碱裂解法提取质粒
一、基本概念 1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的 细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专 指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。在基因工程中质粒 常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状 DNA 分子， 这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因 或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进 细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA 分子。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合 环状 DNA 分子(简称 cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染 色体的 0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两 类：较大一类的相对分子质量是 40×106 以上，较小一类的相对分子质量是 10×106 以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主 要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严 紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有 1～2 个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细 胞内一般有 20 个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质 粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的 复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种 有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒 运载体有 pBR322、pSC101。pBR322 含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基 因(Apr)，并含有 5 种内切酶的单一切点。如果将 DNA 片段插入 EcoRI 切点，不 会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将 DNA 片段插入到 HindIII、BamHI 或 SalI 切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有 DNA 插入片段的 pBR322 将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有 DNA 插入片段的 pBR322 会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素， 而没有 pBR322 质粒的细菌将对氨苄
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青霉素和四环素都敏感。pSC101 与 pBR322 相似，只是没有抗氨苄青霉素基因 和 PstI 切点。质粒运载体的最大插入片段约为 10kb(kb 表示为千碱基对)。 pGEX-4T1 是 pGEX 载体系列的一种，载体图如图 2 所示，这类载体是溶蛋 白表达、纯化和检测为一体的整合系统。具有以下优点：有一个可以
用化学物质 （IPTG）诱导的高效表达的 tac 启动子；一个 lacIq 基因以便通用于所有 E.coli 宿主中；一个 AmpiR 基因以便于阳性克隆的筛选。
pGEX-4T1 载体示意图
2．感受态细胞：重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受 体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入 过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方 面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系， 另一方面还与受体菌是 否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源 DNA 片段并实现其转 化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环 境因子的影响。cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca2+也可大大促进转
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化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态 细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体 积 15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期 6 个月） 。
3.转化:是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状 的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的 DNA 分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现 新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株， 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击 处理将载体 DNA 分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体 DNA 分子导入受体细胞。
二、碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒， 是从事分子生物学研究的实验室每天都要用 的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液 I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液 II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N 相当于 g/L，是当量浓度) 溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液 I 的作用 任何生物化学反应， 首先要控制好溶液的 pH， 因此用适当浓度的和适当 pH 值 的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来 加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子 不可思议， 的底部。 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂， 配在分子生物学试剂 在溶液 I 中加入 EDTA 中的主要作用是： 抑制 DNase 的活性， 和抑制微生物生长。
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是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，菌体一定要悬浮均匀，不 能有结块。 溶液 II 的作用 这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2％的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH，是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减 弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了 碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle （微囊） 结构的相变化所导致。 用了不新鲜的 0.4 N NaOH， 即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然 也能抽提得到少量质粒， 因为 SDS 也是碱性的， 只是弱了点而已。 很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一 些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解 的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两 点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断 裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带 来麻烦。 溶液 III 的作用 溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，与 SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate） SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS） ，而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液 III 加入后的 沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的 盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸 上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白 质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程 不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了， 尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。 2 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要 中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50－100 kb 大小的片断，就没有办
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法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后 得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓 的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被 沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。 NaOH 本来是为了溶解细胞而用的， DNA 分子
的变性其实是个副 产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放 置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。 酚/氯仿纯化 不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白 质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到 质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里 用 25/24/1 的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的， 这里做个全面的介绍。（Phenol） 酚 对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉， 但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M 的异硫氰酸胍） ， 离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比 重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互 溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应 （比如限制性酶切反应） ，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水 相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微 量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。 至于异 戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相 的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，在室温放 置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一 长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收，所以不要 过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA 分子之间就容易形成 氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70％的乙醇多洗几次，每次 在室温放置一个小时以上，并用 tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质 粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的
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RNA 会干扰电泳结果的。 质粒检测 琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不 要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含 线性 DNA，不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到 线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快 慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在 了一起） 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动 得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠
杆菌基因组 DNA 的片断。 非常偶 然的是，有时候抽提到的质粒会有 7－10 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致 了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。 三、实验步骤 1．大肠杆菌感受态细胞的制备（可临用前准备，也可制备多管加甘油冻存 -80℃） （1） 从新鲜的DH5α菌株平板上挑取一个单菌落， （接种到4ml LB液体培养 基中）37℃，180rpm培养过夜。 （2）次日按照1：100的比例转接培养物于20mlLB液体培养基当中，37℃， 180rpm培养至OD值达到0.4-0.6。 （3）取培养物1ml到1.5ml 离心管中，冰浴10min，5000rpm离心5min收集菌 体。 （4）弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌体（在涡旋器上振荡） ， 冰浴30min。 （5）5，000rpm离心10min后弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 100ul。 （6）温和混匀后4℃放置24-48h备用。 2．质粒的转化 （1）取制备好的感受态菌体，加入质粒5ul（可变） 。 （2）冰浴30min后，42℃水浴热激90s（温度准确，速度要快把握好时间） 。 （3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液体培养基。 （4）37℃，150rpm复苏1h。
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（5）取10ul培养物涂布于含有抗生素的LB（由质粒的抗性决定） ，37℃倒置 培养。 （对照组不加抗生素） 3．质粒提取（或用试剂盒提取） （1）从4℃拿出长满菌体的LB平板，打开培养皿，用在酒精灯上烧过的镊 子夹取100ul的吸头挑取单菌落，之后把带有菌落的吸头放入带有抗生素的LB液 体培养基（4ml或10ml，认真标记）37℃振荡培养过夜。 （若是第二天进行二次 活化，则按照1：20的比例接种培养基，37℃振荡培养3小时，记得加抗生素） 。 （2） 取1ml菌液加入1.5ml的离心管中， 认真标记后把剩余的菌液冻存 （0.5ml 的菌液，0.5ml纯的甘油，认真标记）12，000rpm离心5min收集菌体。 （3）5000rpm 离心 5min 收集菌体，弃上请后再离心 5s,吸取残余的上清。 （4）向每个离心管中各加入 100ul 预冷的溶液Ⅰ,在混悬器上振荡使菌体充 （在冰上） 分悬浮，分散。 （5）再向每个离心管中各加入 200ul 新配制的溶液Ⅱ，缓慢倒转几次混匀。 （在冰上） （6）向每个离心管中各加入 150ul 溶液Ⅲ，缓慢倒转几次混匀。 （在冰上） （7）12，000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。 （8）向每个离心管中各加入酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） ，颠倒混匀后12， 000rpm离心10min。 （9）吸取上清（注意不要吸到中间层）到1.5ml离心管中，加入2倍体积预 冷的无水乙醇， 于-20℃放置20-30min （或室温放置10min） 000rpm离心10min， 12， 弃上清， （小心不要把质粒倒掉） （10） 加1ml 70％乙醇洗涤沉淀 （来回颠倒旋转几次） 12， ， 000rpm离心3min， 弃上清，室温干燥20min，
将沉淀溶于20ul的TE或水中，-20℃备用。
注：一般在第二步离心收集完菌体后再加入 1mlSTE，充分洗涤菌体，12，000rpm，离 心 1～2min。
4．质粒检测琼脂糖凝胶电泳 核酸 DNA 在 PH 高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 琼脂糖具有多孔的网状结构， 不同大小的核酸分子利用凝胶的分子筛效应得以分 开。实践中观察琼脂糖凝胶中 DNA 是利用荧光染料溴化已锭（EB）将 DNA 染
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色。溴化已锭与 DNA 结合，在 254nm 波长的紫外灯下呈现橙黄色的荧光条带。 （1）以配制浓度为 1%胶为例：取一个 50ml 锥形瓶（制胶专用） ，加入 0.5g 琼脂糖后加 1×TAE 至 50ml 放入微波炉内加热（火力中高，时间 3min） ，待液体 沸腾后拿出锥形瓶（注意不要烫住手） ，用吸取 50ul 的 EB（1：1000）加入锥形 瓶内。等到锥形瓶不烫手后向制胶板内倒胶，高度不要漫过制胶板沿，冷却，待 胶凝固后拔出梳子。 （2）配制电泳液：取一个 500ml 的广口瓶，加入 10ml 50×TAE，加双蒸水 至 500ml。 （3）待胶板放进电泳槽后向电泳槽内加入配好的电泳液，高度漫过胶板 1mm。 （4）点样：拿出裁成长条的称量纸光面向上（或一次性手套） ，用 10ul 移 液器吸取 3ul 的质粒，打在称量纸上，再用 10ul 移液器吸取 2ul 的上样缓冲液和 质粒混匀，吸取混合液 5ul 打入点样孔。 （5）电泳：接通电源，电压设定在 80v（可变） ，开始电泳。 （6）凝胶系统成相：等到指示剂快跑到胶板前沿时关闭电源，拿出胶板， 放在暗箱内， 打开与暗箱相连的电脑， 进入摄像软件， 进行摄像， 然后保存照片。
注：DNA 分子的大小 在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比， 因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的 大小。但是当 DNA 分子大小超过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁 移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 时，分子大小不宜超过此值。 琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的 DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 不同 浓度 琼脂糖凝胶分离 DNA 片段的范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状 DNA 大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
四、溶液配方（详细参考分子克隆实验指南） LB 液体培养基： 每配制 1000ml 加入胰蛋白胨 10g、 酵母提取物 5g、 NaCl 10g。 LB 固体培养基： 每配制 1000ml 加入胰蛋白胨 10 g、 酵母提取物 5g、 NaCl 10g、 琼脂糖 1.5g。
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溶液Ⅰ：50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅱ：0.2 M NaOH(临用前用 10 M 贮存液稀释)，10%SDS
(现用现配)。 溶液Ⅲ：60ml 5 M 乙酸钾，11.5ml 冰乙酸，28.5ml 水。 TAE(50×)：242g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，用时 稀释 50 倍。 加样缓冲液(6×)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。 溴化乙锭（或其无毒替代品） ：10mg/ml。 RNA 酶 A 母液： RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 将 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。 STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 五、常见问题 1. 加入 solution.III，经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液 面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？ 细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细 菌蛋白和细菌基因组 DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用 量增加。 2.加入 soln.III，经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状， 上清较少？ （1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用 量减半。 （2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法： 注意将细菌悬浮充分。 （3）加 Solution III 后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注 意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀 呈松散的豆腐花状)。 （4）Solution II 出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于 15℃，使 用试剂盒前请注意观察 Solution 水浴溶解沉淀后再使用。 II 中是否出现沉淀。 如果出现沉淀， 请于 37℃
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（5）Solution II 长时间暴露于空气中被 CO2 中和，导致菌体未能被有效 裂解。 解决方法： 可用经典碱裂解法抽提质粒 DNA 方法中的 II 液替代 II 使用。 3.出现严重的 RNA 污染？ （1）未在 Solution I 中事先加入 RNase A1。解决方法：补加 RNase A1。 （2）加入 RNase A1 的 Solution I 长期保存于室温，导致 RNase A1 活性 下降。 （3）细菌过量,RNase A1 不能有效降解 RNA。解决方法：将细菌用量减 半或增加 RNase A1 在 Solution I 中的浓度。 4.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？ （1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步 Rinse A 洗涤步骤以 彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒 DNA 进行乙醇沉淀。 （3） 质粒 DNA 在 Solution II 中暴露过久， 易造成质粒 DNA 的切口断裂。 裂解步骤控制在 5 分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现基因组 DNA 的
污染？ （1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组 DNA 断裂所致。解决 方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 （2）加 Solution II 时操作时间过长，造成基因组 DNA 断裂所致。解决方 法：将裂解步骤控制在 5 分钟内完成。 （3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的 细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组 DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时 DNA 飘出加样孔外？ 忽略或省略了高速离心以甩干残留的 Rinse B 的操作步骤。解决方法：按 说明书的操作步骤操作以确保残留的 Rinse B 被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8.质粒为何会丢失？ Solution
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细菌培养不要超过 16 小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致 质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成 质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗 生素使用浓度是否正确。
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碱裂解法提取质粒
一、基本概念 1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的 细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专 指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。在基因工程中质粒 常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状 DNA 分子， 这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因 或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进 细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA 分子。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合 环状 DNA 分子(简称 cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染 色体的 0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两 类：较大一类的相对分子质量是 40×106 以上，较小一类的相对分子质量是 10×106 以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主 要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严 紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有 1～2 个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细 胞内一般有 20 个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质 粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的 复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种 有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒 运载体有 pBR322、pSC101。pBR322 含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基 因(Apr)，并含有 5 种内切酶的单一切点。如果将 DNA 片段插入 EcoRI 切点，不 会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将 DNA 片段插入到 HindIII、BamHI 或 SalI 切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有 DNA 插入片段的 pBR322 将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有 DNA 插入片段的 pBR322 会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素， 而没有 pBR322 质粒的细菌将对氨苄
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青霉素和四环素都敏感。pSC101 与 pBR322 相似，只是没有抗氨苄青霉素基因 和 PstI 切点。质粒运载体的最大插入片段约为 10kb(kb 表示为千碱基对)。 pGEX-4T1 是 pGEX 载体系列的一种，载体图如图 2 所示，这类载体是溶蛋 白表达、纯化和检测为一体的整合系统。具有以下优点：有一个可以
用化学物质 （IPTG）诱导的高效表达的 tac 启动子；一个 lacIq 基因以便通用于所有 E.coli 宿主中；一个 AmpiR 基因以便于阳性克隆的筛选。
pGEX-4T1 载体示意图
2．感受态细胞：重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受 体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入 过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方 面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系， 另一方面还与受体菌是 否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源 DNA 片段并实现其转 化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环 境因子的影响。cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca2+也可大大促进转
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化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态 细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体 积 15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期 6 个月） 。
3.转化:是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状 的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的 DNA 分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现 新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株， 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击 处理将载体 DNA 分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体 DNA 分子导入受体细胞。
二、碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒， 是从事分子生物学研究的实验室每天都要用 的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液 I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液 II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N 相当于 g/L，是当量浓度) 溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液 I 的作用 任何生物化学反应， 首先要控制好溶液的 pH， 因此用适当浓度的和适当 pH 值 的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来 加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子 不可思议， 的底部。 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂， 配在分子生物学试剂 在溶液 I 中加入 EDTA 中的主要作用是： 抑制 DNase 的活性， 和抑制微生物生长。
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是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，菌体一定要悬浮均匀，不 能有结块。 溶液 II 的作用 这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2％的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH，是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减 弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了 碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle （微囊） 结构的相变化所导致。 用了不新鲜的 0.4 N NaOH， 即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然 也能抽提得到少量质粒， 因为 SDS 也是碱性的， 只是弱了点而已。 很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一 些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解 的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两 点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断 裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带 来麻烦。 溶液 III 的作用 溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，与 SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate） SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS） ，而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液 III 加入后的 沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的 盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸 上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白 质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程 不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了， 尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。 2 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要 中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50－100 kb 大小的片断，就没有办
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法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后 得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓 的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被 沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。 NaOH 本来是为了溶解细胞而用的， DNA 分子
的变性其实是个副 产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放 置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。 酚/氯仿纯化 不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白 质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到 质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里 用 25/24/1 的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的， 这里做个全面的介绍。（Phenol） 酚 对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉， 但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M 的异硫氰酸胍） ， 离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比 重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互 溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应 （比如限制性酶切反应） ，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水 相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微 量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。 至于异 戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相 的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，在室温放 置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一 长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收，所以不要 过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA 分子之间就容易形成 氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70％的乙醇多洗几次，每次 在室温放置一个小时以上，并用 tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质 粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的
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RNA 会干扰电泳结果的。 质粒检测 琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不 要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含 线性 DNA，不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到 线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快 慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在 了一起） 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动 得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠
杆菌基因组 DNA 的片断。 非常偶 然的是，有时候抽提到的质粒会有 7－10 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致 了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。 三、实验步骤 1．大肠杆菌感受态细胞的制备（可临用前准备，也可制备多管加甘油冻存 -80℃） （1） 从新鲜的DH5α菌株平板上挑取一个单菌落， （接种到4ml LB液体培养 基中）37℃，180rpm培养过夜。 （2）次日按照1：100的比例转接培养物于20mlLB液体培养基当中，37℃， 180rpm培养至OD值达到0.4-0.6。 （3）取培养物1ml到1.5ml 离心管中，冰浴10min，5000rpm离心5min收集菌 体。 （4）弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌体（在涡旋器上振荡） ， 冰浴30min。 （5）5，000rpm离心10min后弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 100ul。 （6）温和混匀后4℃放置24-48h备用。 2．质粒的转化 （1）取制备好的感受态菌体，加入质粒5ul（可变） 。 （2）冰浴30min后，42℃水浴热激90s（温度准确，速度要快把握好时间） 。 （3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液体培养基。 （4）37℃，150rpm复苏1h。
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（5）取10ul培养物涂布于含有抗生素的LB（由质粒的抗性决定） ，37℃倒置 培养。 （对照组不加抗生素） 3．质粒提取（或用试剂盒提取） （1）从4℃拿出长满菌体的LB平板，打开培养皿，用在酒精灯上烧过的镊 子夹取100ul的吸头挑取单菌落，之后把带有菌落的吸头放入带有抗生素的LB液 体培养基（4ml或10ml，认真标记）37℃振荡培养过夜。 （若是第二天进行二次 活化，则按照1：20的比例接种培养基，37℃振荡培养3小时，记得加抗生素） 。 （2） 取1ml菌液加入1.5ml的离心管中， 认真标记后把剩余的菌液冻存 （0.5ml 的菌液，0.5ml纯的甘油，认真标记）12，000rpm离心5min收集菌体。 （3）5000rpm 离心 5min 收集菌体，弃上请后再离心 5s,吸取残余的上清。 （4）向每个离心管中各加入 100ul 预冷的溶液Ⅰ,在混悬器上振荡使菌体充 （在冰上） 分悬浮，分散。 （5）再向每个离心管中各加入 200ul 新配制的溶液Ⅱ，缓慢倒转几次混匀。 （在冰上） （6）向每个离心管中各加入 150ul 溶液Ⅲ，缓慢倒转几次混匀。 （在冰上） （7）12，000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。 （8）向每个离心管中各加入酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） ，颠倒混匀后12， 000rpm离心10min。 （9）吸取上清（注意不要吸到中间层）到1.5ml离心管中，加入2倍体积预 冷的无水乙醇， 于-20℃放置20-30min （或室温放置10min） 000rpm离心10min， 12， 弃上清， （小心不要把质粒倒掉） （10） 加1ml 70％乙醇洗涤沉淀 （来回颠倒旋转几次） 12， ， 000rpm离心3min， 弃上清，室温干燥20min，
将沉淀溶于20ul的TE或水中，-20℃备用。
注：一般在第二步离心收集完菌体后再加入 1mlSTE，充分洗涤菌体，12，000rpm，离 心 1～2min。
4．质粒检测琼脂糖凝胶电泳 核酸 DNA 在 PH 高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 琼脂糖具有多孔的网状结构， 不同大小的核酸分子利用凝胶的分子筛效应得以分 开。实践中观察琼脂糖凝胶中 DNA 是利用荧光染料溴化已锭（EB）将 DNA 染
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色。溴化已锭与 DNA 结合，在 254nm 波长的紫外灯下呈现橙黄色的荧光条带。 （1）以配制浓度为 1%胶为例：取一个 50ml 锥形瓶（制胶专用） ，加入 0.5g 琼脂糖后加 1×TAE 至 50ml 放入微波炉内加热（火力中高，时间 3min） ，待液体 沸腾后拿出锥形瓶（注意不要烫住手） ，用吸取 50ul 的 EB（1：1000）加入锥形 瓶内。等到锥形瓶不烫手后向制胶板内倒胶，高度不要漫过制胶板沿，冷却，待 胶凝固后拔出梳子。 （2）配制电泳液：取一个 500ml 的广口瓶，加入 10ml 50×TAE，加双蒸水 至 500ml。 （3）待胶板放进电泳槽后向电泳槽内加入配好的电泳液，高度漫过胶板 1mm。 （4）点样：拿出裁成长条的称量纸光面向上（或一次性手套） ，用 10ul 移 液器吸取 3ul 的质粒，打在称量纸上，再用 10ul 移液器吸取 2ul 的上样缓冲液和 质粒混匀，吸取混合液 5ul 打入点样孔。 （5）电泳：接通电源，电压设定在 80v（可变） ，开始电泳。 （6）凝胶系统成相：等到指示剂快跑到胶板前沿时关闭电源，拿出胶板， 放在暗箱内， 打开与暗箱相连的电脑， 进入摄像软件， 进行摄像， 然后保存照片。
注：DNA 分子的大小 在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比， 因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的 大小。但是当 DNA 分子大小超过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁 移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 时，分子大小不宜超过此值。 琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的 DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 不同 浓度 琼脂糖凝胶分离 DNA 片段的范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状 DNA 大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
四、溶液配方（详细参考分子克隆实验指南） LB 液体培养基： 每配制 1000ml 加入胰蛋白胨 10g、 酵母提取物 5g、 NaCl 10g。 LB 固体培养基： 每配制 1000ml 加入胰蛋白胨 10 g、 酵母提取物 5g、 NaCl 10g、 琼脂糖 1.5g。
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溶液Ⅰ：50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅱ：0.2 M NaOH(临用前用 10 M 贮存液稀释)，10%SDS
(现用现配)。 溶液Ⅲ：60ml 5 M 乙酸钾，11.5ml 冰乙酸，28.5ml 水。 TAE(50×)：242g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，用时 稀释 50 倍。 加样缓冲液(6×)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。 溴化乙锭（或其无毒替代品） ：10mg/ml。 RNA 酶 A 母液： RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 将 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。 STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 五、常见问题 1. 加入 solution.III，经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液 面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？ 细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细 菌蛋白和细菌基因组 DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用 量增加。 2.加入 soln.III，经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状， 上清较少？ （1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用 量减半。 （2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法： 注意将细菌悬浮充分。 （3）加 Solution III 后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注 意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀 呈松散的豆腐花状)。 （4）Solution II 出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于 15℃，使 用试剂盒前请注意观察 Solution 水浴溶解沉淀后再使用。 II 中是否出现沉淀。 如果出现沉淀， 请于 37℃
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（5）Solution II 长时间暴露于空气中被 CO2 中和，导致菌体未能被有效 裂解。 解决方法： 可用经典碱裂解法抽提质粒 DNA 方法中的 II 液替代 II 使用。 3.出现严重的 RNA 污染？ （1）未在 Solution I 中事先加入 RNase A1。解决方法：补加 RNase A1。 （2）加入 RNase A1 的 Solution I 长期保存于室温，导致 RNase A1 活性 下降。 （3）细菌过量,RNase A1 不能有效降解 RNA。解决方法：将细菌用量减 半或增加 RNase A1 在 Solution I 中的浓度。 4.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？ （1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步 Rinse A 洗涤步骤以 彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒 DNA 进行乙醇沉淀。 （3） 质粒 DNA 在 Solution II 中暴露过久， 易造成质粒 DNA 的切口断裂。 裂解步骤控制在 5 分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现基因组 DNA 的
污染？ （1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组 DNA 断裂所致。解决 方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 （2）加 Solution II 时操作时间过长，造成基因组 DNA 断裂所致。解决方 法：将裂解步骤控制在 5 分钟内完成。 （3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的 细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组 DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时 DNA 飘出加样孔外？ 忽略或省略了高速离心以甩干残留的 Rinse B 的操作步骤。解决方法：按 说明书的操作步骤操作以确保残留的 Rinse B 被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8.质粒为何会丢失？ Solution
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细菌培养不要超过 16 小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致 质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成 质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗 生素使用浓度是否正确。
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