残留剂量恩诺沙星对SPF小鼠肠道微生态的影响

2008年12月第18卷第12期

中国比较医学杂志

CHINESE J OURNA L OF COMPAR ATIVE MEDICINE December, 2008Vol. 18 No. 12

研究报告

残留剂量恩诺沙星对SPF 小鼠肠道微生态的影响

雷艳, 贺永亮, 袁静, 唐欢, 魏泓

(11第三军医大学基础医学部实验动物学教研室, 重庆 400038; 21西南大学生命科学学院, 重庆 400715) =摘要> 目的通过分析残留剂量恩诺沙星对SPF 级小鼠肠道菌群耐药性、定植抗力的影响, 评估现行恩诺沙星ADI 值的微生物安全性。方法采用SPF 级KM 小鼠, 通过饮水连续给药恩诺沙星35d, 给药剂量分别为0、01005、0105、015、5mg P kg d 。实验内容由两个独立的平行实验构成, 实验一观察菌群耐药率的变化; 实验二在给药恩诺沙星10d 后, 灌胃接种白假丝酵母菌, 观察小鼠肠道内白假丝酵母菌的清除情况。结果 015、5mg P kg d 剂量组的总需氧菌及总厌氧菌的耐药率明显高于对照组(P

=关键词>

恩诺沙星; 残留; 肠道菌群; 小鼠, SPF 级

=中图分类号>R-33 =文献标识码>A =文章编号>1671-7856(2008) 12-0037-05

Effects of Residual Dose of Enrofloxacin on Intestinal Microflora in SPF Mice

LEI Yan,HE Yong -liang , YUAN Jing, TANG Huan, WEI Hong

(11Departmen t of Animal Science, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, Chi na;

21School of Life Sciences, South wes t University , Chongqing 400715, China)

=Abstract > Objective

To investigate the effects of residual doses of enrofloxacin on mouse intestinal microflora.

Methods Female SPF KM mice received enrofloxacin in a oral doses of 0, 01005, 0105, 015, 5mg P kg body weight in drinking water for 35days. Two independent trials of si milar desi gn were performed wi th enrofloxaci n. The first trial evaluated the changes of susceptibility of target organisms to enrofloxacin. The second trial evaluated the changes in the barrier effect of the intestinal microflora. Results The resistance rates of total anaerobes and aerobes to enrofloxacin in doses of 015and 5mg P kg d. were significan tly higher than that of the con trol mice (P

=Key w ords > Enrofloxacin; Residual dose; In tes tinal microflora; SPF mouse

动物性食品中抗菌药物残留对人体肠道微生态的负面影响越来越为人们所重视。其对肠道微生态

[基金项目]/十一五0国家科技与支撑计划(2006BAK02A03-2) 。

所造成的危害在于破坏正常菌群, 促进耐药菌的繁殖, 降低菌群的定植抗力等

[1-2]

。因此, 联合国粮食

[作者简介]雷艳(1979-) , 女, 讲师, 研究方向:分子微生物生态学, 电话:[1**********], Emai l:ly. gm@1631co m 。[通讯作者]魏泓, 教授, 电话:023-68753882, E -mail:weihong63528@1631com 。

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农业组织、世界卫生组织等国际机构对于残留剂量抗菌药对人体肠道菌群的安全性评价给予了一些指导方针和建议, 并由此制定抗菌药的最高日允许摄[2-4]

人量(acceptable daily intake, ADI) 。

恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星是第3代喹诺酮类抗菌药, 其抗菌谱广, 在医学和兽医临床的应用均十分广泛。目前国内外已经先后利用动物模型、离体培养系统等, 就恩诺沙星或环丙沙星对肠道菌群的影响作用进行了一系列实验研究, 实验结果均提示该抗菌药物对肠道菌群数量、耐药率以及定植抗力三方面有负面影响。

依据中华人民共和国农业部第235号公告中5动物性食品中兽药最高残留限量6, 我国现行的恩诺沙星ADI 值为0~2L g P kg d, 相当于小鼠0105~011mg P kg d, 但目前国内外相关实验的给药剂量均大于该ADI 值, 因而无法验证现行标准是否真正安全。

本实验借鉴同类实验的设计方法, 结合我国现行的恩诺沙星ADI 值, 采用低于以往实验的剂量进行给药处理, 检测给药前后小鼠肠道菌群耐药率及定植抗力的变化, 探讨残留剂量恩诺沙星对小鼠肠道微生态的影响, 初步验证我国现行的恩诺沙星ADI 值是否安全。1 材料和方法

111 材料

SPF 级雌性KM 小鼠, 4~6周龄, 体重(30? 2) g, 购自第三军医大学实验动物中心(许可证:SYXK (渝) 2007-0002) 。小鼠饲养于顶部带有空气滤膜的鼠笼内, 寄养于第三军医大学实验动物中心的SPF 动物房(许可证:SYXK(军) 2007-037) 。

白假丝酵母菌(Candida albicans ) SC5314由加拿大生物技术研究所Anne Marcil 博士惠赠。

恩诺沙星可溶性粉(5g:125mg ) 购自四川华蜀动物药业有限公司(批准文号:兽药字(2006) 220262119) , 乳酸环丙沙星(20mg P mL) 购自四川省自贡倍乐瑞克动物药业有限公司(批准文号:兽药字(2006) 220232073) 。BH I(CM0375) 、SB (C M0377) 、Mac (C M0007) 、BBE (C M0888) 、MRS (CM0361) 培养基均购自英国Oxoid 公司。BSM 由MRS 加入0105%的L -半胱氨酸(C7352, 美国SIGMA 公司) 和01005%的莫匹罗星(中美天津史克制药有限公司, 批准文号:国药准字H10930064) 配制而成。112 实验分组及给药方法

[6-9]

[5]

验, 实验一组检测SPF 小鼠肠道菌群在给予恩诺沙星前后耐药率的变化, 实验二组检测SPF 小鼠肠道菌群在给予恩诺沙星前后定植抗力的变化。

11211 实验一组:将30只小鼠在SPF 动物房适应性饲养14d 后, 随机分为5组, 每组6只。对照组自由饮用无菌蒸馏水, 极低剂量组、低剂量组、中剂量组、高剂量组给于恩诺沙星溶液, 各组的给药剂量分别为01005、0105、015、5mg P kg d 。所有给药组的饮水每2~3d 更换1次, 连续饮用5周后更换为无菌蒸馏水。于给药前第7天、第0天、给药后第7、14、21、28、35天, 停药后第7、14、21d 取小鼠粪便样品, 进行肠道菌群培养计数, 计算其耐药率。

11212 实验二组:将25只小鼠在SPF 动物房适应性饲养14d 后, 随机分为5组, 每组5只, 分组及饮水给药恩诺沙星的方法同实验一组。在给于恩诺沙星饮水10d 后, 所有组均灌胃白假丝酵母菌混悬液012mL, 菌液浓度约为(2~4) @10CFU P mL, 每日1次, 连续2d 。于灌胃白假丝酵母菌后第1、2、3、5、8、11、14、17、21、24、28、31、35、39、43天取样小鼠粪便, 共15次, 进行白假丝酵母菌培养计数。113 检测指标及方法

11311 小鼠肠道菌群计数及耐药率计算:无菌收集小鼠粪便, 将粪便样本进行10倍倍比稀释, 选择适宜的浓度接种至相应的培养基上培养计数。总需氧菌、肠球菌、肠杆菌分别采用B HI 、SB 、Mac 培养基, 需氧条件下培养24h; 总厌氧菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌分别采用BHI 、B BE 、BSM 、MRS 培养基, 厌氧条件下培养48~72h 。将同一粪便样本接种于对应的含药培养基中(各培养基加入环丙沙星的浓度

表1 各培养基中加入环丙沙星的浓度(L g P mL) Tab. 1 The concentration of ciprofloxacin used

i n differen t media (L g P mL)

培养基

Media B HI SB Mac BBE BSM MRS B HI

检测菌种

Bacterial species 总需氧菌Total aerobes 肠球菌Enterococci 肠杆菌

Enterobac teriaceae 拟杆菌Bacteroides 双歧杆菌Bi fi dobacteria 乳酸杆菌Lac tobacilli 总厌氧菌环丙沙星浓度

Ciprofl oxaci n concentrati on

[1**********]232

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见表1) , 细菌耐药率用生长在含药培养基上的细菌数与生长在对应的无药培养基上的总细菌数的比值来表示(%) 。11312 肠道菌群的定植抗力(白假丝酵母菌计数) :灌胃接种白假丝酵母菌之前, 经检测小鼠肠道内无内源性白假丝酵母菌。灌胃接种白假丝酵母菌之后, 无菌收集小鼠粪便, 10倍倍比稀释后, 选择适宜的浓度接种至YPD 培养基, 37e 培养24~48h 后计数。114 统计学方法

数据以均值? 标准差(x ? s ) 表示, 采用SPSS 1010统计数据包进行t 检验, P

2 结果

211 恩诺沙星对小鼠肠道菌群耐药率的影响

高剂量组、中剂量组的总厌氧菌及总需氧菌耐药率随着给药时间的延长出现增大趋势, 与对照组差异显著(P

无显著性。

注:与对照组比较, *P

图1 恩诺沙星对总厌氧菌耐药率的影响

Note:compared with the control group, *P

Fig. 1 Effect of enrofloxacin on the resistance rate of total

anaerobes

注:与对照组比较, *P

图2 恩诺沙星对总需氧菌耐药率的影响

Note:compared with the control group, *P

Fig. 2 Effect of enroflox acin on the resistance rate of total aerobes

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212 恩诺沙星对小鼠肠道菌群定植抗力的影响

灌胃接种白假丝酵母菌之后, 各组的白假丝酵母菌计数随着时间的推移逐渐减少, 小鼠粪便中白

假丝酵母菌计数随时间的变化率, 各组之间差异无显著性。从接种后第8天开始, 对照组、极低剂量组、低剂量组均有部分小鼠未培养出白假丝酵母菌,

接种24d 后, 这三组均未再培养出白假丝酵母菌, 三组之间比较差异无显著性。中剂量组在接种39d 后未再培养出白假丝酵母菌, 高剂量组直至实验结

束时仍有3只可检测出, 中剂量组和高剂量组小鼠对外源性白假丝酵母菌的清除情况与对照组比较差异有显著性, 见表2。

表2 各组检出白假丝酵母菌的小鼠只数

Tab. 2 Amout of mice with Candida a lbicans detected in the feces

灌胃后天数Day post drinking

[***********]1353943

小鼠只数Count of mice

对照组Control group

[**************]

极低剂量组Very low dos e grou

[**************]

低剂量组Lo w dose group

[**************]

中剂量组Medium dose group

[**************]

高剂量组High dose group

[**************]

3 讨论

目前, 关于残留剂量抗菌药对人体肠道菌群安全性评价的模型和方法分为离体和活体两大类, 其中活体模型包括人类志愿者、普通动物、无菌动物和HFA 等, 每种模型各有优势和不足, 没有一种模型可以完全模拟人类肠道的生理情况。HFA 动物模型保持了人类肠道菌群的特性, 特别适宜于研究人体肠道菌群的相互作用和代谢, 以及对外源菌的屏障作用。但HFA 模型建立较为困难, 饲养技术要求高, 且费用昂贵, 相比之下SPF 动物较普通动物的肠道菌群更具规律性, 其数量和种类都较均一, 且SPF 动物的饲养和实验条件较HFA 小鼠容易控制和维持, 因此本实验采用SPF 级KM 小鼠作为实验对象。

2004年美国食品与药品管理局、兽医学中心公布了第52号文件, 即评价食品中残留剂量抗菌药物对人类肠道菌群影响作用的指导文件, 文件中指出在研究抗菌药物对人类肠道菌群的作用时, 应以该药物及其代谢产物对菌群耐药性和屏障作用的影响[2-4]

药物对肠道菌群的影响主要体现在菌群数量、耐药

[10-15]

性及屏障作用几方面。本实验主要针对菌群耐药性和屏障作用指标进行检测, 在实验设计上和国内外同类实验相似, 分给药前、给药后、停药后三个实验阶段, 在三个阶段的不同时项点对不同给药剂量组的小鼠进行粪便取样, 观察肠道菌群耐药率、外源菌清除情况随时间的变化趋势, 从而反映出抗菌药对小鼠肠道微生态的影响作用。

在药物剂量选择上, 本实验主要依据中华人民共和国农业部第235号公告中5动物性食品中兽药最高残留限量6。公告中恩诺沙星的ADI 值为0~2L g P kg d, 小鼠摄入恩诺沙星0105m g P kg d, 对应于人摄入1~2L g P kg d, 与国家标准相当。本实验将0105mg P kg d 做为低剂量组, 并同时将01005、015、5mg P kg 分别作为极低剂量组、中剂量组、高剂量组, 最低给药剂量为国家标准的1P 10, 最高给予剂量为国家标准的100倍, 从而可以较好地验证国家标准是否安全。

本实验的结果显示, 经饮水给药恩诺沙星后, 015、5mg P kg d 剂量组总需氧菌及总厌氧菌耐药率随,

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验结果相一致

[6-9,16-17]

。各组在给药前后均未培养

[6]

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1修回日期22008-09-20

出耐药肠球菌, 这一点与刘健华等的报道相同。

对照组的总需氧菌和总厌氧菌天然耐药率均较同类

实验高, 考虑可能与小鼠种群差异有关。在肠道菌群定植抗力方面, 灌胃接种白假丝酵母菌之后, 各组小鼠粪便中白假丝酵母菌计数随着时间的推移逐渐减少, 接种24d 后, 对照组及01005、0105mg P kg d 剂量组均未再培养出白假丝酵母菌, 三组之间无显著差异; 015mg P kg d 剂量组在接种39d 后未再培养出白假丝酵母菌, 5mg P kg d 剂量组直至实验结束时仍有3只可检测出。由此可见, 015、5mg P kg d 剂量组的小鼠肠道菌群的定植抗力受到了一定的影响, 这一结果与国内外同类实验的结果相吻合。本实验中, 给予抗菌药物后肠道菌群在构成情况和功能状态几方面显示出的变化趋势和国内外同类实验相一致。

综上所述, 在本实验条件下, 未观察到0105mg P kg d 恩诺沙星剂量(对应于现行ADI 值) 对小鼠肠道菌群的明显变化; 当恩诺沙星剂量大于0105mg P kg d 时, 可能对小鼠肠道微生态造成负面影响, 说明我国现行恩诺沙星ADI 值安全性较好, 不会对人体肠道菌群造成负面影响。值得注意的是, 单一模型所得出的实验结果只能为研究抗菌药对人类肠道微生态的影响作用提供一定参考, 只有综合多种实验模型和检测方法所得的实验结果, 才能推导出更为可靠的结论。

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