HNF1对人FXR启动子的调控作用

ISSN　100727626CN　1123870ΠQ

中国生物化学与分子生物学报

2006年12月22(12):966～972

α对人FXR启动子的调控作用HNF1

娄桂予,　陈　敏,　陈　彬,　陈　健,　李渝萍,　周度金

(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室,重庆　400038)

α(HNF1α)对人胆汁酸受体(FXR)转录激活的作用及机制,将含HNF1α摘要　为探讨肝细胞核因子1

α)和含有FXR启动子的荧光素酶报告基因载体共转染人肝的真核表达载体(pcDNA311(+)HNF1

癌细胞系HepG2,检测转染细胞中荧光素酶活性并用半定量RT2PCR、免疫印迹法检测FXR的表α可能结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报达.QuikChange法对FXR启动子HNF1

告质粒单独或与pcDNA3.1(+)共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.根据凝胶电泳迁移

α与FXR启动子区域的结合.结果发现,转染pcDNA3.1(+)HNF1α可以上调率变化,分析HNF1

FXR在HepG2细胞中的表达,并增强FXR启动子活性且具有剂量依赖性;-65～-48区域的点突

α.结果提示,变,导致FXR启动子活性明显降低,共转染pcDNA3.1(+)HNF1

α能调控FXR基因表达,其机制为:H与--48区域的反转录因子HNF1

向半位点结合,发挥其反式激活作用.

;关键词　法尼酯衍生物X受体;中图分类号　Q786

αRumanFXRPromoterActivitybyHNF1

LOUGui2Yu,CHENMin,CHENBin,CHENJian,LIYu2Ping,ZHOUDu2Jin

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing　400038,China)

αanditsmechanism,theHNF1αAbstract　ToinvestigatetheregulationofFXRpromoteractivitybyHNF1

α)andtheluciferasereportervectorcontainingtheFXRpromoterexpressionvector(pcDNA3.1(+)HNF1

wereco2transfectedintoHepG2cellline.TheluciferaseactivityoftransfectedHepG2wasdeterminedandFXR

αtoexpressionwasdetectedbysemi2quantitativeRT2PCRandWesternblotting.ThebindingsitesofHNF1

FXRpromoterweremutatedusingQuikChangemethod.Theserecombinedluciferasereportervectors

α.ThecontainingthemutatedsitesweretransfectedintoHepG2cellaloneorwithpcDNA3.1(+)HNF1

luciferaseactivityoftransfectedcellswasdeterminedagain.TheinteractionwithFXRpromoterwasperformed

αtransfectionbyelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA).ResultsshowedthatpcDNA3.1(+)HNF1

couldup2regulateFXRexpressionofHepG2cellsandsimultaneouslyenhancethepromoteractivityofFXRgeneinadose2dependentmanner.ThemutationofFXRpromoterat-65to-48resultedinastriking

αdidnotenhancethepromoterdecreaseofpromoteractivityandco2transfectionwithpcDNA3.1(+)HNF1

αcouldbindtothe-65to-48regioninhumanFXRpromoter.Theseresultssuggestthatactivity.HNF1

αcouldtransactivatetheFXRpromoteractivity.ThemechanismmaylieinthatHNF1αbindtotheHNF1

inversehalfsiteat-65to-48,thenactivatethepromoteractivity.Keywords　farnesoidXreceptor;hapatocytenuclearfactor1α;promoter

收稿日期:2006205215,接受日期:2006209221

国家自然科学基金资助项目(No.30600299,No.30671056)

联系人　Tel:(023)68752940,E2mail:[email protected]

Received:May15,2006;Accepted:September21,2006

SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30600299,No.30671056)

Correspondingauthor　Tel:(023):68752940,E2mail:[email protected]

第12期α对人FXR启动子的调控作用娄桂予等:HNF1967　

　　法尼酯衍生物X受体(farnesoidXreceptor,FXR)

又称为胆汁酸受体,是核受体超家族的成员之一.其天然配体是胆汁酸.FXR可与视黄酸X受体(retinoidXreceptor,RXR)以异二聚体形式结合于靶基因启动子相应区域,参与多种基因表达的调控.在胆汁酸负反馈调节、糖脂代谢中发挥重要作用.

鉴于FXR自身调控机制仍不清楚,我们的前期工作对人FXR基因进行生物信息学分析,确定了FXR转录起始位点.将人FXR基因5′调控区进行克隆,并初步分析其功能,发现启动子活性最高的区域

[1]

为-847～+200.对这一区域转录因子结合位点预测,提示该区存在着3个HNF1的结合位点、1个HNF4的结合位点及其它多种核转录因子的结合位点.其中肝细胞核因子1(hepatocytenuclearfactor1α,

α)—HNF1——同源域类转录因子家族成员,在组织中的表达分布及功能与FXR相似.因此,本研究在上

α是否调控FXR述发现的基础上,进一步探讨HNF1

的表达及其调节机制.

遍.加入Lipofectamine2000Π质粒混合液,并补加

βOPTIM.每孔中含有1Π10总量psv2gal作为内对照,

转染5h后,弃去转染液,加入正常细胞培养液,24h后,收集细胞.

共转染:每组中除其它质粒外,再加入等量

α表达质粒,其它操作方法pcDNA311(+)HNF1

同前.11213　荧光素酶报告基因活性检测　

转染24h后,每孔细胞加入1×reporterlysis,离心收集上清.取20μl上清按照检测试剂说明书操作,用化学发光检测仪检测荧光素酶的活性,酶标仪检测β2半乳糖苷酶的活性.11214　RT2PCR　

弃去培养液基,加入Tripure轻轻摇动5min,吸出Tripure转入EP管中.按操作说明书步骤提取HepG2RNA.

μ4(50ngΠl)2

ol36μl,65℃,放置5,5min.之后加入5×缓冲液10μl,011molΠLDTT,2μl,Superscript逆转录酶2μl,使总反应

l.混匀后室温放置5min,然后50℃逆转体积为50μ

录1h.70℃,灭活15min,-20℃保存.

PCR:cDNA2μl,10μmolΠL上下游引物各2μl,10mmolΠLdNTPs2μl,10×缓冲液5μl,HotstarTaq1μl,加水至50μl.PCR扩增,循环参数为:95℃变性15min;94℃,30min;58℃,30min;72℃,30min;共35个循环;72℃,10min.FXR引物上游序列:5′2GCAGCCTGAAGAGTGGTACTCTC23′;下游序列:5′2CATTCAGCCAACATTCCCATCTC23′.对照β2actin引物

1　材料与方法

111　材料

人肝癌细胞HepG为本实验室保存;pcDNA311

α、(+)HNF1pGL3basicFXR(-847～+200)由本实验室构建;DMEM、胎牛血清购于Hyclone公司;

Superscript逆转录酶、lipofectamine2000购于Invitrogen公司;HotstarTaqDNA聚合酶、dNTPs为Qiagen公司产品;Tripure购于Roche公司.抗人FXR(H2130)多抗购于SantaCruz公司.辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗及抗人GAPDH、DAB显色试剂为北京中山产品.荧光素酶检测试剂为Promega公司产品;PfuTurboDNA聚合酶、DpnⅠ购于Stratagene公司.实验中所用引物用Primerpremier510软件设计,由上海生工生物技术公司合成.112　方法

11211　HepG2细胞培养　

上游序列:5′2ATGGGTCAGAAGGATTCCTAT23′;下游

序列:5′2AGGCGTACAGGGATAGCACA23′.PCR产物长度分别为362bp及295bp.取部分产物于2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.图像分析系统分析条带的灰度值.

11215　免疫印迹　

采用DMEM加10%胎牛血清培养基,于37℃、

5%CO2细胞培养箱中培养.常规换液、传代.11212　转染　

具体方法参见Lipofectamine2000产品说明书.操作步骤是:转染前1d,消化细胞,以一定密度接种与细胞培养板.当细胞生长至90%～95%融合时,准备转染.置备Lipofectamine2000Π质粒混合液,室温放置10min.混合两管,室温放置20min.吸尽孔中细胞培养液,用PBS冲洗2遍,用OPTIM洗1

提取细胞总蛋白,用Bio2Rad公司蛋白检测试剂进行蛋白定量.12%SDS2PAGE,上样量为50μg蛋白.电泳完毕后,半干转膜12V,1h.PVDF膜室温封闭1h,和抗人FXR(1∶200)4℃温育过夜,PBST洗膜,室温下和二抗温育1h,DAB现色.内参为GAPDH(1∶1000).11216　QuikChange法构建突变体　

参照Stratagene公司QuikChangeSited2DirectedMutagenesisKit的方法操作.根据突变点上下游的碱

968中国生物化学与分子生物学报22卷

基序列设计一对互补的引物(见Table1).以pGL3basicFXR(-847～+200)为模板,使用PfuTurboDNA聚合酶进行20轮PCR,用点突变引物将突变引

Table1　PrimersdesignformutantsMutationpGL3mut1pGL3mut2pGL3mut3pGL3mut3(+)pGL3mut3(-)

Mutationsite

Promoterseqence

入质粒中,然后DpnⅠ消化甲基化母链,产物转化

XL12blue感受态细菌.挑取克隆进行扩增,提取质粒,KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,送上海生工公司测序.

Primerseqence

5′2GTAGGCTGCCTCTCAATCAATGATGG23′5′2CCACCATTGATTGAGAGGCAGCCTAC23′52′CCCAAATCTGTATGCATTTGATATGGG23′5′2CCCATATCAAATGCATACAGATTTGGG23′5′2GGAAGGATTGACCATGGCCAATCTGTGT23′5′2ACACAGATTGGCCATGGTCAATCCTTCC23′5′2GGAAGGATTGACCATGACTAATCTGTGT23′5′2ACACAGATTAGTCATGGTCAATCCTTTCC23′5′2GGAAGGATTGTTAATGGCACCTCTGTGT23′5′2ACACAGAGGTGCCATTAACAATCCTTCC23′

-814～-798　GTAGGCTGATAATCAATCAATGATGG-499～-481-65～-48-65～-48-651～-48

CCCAAATCTGTTATTATTTGATATGGGGGAAGGATTGTTAATGACTAATCTGTGTGGAAGGATTGTTAATGACTAATCTGTGTGGAAGGATTGTTAATGACTAATCTGTGT

11217　凝胶电泳迁移率变化分析(electrophoretic

mobilityshiftassay,EMSA)

HepG2细胞核蛋白的提取同文献[2]所述.采用Folin2酚试剂法,测定核蛋白的浓度.PCRHNF1结合位点-65～-48,EMSA探针.PCR::5’CCTGGGGCTTTG23′反向:CTGTGCCTCATG23′

合反应液孵育15min,P2标记的探针.超

,先将正应液冰上共孵育8　统计学处理

所有数据用