稳定性。
四、溶菌酶的应用
4.1溶菌酶在食品工业中的应用
溶菌酶对牛奶中革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等作用非常强。由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬间杀菌奶， 其方法为在包装前添加或在杀菌前添加。每吨牛奶加入0.05～0.1mg 溶菌酶，37℃保温3h，可使牛奶中双歧杆菌的含量与人奶无显著差别， 从而保证婴儿肠道内双歧杆菌的良好增殖。在半硬干酪中加入0.001%的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，同时能阻止由于厌氧孢子增殖体（如酪梭杆菌）的作用所引起的胀气等[14]。张德权等选取Nisin、溶菌酶、乳酸钠、茶多酚、壳聚糖等5 种天然保鲜剂对冷却羊肉进行保鲜处理， 结果发现溶菌酶的保鲜效果优于乳酸钠、茶多酚、壳聚糖[15]。在低度酒中添加溶菌酶不仅对酒的风味无任何不良影响, 还可防止产酸菌生长, 是低度酒良好的防腐剂。在日本清酒中大部分微生物不能生存, 但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长, 并产酸使酒发臭, 添加溶菌酶后火落菌被有效抑制, 成功代替水杨酸作防腐剂用于清酒中[ 16] 。倪瑛等[ 17] 报道, 向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶,可以大大减少SO2 的使用量,
减小了SO2 使用过多可能对人体造成的毒害作用。此外, 溶菌酶还 可以添加到果汁中作为防腐剂使用。
4.2在医疗中的应用
溶菌酶对G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用, 对大肠杆菌、普通变球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳, 因而, 溶菌酶广泛应用于医药行业, 如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症, 尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显
[18]。戴清源等[19]报道, 正常情况下, 人体尿液中一般只存在少量溶菌酶, 因此测量尿中溶菌酶含量, 有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时, 烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍, 也可在尿液中检出, 有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。
4.3在畜禽饲料中的应用
溶菌酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用; 对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一 定的杀灭作用; 与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用, 具有良好的防腐作用。在饲料中添加溶菌酶可防止霉变,延长饲料的贮存期, 减少不必要损耗[ 20]。沈彦萍等[21]报道, 溶菌酶对防治仔猪腹泻有显著作 用, 可达到抗生素的使用效果, 治愈率达80%以上。溶菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系, 体内溶菌酶主要来自嗜中性白细胞、单核细胞及吞噬细胞溶酶体, 可进入机体补体系统并增强抗体活性, 从而杀灭有害微生物。
五、展望
由于溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、无毒性、无残留、无污染的特点, 因此, 可广泛应用于食品添加剂、饲料防腐剂、医疗等方面。但是它也存在抗菌谱窄、提取造价高等问题, 所以如何开发出抗菌谱广、稳定性高、价格低廉的产品, 是未来一段时间需要深入研究的问题。尽管我国对溶菌酶开发应用十分有限, 但随着科学技术的不断发展和人民生活水平的不断提高, 人们对食品和医药的安全性要求会越来越高, 这势必会促进科学工作者致力于进一步研发天然溶菌酶。
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