微生物培养基
一、培养基的定义
培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。广义上说，凡是支持微生物生长和繁殖的介质或材料均可作为微生物的培养基。
二、培养基配制的原则
1. 营养物质应满足微生物的需要
2. 营养物的浓度及配比应恰当
3. 物理化学条件适宜
4. 根据培养的目的
三、培养基的类型
1．按纯度分类
（1）合成培养基
优点是：成分已知、精确、重复性好。但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。
（2）天然培养基
优点是配制方便、经济、营养丰富，但是，它的化学成分不清楚或不稳定(受产地、品种、保存加工方法等因素影响) 。
常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。
（3）半合成培养基
由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成。
特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。
2. 按状态分类
（1）固体培养基
固体培养基一般是指液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基。此外，固体营养物(如麸皮、米糠、木屑、土豆块、玉米粉) 与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属于固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。在发酵工业中常用固体培养基进行固体发酵
（2）液体培养基
各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是也常利用液体培养基。
（3）半固体培养基
半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。
3. 按用途分类
（4）发酵培养基
一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。
（5）种子培养基
一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。
（6）孢子培养基
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，耐这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异，所以对孢子培养基的基本配制要求如下：①营养不要太丰富(特别是有机氮源) ；2所用无机盐的浓度要适量，；③要注意培养基的pH 和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。
四、发酵培养基的成分
1. 碳源
其主要功能有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。
A 糖类
是发酵培养基中最广泛应用的碳源，主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等。
B 油和脂肪
常用的油有豆油、菜油、葵花子油、猪油、鱼油、棉子油等。
C 有机酸
D 烃和醇类
2. 氮源
有机氮源 常用的有机氮源有花生饼粉，黄豆饼粉，棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。
有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，常用的有机氮源的营养成分见p103表4-5。
无机氮源 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。
3. 无机盐及微量元素
微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐和微量元素如磷、镁、硫，钾、钠、铁、氯、锰、锌、钻等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。
磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者——三磷酸腺苷的成分.
镁除了组成某些细胞叶绿素的成分外，并不参与任何细胞物质的组成。
硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，如辅酶A 、硫锌酸和谷胱甘肽等。
铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。 氯离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是需要的。
钠、钾、钙离子虽不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养基的必要成分，钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠盐，但用量不能过高，否则会影响微生物生长。
钙离子能控制细胞透性，它不能逆转高浓度无机磷对某些产品如链霉素等的抑制作用。
锌、钻、锰、铜等微量元素大部分作为酶的辅基和激活剂，一般来讲只有在合成培养基中才需加入这些元素。
4. 水
水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。
5. 生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂
生长因子不是对于所有微生物都必须的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
四、培养基的设计和优化
1. 培养基成分选择的原则
（1）菌体的同化能力 碳源和氮源
（2）代谢的阻遏和诱导
（3）合适的C ：N 比 氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH 偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。
（4）pH 的要求
2. 优化方法
许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型
、单次试验、全因子法、部分因子法、Plackett and Burman法等。 2.1 单次单因子法
实验室最常用的优化方法是单次单因子(one-variable-at-a-time)法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。
2.2 多因子试验
多因子试验需要解决的两个问题1) 哪些因子对响应具有最大(或最小) 的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
2.2.1 正交实验设计
正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。
正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平结合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应面值的最优值。
正交方法可以用来分析因素之间的交叉效应，但需要提前考虑那些因素之间存在交互作用，再根据考虑来设计实验。因此，没有预先考虑的两因素之间即使存在交互作用，在结果中也得不到显示。
对于多因素、多水平的科学试验来说，正交法需要进行的次数仍嫌太多，在实际工作中常常无法安排，应用范围受到限制。
2.2.2 均匀实验设计
如果仅考虑“均匀分散”，而不考虑“整齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。均匀设计按均匀设计表来安排实验，均匀设计表在使用时最值得注意的是均匀设计表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的最后一个水平与第一个水平衔接起来，组成一个封闭圈，然后从任一处开始定为第一个水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平。均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。例如一项５因素10水平的试验，若用正交设计需要做102次试验，而用均匀设计只需做10次，随着水平数的增多，均匀设计的优越性就愈加突出。这就大大减少了多因素多水平试验中的试验次数。
2.2.3 Plackett-Burman法
Plackett-Bunnan 设计法是一种两水平的实验优化方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。理论上Plackett-Bunnan 设计法可以达到99个因子仅做100次试验，但该法不能考察各因子的相互交互作用。因此，它通常作为过程优化的初步实验，用于确定影响过程的重要因子。许多文献都对此有报道。Castro PML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma 干扰素（gammainterferon ）的产量提高了45%。
2.2.4 部分因子设计法
部分因子设计法与P1ackett-Burman 设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman 设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman 设计法只需要7次实验。
2.2.5 响应面分析法
响应面分析（response surfaceanalysis，RSM ）方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。它与“正交设计法”不同，响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间，因子与因子之间的相互关系，并进行优化。近年来较多的报道都是用响应面分析法来优化发酵培养基，并取得比较好的成果。
RSM 有许多方面的优点，但它仍有一定的局限性。首先，如果将因素水平选的太宽，或选的关键因素不全，将会导致响应面出现吊兜和鞍点。因此事先必须进行调研，查询和充分的论证或者通过其它试验设计得出主要影响因子；其次，通过回归分析得到的结果只能对该类实验作估计；第三，当回归数据用于预测时，只能在因素所限的范围内进行预测。响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。
中心组合设计是一种国际上较为常用的响应面法，是一种5水平的实验设计法。采用该法能够在有限的实验次数下，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响过程的最佳条件。
动物培养基
一、培养基必须供给活细胞所需要的下列基本物质：
1．碳水化合物
碳水化合物是细胞生长的主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
2．氨基酸
氨基酸是组成蛋白质的基本单位。有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺除了作为氮源、碳源，还具有特殊作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良会导致死亡。
3．维生素
培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、吡哆醛、核黄素、硫胺素及B 12：等。这些维生素在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。维生素C 也是不可少的，它对具有合成胶原能力的细胞尤为重要，但维生素c 易氧化而不稳定，在长期培养中如何维持它的持久效应，尚待进一步研究。脂溶性维生素有维生素A 、维生素D 、维生素E 和维生素K 等，对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。
4．无机盐
培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。无机离子是细胞的重要组分，它们在调节细胞代谢、促进细胞生长发育和维持细胞生理功能等方面有重要作用。无机离子还是某些维生素、激素、酶形成过程中不可缺少的原料。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
5．促生长因子
培养液中除上述营养成分外，同样也需要激素类物质，尤其需要促细胞生长因子。
血清是提供生长因子和其他细胞所需物质的来源，现已从血清、各种组织和其他生物成分中，用生物工程方法制取出多种促细胞生长物并已商品化，如表皮生长因子(Epidermal
Growth Factor)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor)、神经生长因子Nerve Growth
Factor) 、血小板生长因子(Platelat Derived Growth Factor)、软骨生长因子(Cartilage Derived
Growth Factor)、内皮细胞生长因子(Endothelial Cell Growth Factor)、骨生长因子(Skeletal GrowthFactor)等。
6．其他物质
细胞生长中，除需钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等。有资料证明，还需铜、锰、钼、钒等元素，但均尚未明确所需用量，因此在培养液中尚未作为固定成分应用，而且在未知这些元素的情况下，细胞也能增殖生长，这可能是由于在非限定物血清中含有少量这些元素，从而得到补充的缘故。
在较为复杂的培养液中还包含核酸降解物，如嘌呤和嘧啶类，以及氧化还原剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽等。有的培养液中还直接采用了三磷酸腺苷(ATP)和辅酶A 。
二、动物培养基的种类
按其物质状态，分半固体培养基(如琼脂培养基) 和液体培养基两类。液体培养基是最主
要的。按其来源，则可以分天然培养基和合成培养基。
天然培养基(Natural Medium)
天然培养基包括：血清(Serum)、组织提取液，如鸡血浆，鸡胎汁等。其中血清仍为组织培养中广泛应用的最为重要的天然培养基。血清之所以成为培养中不可少的成分，主要是因为血清中含有很多种不可缺少的能维持细胞生长增殖的成分。
(一) 血清
1．血清的种类：血清分为人血清和动物血清两大类，细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基。 2．血清成分：血清是一种很复杂的混合物，其组成成分虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
(1)蛋白质是牛血清中的主要成分。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白之外，主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素促进细胞附着；仅2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
(2)多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
(3)激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素可以促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子能够与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素起促细胞增殖效应。氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖作用。但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
(4)其他成份：血清中还含有氨基酸、葡萄糖、酮酸、微量元素等营养物质。有实验表明，与蛋白相结合的微量元素对细胞培养有意义。
合成培养基
(一) 基本培养基
1．基本培养基的种类： RPMI 1640类培养基。不
MEM Eagle培养液，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和八种维生素，
成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系的培养。同时，易于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。在它们的基础上，后又改良成BME(Basal Medium Eale ：BME) 和DMEM(Dulbecco MEM) 二种培养液，应用也十分广泛。
2．基本培养的成分：基本堵乔基的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 和一些其他辅助物质。
(二) 无血清培养基(Serum—free Medium，SFM)
这些培养基中主要增添了促细胞生长因子，当前发现的各种促细胞生长因子已达几十种之多。另外还有三碘甲状腺素、转铁蛋白以及大鼠颌下腺粗提取物等，都有促细胞生长增殖作用。利用上述促细胞生长物质的组合与合成的附加物，再与基本培养基相混合，便构成无血清培养基，对细胞有良好的促生长效应。无血清细胞培养基保证了实验结果的准确性、重复性和稳定性，减少了血清带来的细胞的污染机会；简化了提纯、精制和鉴定单克隆抗体(McAb)、淋巴因子、干扰素等细胞产物的程序，降低疫苗反应。如MCDB 系列无血清培养基、Uhroser G等。
无血清培养基由以下成分组成：
1．基础培养液：为无血清培养基的基础溶液，有很多种人工合成的培养基可供选择，多使用的是HamFl2和DMEM 培养液(二者以1：1相混合) ，然后再补加15mM 的HEPES
129／L NaHCO。作为基础溶液。然后根据不同细胞的要求，再补加其他附加配套成分。无血清培养基内由于缺乏天然成分中的大分子物质对细胞的保护作用，细胞生存在这样的培养液，对外界刺激耐受性较差。因而对配制溶液的蒸馏水要求较高，必须要使用高纯度的蒸馏
水。一般都要使用三次蒸馏以上的蒸馏水，而最后一次蒸馏应在配制前制备后立即使用。有
人认为这是无血清培养的关键之一。
2．附加成分：一般根据细胞的生长条件和实验的要求，在基础培养液内尚须添加一定量的其他成分。这些附加成分主要有三类。一类是细胞外基质(Extracellular Matrix：ECM) 类，能帮助细胞附着和贴壁。另一类是营养成分，是细胞生长和代谢所必需的。第三类是促细胞生长增殖的生长因子。此外有时还需添加酶的抑制剂，以保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。目前常用的ECM 主要有纤维粘连蛋白(Fibroneetin)、多聚赖氨酸(Polylysine)，配制浓度为lmg ／mL ，溶解在PBS 中，一20。C 保存。促贴壁附着成分主要有纤维粘连蛋白和层粘连蛋白。促生长增殖成分主要有转铁蛋白质、硒酸钠(Na2SeO，) 、胰岛素等。蛋白酶抑制物主要有大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor)，使用的浓度为0．1％一0．5％，通常配制在DMEM ／F12的基础培养液内。
(三) 无蛋白培养基(Protein—free Medium，PFM)
无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基有广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果在生产过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这一发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
(四) 限定化学成分培养基(Chemical—defined Medium CDM)
限定化学成分培养基是指培养基中的所有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO 细胞、杂交瘤细胞生长的CDM 问世，上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM 。
植物培养基
一、培养基的营养成分
培养基是外植体生长的营养物质，通常有两个组成部分。一是基本培养基，包括大量元 素和微量元素(无机盐类) 、维生素、氨基酸和无菌水等。如MS 、改良MS 、White 、Nitsch 、N6、B5等基本培养基。二是附加物质，即在基本培养基的基础上，根据实验要求，附加一些物质。如添加各种植物生长调节物质
[6一苄基氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(zT)、激动素(KT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)等]以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁和酵母提取物等。
1．无机盐
植物必需元素在体内的生理作用主要有四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢，如构成植物激素、酶、辅酶以及作为酶的活化剂等；三是这些元素之间互相协调，以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；四是在发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官的建成，如钾元素促进胡萝卜细胞分化不定芽，在缺铁时烟草花粉胚的形成极少，并且不能发育到球形胚以后的阶段。
无机盐可为植物生长发育提供必需的化学元素。在植物组织培养时，各种营养物质主要是从培养基中获得，如O 、H 从水中得到，矿质元素由适量的无机盐类物质提供。培养基中除了C 、H 、O 元素外，还有矿质元素，包括N 、P 、K 、S 、Ca 、Mg 等大量元素和Fe 、
Mn 、Zn 、Cu 、B 、Mo 、Co 等微量元素。
(1)大量元素 在矿质营养中氮
(N)是最重要的。一般用硝态氮或氨态氮，即无机氮在培养基中有两种供应方式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。磷(P)．对植物的生命活动具有十分重要的作用，缺P 时蛋白质含量降低。K 、Ca 、Mg 、S 等元素能影响植物组织酶的活性，决定着新陈代谢的过程。
(2)微量元素 微量元素主要包括Fe 、Mn 、Zn 、Cu 、Mo 、Co 、B 等多种元素。微量元素在植物体内含量占干重的0．01％以下，但是它们却对植物组织的生命活动有重要作用。如B 元素影响蛋白质的合成和受粉受精；Cu 元素有促进离体根生长的作用；Mn 元素与呼吸作用和光合作用有关。
(3)铁盐 铁(Fe)盐是用量较多的一种无机盐类物质，对植物组织叶绿素的合成和
延长生长起重要的作用。
2．有机化合物
主要包括碳源(能源) 、维生素类、氨基酸及其他有机附加物。
(1)碳源
碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。一般来说，蔗糖是最好的碳源，它具有热易变(heat—liable) 的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D 葡萄
糖、D 一果糖，只剩下部分的蔗糖，这更有利于吸收和利用。此外，也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。也有利用多糖类的可溶性淀粉和糊精以及果胶的报道。
糖的最适宜浓度根据培养目的不同而不同，常用的糖浓度为2％～5％。糖的浓度不只是对细胞的增殖有作用，同时也是影响细胞分化的因素之一。
(2)维生素类 维生素直接参加生物催化剂即酶的形成，以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。
(3)氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源。常用的氨基酸有甘氨
酸、酰胺类物质(如谷氨酰胺、天冬酰胺) ，有时还加谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸
和酪氨酸，以及多种氨基酸的混合物(如水解酪蛋白、水解乳蛋白) 等。
(4)天然复合物 天然复合物的成分比较复杂，大多数含有氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。实验的重复性。如有可能，应尽量使用可定量的合成有机物，避免使用这些天然物质。特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了天然复合物的使用范围。
(5)植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中不可缺少的成分，对外植体的生长和分化起着决定性作用，其中影响较显著的植物生长调节物质主要是生长素类和细胞分裂素类物质。生长素类物质影响茎尖和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等过程。在组织培养中生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。生长素类中的吲哚乙酸
(IAA)由于较易被氧化，因此常用的是2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D) 、萘乙酸(NAA)、吲
哚丁酸(IBA)。诱导愈伤组织可用2，4一D 、NAA ，诱导生根用IBA 效果较好。使用浓度因生长素种类而异，2，4一D 的作用比较剧烈，使用的浓度范围较窄，NAA 和IBA 的使用浓度可以高些。
细胞分裂素类物质在组织培养中的主要作用是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。细胞分裂素还能显著改变其他植物生长调节物质的作用。因此，在培养基中加入细胞分裂素可促进植物细胞的分裂和不定芽的形成，打破顶端优势形成丛生芽，有利于芽的增殖，常用于继代和增殖培养。
3．培养基的PH
大多数植物适宜的pH 为5．6～6．0。培养基pH 的变化会影响到一些离子的溶解度，使一些溶解度小的盐类沉淀，影响到 植物对各元素的吸收比例，甚至出现缺素症。 4。其他成分在培养基中往往因培养目的以及所培养植物材料的不同而加入一些其他成分。目前较常见的有活性炭、抗生素类、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂等。
二、培养基的种类
1．按培养基中培养材料的支撑物的有无分类
在培养基的组成中，除上述各种试剂外，为使培养材料在培养基上固定和生长，需要附加一些支撑物。若加入适量的凝固剂(琼脂、明胶等) ，则构成固体培养基，如果未加入凝固剂，即为液体培养基。
2．根据培养基中的成分、元素的浓度含量等特点分类
迄今世界上已研制出许多基本培养基配方，这些配方既有共性，又有特异性。依据培养基的成分、元素的浓度含量等特点可把它们分为以下4类。
(1)高盐成分培养基 这类培养基包括MS 培养基(Murashige和Skoog ，1962) 、LS
培养基(Linsmaier和Skoon ，1965) 、BL 培养基(Brown和Lawrence ，1968) 、BM 培养基
(Button，1975) 、ER 培养基(Eriksson，1965) 等，其特点是：①无机盐浓度高，元素间
的比例较适合、缓、冲．性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡；②营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机成分；③微量元素种类较全，浓度较高。应用较广泛，钾盐、铵盐和硝酸盐含量均较高，故又称富集元素平衡培养基。其中的MS 培养基应用最广泛，其营养成分和比例均比较合适，广泛用于植物的器官、细胞、组织和原生质体培养，也常用在植物脱毒和快繁等方面。
(2)硝酸盐含量较高的培养基 有B5、N6、LH 、GS 等培养基。这类培养基的特点
是：a ．硝酸钾的含量高；b ．氨态氮的含量低(高铵对有些植物有抑制作用) ；C ．含有较高的盐酸硫胺素。
①B5培养基(Gamborg等，1968) 。除含有较高的钾盐外，还含有较低的氨态氮和较高的盐酸硫胺素，较适合南洋杉、葡萄、豆科及十字花科等植物的培养。
②N6培养基(朱至清等，1975) 。适用于单子叶植物的花药培养，柑橘类花药培养也
较好，在楸树、针叶树等植物的组织培养中使用较多。
③SH 培养基(Sckenk和Hildebrandt ，1972) 。这是盐类浓度较高的一种培养基，其
中铵与磷酸是由磷酸二氢铵提供的。
(3)中等无机盐含量的培养基其特点是：a ．大量元素无机盐约为MS 培养基的一半；
b ．微量元素种类减少而含量增高；C ．维生素种类比MS 培养基多，如增加生物素、叶酸等。
①H 培养基(Bourgin和Nitsh ，1967) 。该培养基大量元素约为MS 培养基的一半，仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低，微量元素种类少，而含量较MS 培养基高，维生素种类也比MS 培养基的多，适用于花药培养和枣类的培养。
②尼厅(Nitsch，1969) 培养基。与H 培养基基本相同，仅生物素比H 培养基高10
倍，也适合于花药培养。
③米勒(Miller，1963) 培养基。适合于大豆愈伤组织培养和花药培养等。
④Rlaydes(1966)培养基。
(4)低无机盐类培养基 此类培养基大多数情况下用于生根培养，其特点为：a ．无机盐含量很低，一般为MS 培养基的1／4左右；b ．有机成分含量也很低；c ．多数情况用作生根培养基。包括以下几种。 ，
①改良White 培养基。
②WS(Wolter和Skoog ，1966) 培养基。
③克诺普液。多用于花卉培养。
④HB(Holly和Baker ，1963) 培养基。此培养基在花卉脱毒和木本植物的茎尖培养
中效果良好。其大量元素比1／2的克诺普液稍多，微量元素是贝尔什劳特液的一半。
3．常用的基本培养基
常用的基本培养基为MS 、B5、White 等。
培养基对药品、糖、琼脂和水质有一定的要求，特别是进行科学实验时一般采用分析纯(AR，二级) 或化学纯(CP，三级) 试剂，以防含有有毒有害杂质而影响培养效果，但一
般的生产性育苗可以用食用白糖代替分析纯蔗糖。
微生物培养基
一、培养基的定义
培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。广义上说，凡是支持微生物生长和繁殖的介质或材料均可作为微生物的培养基。
二、培养基配制的原则
1. 营养物质应满足微生物的需要
2. 营养物的浓度及配比应恰当
3. 物理化学条件适宜
4. 根据培养的目的
三、培养基的类型
1．按纯度分类
（1）合成培养基
优点是：成分已知、精确、重复性好。但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。
（2）天然培养基
优点是配制方便、经济、营养丰富，但是，它的化学成分不清楚或不稳定(受产地、品种、保存加工方法等因素影响) 。
常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。
（3）半合成培养基
由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成。
特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。
2. 按状态分类
（1）固体培养基
固体培养基一般是指液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基。此外，固体营养物(如麸皮、米糠、木屑、土豆块、玉米粉) 与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属于固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。在发酵工业中常用固体培养基进行固体发酵
（2）液体培养基
各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是也常利用液体培养基。
（3）半固体培养基
半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。
3. 按用途分类
（4）发酵培养基
一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。
（5）种子培养基
一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。
（6）孢子培养基
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，耐这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异，所以对孢子培养基的基本配制要求如下：①营养不要太丰富(特别是有机氮源) ；2所用无机盐的浓度要适量，；③要注意培养基的pH 和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。
四、发酵培养基的成分
1. 碳源
其主要功能有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。
A 糖类
是发酵培养基中最广泛应用的碳源，主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等。
B 油和脂肪
常用的油有豆油、菜油、葵花子油、猪油、鱼油、棉子油等。
C 有机酸
D 烃和醇类
2. 氮源
有机氮源 常用的有机氮源有花生饼粉，黄豆饼粉，棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。
有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，常用的有机氮源的营养成分见p103表4-5。
无机氮源 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。
3. 无机盐及微量元素
微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐和微量元素如磷、镁、硫，钾、钠、铁、氯、锰、锌、钻等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。
磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者——三磷酸腺苷的成分.
镁除了组成某些细胞叶绿素的成分外，并不参与任何细胞物质的组成。
硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，如辅酶A 、硫锌酸和谷胱甘肽等。
铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。 氯离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是需要的。
钠、钾、钙离子虽不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养基的必要成分，钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠盐，但用量不能过高，否则会影响微生物生长。
钙离子能控制细胞透性，它不能逆转高浓度无机磷对某些产品如链霉素等的抑制作用。
锌、钻、锰、铜等微量元素大部分作为酶的辅基和激活剂，一般来讲只有在合成培养基中才需加入这些元素。
4. 水
水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。
5. 生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂
生长因子不是对于所有微生物都必须的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
四、培养基的设计和优化
1. 培养基成分选择的原则
（1）菌体的同化能力 碳源和氮源
（2）代谢的阻遏和诱导
（3）合适的C ：N 比 氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH 偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。
（4）pH 的要求
2. 优化方法
许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型
、单次试验、全因子法、部分因子法、Plackett and Burman法等。 2.1 单次单因子法
实验室最常用的优化方法是单次单因子(one-variable-at-a-time)法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。
2.2 多因子试验
多因子试验需要解决的两个问题1) 哪些因子对响应具有最大(或最小) 的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
2.2.1 正交实验设计
正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。
正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平结合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应面值的最优值。
正交方法可以用来分析因素之间的交叉效应，但需要提前考虑那些因素之间存在交互作用，再根据考虑来设计实验。因此，没有预先考虑的两因素之间即使存在交互作用，在结果中也得不到显示。
对于多因素、多水平的科学试验来说，正交法需要进行的次数仍嫌太多，在实际工作中常常无法安排，应用范围受到限制。
2.2.2 均匀实验设计
如果仅考虑“均匀分散”，而不考虑“整齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。均匀设计按均匀设计表来安排实验，均匀设计表在使用时最值得注意的是均匀设计表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的最后一个水平与第一个水平衔接起来，组成一个封闭圈，然后从任一处开始定为第一个水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平。均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。例如一项５因素10水平的试验，若用正交设计需要做102次试验，而用均匀设计只需做10次，随着水平数的增多，均匀设计的优越性就愈加突出。这就大大减少了多因素多水平试验中的试验次数。
2.2.3 Plackett-Burman法
Plackett-Bunnan 设计法是一种两水平的实验优化方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。理论上Plackett-Bunnan 设计法可以达到99个因子仅做100次试验，但该法不能考察各因子的相互交互作用。因此，它通常作为过程优化的初步实验，用于确定影响过程的重要因子。许多文献都对此有报道。Castro PML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma 干扰素（gammainterferon ）的产量提高了45%。
2.2.4 部分因子设计法
部分因子设计法与P1ackett-Burman 设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman 设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman 设计法只需要7次实验。
2.2.5 响应面分析法
响应面分析（response surfaceanalysis，RSM ）方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。它与“正交设计法”不同，响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间，因子与因子之间的相互关系，并进行优化。近年来较多的报道都是用响应面分析法来优化发酵培养基，并取得比较好的成果。
RSM 有许多方面的优点，但它仍有一定的局限性。首先，如果将因素水平选的太宽，或选的关键因素不全，将会导致响应面出现吊兜和鞍点。因此事先必须进行调研，查询和充分的论证或者通过其它试验设计得出主要影响因子；其次，通过回归分析得到的结果只能对该类实验作估计；第三，当回归数据用于预测时，只能在因素所限的范围内进行预测。响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。
中心组合设计是一种国际上较为常用的响应面法，是一种5水平的实验设计法。采用该法能够在有限的实验次数下，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响过程的最佳条件。
动物培养基
一、培养基必须供给活细胞所需要的下列基本物质：
1．碳水化合物
碳水化合物是细胞生长的主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
2．氨基酸
氨基酸是组成蛋白质的基本单位。有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺除了作为氮源、碳源，还具有特殊作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良会导致死亡。
3．维生素
培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、吡哆醛、核黄素、硫胺素及B 12：等。这些维生素在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。维生素C 也是不可少的，它对具有合成胶原能力的细胞尤为重要，但维生素c 易氧化而不稳定，在长期培养中如何维持它的持久效应，尚待进一步研究。脂溶性维生素有维生素A 、维生素D 、维生素E 和维生素K 等，对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。
4．无机盐
培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。无机离子是细胞的重要组分，它们在调节细胞代谢、促进细胞生长发育和维持细胞生理功能等方面有重要作用。无机离子还是某些维生素、激素、酶形成过程中不可缺少的原料。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
5．促生长因子
培养液中除上述营养成分外，同样也需要激素类物质，尤其需要促细胞生长因子。
血清是提供生长因子和其他细胞所需物质的来源，现已从血清、各种组织和其他生物成分中，用生物工程方法制取出多种促细胞生长物并已商品化，如表皮生长因子(Epidermal
Growth Factor)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor)、神经生长因子Nerve Growth
Factor) 、血小板生长因子(Platelat Derived Growth Factor)、软骨生长因子(Cartilage Derived
Growth Factor)、内皮细胞生长因子(Endothelial Cell Growth Factor)、骨生长因子(Skeletal GrowthFactor)等。
6．其他物质
细胞生长中，除需钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等。有资料证明，还需铜、锰、钼、钒等元素，但均尚未明确所需用量，因此在培养液中尚未作为固定成分应用，而且在未知这些元素的情况下，细胞也能增殖生长，这可能是由于在非限定物血清中含有少量这些元素，从而得到补充的缘故。
在较为复杂的培养液中还包含核酸降解物，如嘌呤和嘧啶类，以及氧化还原剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽等。有的培养液中还直接采用了三磷酸腺苷(ATP)和辅酶A 。
二、动物培养基的种类
按其物质状态，分半固体培养基(如琼脂培养基) 和液体培养基两类。液体培养基是最主
要的。按其来源，则可以分天然培养基和合成培养基。
天然培养基(Natural Medium)
天然培养基包括：血清(Serum)、组织提取液，如鸡血浆，鸡胎汁等。其中血清仍为组织培养中广泛应用的最为重要的天然培养基。血清之所以成为培养中不可少的成分，主要是因为血清中含有很多种不可缺少的能维持细胞生长增殖的成分。
(一) 血清
1．血清的种类：血清分为人血清和动物血清两大类，细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基。 2．血清成分：血清是一种很复杂的混合物，其组成成分虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
(1)蛋白质是牛血清中的主要成分。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白之外，主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素促进细胞附着；仅2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
(2)多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
(3)激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素可以促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子能够与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素起促细胞增殖效应。氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖作用。但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
(4)其他成份：血清中还含有氨基酸、葡萄糖、酮酸、微量元素等营养物质。有实验表明，与蛋白相结合的微量元素对细胞培养有意义。
合成培养基
(一) 基本培养基
1．基本培养基的种类： RPMI 1640类培养基。不
MEM Eagle培养液，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和八种维生素，
成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系的培养。同时，易于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。在它们的基础上，后又改良成BME(Basal Medium Eale ：BME) 和DMEM(Dulbecco MEM) 二种培养液，应用也十分广泛。
2．基本培养的成分：基本堵乔基的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 和一些其他辅助物质。
(二) 无血清培养基(Serum—free Medium，SFM)
这些培养基中主要增添了促细胞生长因子，当前发现的各种促细胞生长因子已达几十种之多。另外还有三碘甲状腺素、转铁蛋白以及大鼠颌下腺粗提取物等，都有促细胞生长增殖作用。利用上述促细胞生长物质的组合与合成的附加物，再与基本培养基相混合，便构成无血清培养基，对细胞有良好的促生长效应。无血清细胞培养基保证了实验结果的准确性、重复性和稳定性，减少了血清带来的细胞的污染机会；简化了提纯、精制和鉴定单克隆抗体(McAb)、淋巴因子、干扰素等细胞产物的程序，降低疫苗反应。如MCDB 系列无血清培养基、Uhroser G等。
无血清培养基由以下成分组成：
1．基础培养液：为无血清培养基的基础溶液，有很多种人工合成的培养基可供选择，多使用的是HamFl2和DMEM 培养液(二者以1：1相混合) ，然后再补加15mM 的HEPES
129／L NaHCO。作为基础溶液。然后根据不同细胞的要求，再补加其他附加配套成分。无血清培养基内由于缺乏天然成分中的大分子物质对细胞的保护作用，细胞生存在这样的培养液，对外界刺激耐受性较差。因而对配制溶液的蒸馏水要求较高，必须要使用高纯度的蒸馏
水。一般都要使用三次蒸馏以上的蒸馏水，而最后一次蒸馏应在配制前制备后立即使用。有
人认为这是无血清培养的关键之一。
2．附加成分：一般根据细胞的生长条件和实验的要求，在基础培养液内尚须添加一定量的其他成分。这些附加成分主要有三类。一类是细胞外基质(Extracellular Matrix：ECM) 类，能帮助细胞附着和贴壁。另一类是营养成分，是细胞生长和代谢所必需的。第三类是促细胞生长增殖的生长因子。此外有时还需添加酶的抑制剂，以保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。目前常用的ECM 主要有纤维粘连蛋白(Fibroneetin)、多聚赖氨酸(Polylysine)，配制浓度为lmg ／mL ，溶解在PBS 中，一20。C 保存。促贴壁附着成分主要有纤维粘连蛋白和层粘连蛋白。促生长增殖成分主要有转铁蛋白质、硒酸钠(Na2SeO，) 、胰岛素等。蛋白酶抑制物主要有大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor)，使用的浓度为0．1％一0．5％，通常配制在DMEM ／F12的基础培养液内。
(三) 无蛋白培养基(Protein—free Medium，PFM)
无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基有广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果在生产过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这一发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
(四) 限定化学成分培养基(Chemical—defined Medium CDM)
限定化学成分培养基是指培养基中的所有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO 细胞、杂交瘤细胞生长的CDM 问世，上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM 。
植物培养基
一、培养基的营养成分
培养基是外植体生长的营养物质，通常有两个组成部分。一是基本培养基，包括大量元 素和微量元素(无机盐类) 、维生素、氨基酸和无菌水等。如MS 、改良MS 、White 、Nitsch 、N6、B5等基本培养基。二是附加物质，即在基本培养基的基础上，根据实验要求，附加一些物质。如添加各种植物生长调节物质
[6一苄基氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(zT)、激动素(KT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)等]以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁和酵母提取物等。
1．无机盐
植物必需元素在体内的生理作用主要有四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢，如构成植物激素、酶、辅酶以及作为酶的活化剂等；三是这些元素之间互相协调，以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；四是在发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官的建成，如钾元素促进胡萝卜细胞分化不定芽，在缺铁时烟草花粉胚的形成极少，并且不能发育到球形胚以后的阶段。
无机盐可为植物生长发育提供必需的化学元素。在植物组织培养时，各种营养物质主要是从培养基中获得，如O 、H 从水中得到，矿质元素由适量的无机盐类物质提供。培养基中除了C 、H 、O 元素外，还有矿质元素，包括N 、P 、K 、S 、Ca 、Mg 等大量元素和Fe 、
Mn 、Zn 、Cu 、B 、Mo 、Co 等微量元素。
(1)大量元素 在矿质营养中氮
(N)是最重要的。一般用硝态氮或氨态氮，即无机氮在培养基中有两种供应方式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。磷(P)．对植物的生命活动具有十分重要的作用，缺P 时蛋白质含量降低。K 、Ca 、Mg 、S 等元素能影响植物组织酶的活性，决定着新陈代谢的过程。
(2)微量元素 微量元素主要包括Fe 、Mn 、Zn 、Cu 、Mo 、Co 、B 等多种元素。微量元素在植物体内含量占干重的0．01％以下，但是它们却对植物组织的生命活动有重要作用。如B 元素影响蛋白质的合成和受粉受精；Cu 元素有促进离体根生长的作用；Mn 元素与呼吸作用和光合作用有关。
(3)铁盐 铁(Fe)盐是用量较多的一种无机盐类物质，对植物组织叶绿素的合成和
延长生长起重要的作用。
2．有机化合物
主要包括碳源(能源) 、维生素类、氨基酸及其他有机附加物。
(1)碳源
碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。一般来说，蔗糖是最好的碳源，它具有热易变(heat—liable) 的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D 葡萄
糖、D 一果糖，只剩下部分的蔗糖，这更有利于吸收和利用。此外，也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。也有利用多糖类的可溶性淀粉和糊精以及果胶的报道。
糖的最适宜浓度根据培养目的不同而不同，常用的糖浓度为2％～5％。糖的浓度不只是对细胞的增殖有作用，同时也是影响细胞分化的因素之一。
(2)维生素类 维生素直接参加生物催化剂即酶的形成，以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。
(3)氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源。常用的氨基酸有甘氨
酸、酰胺类物质(如谷氨酰胺、天冬酰胺) ，有时还加谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸
和酪氨酸，以及多种氨基酸的混合物(如水解酪蛋白、水解乳蛋白) 等。
(4)天然复合物 天然复合物的成分比较复杂，大多数含有氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。实验的重复性。如有可能，应尽量使用可定量的合成有机物，避免使用这些天然物质。特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了天然复合物的使用范围。
(5)植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中不可缺少的成分，对外植体的生长和分化起着决定性作用，其中影响较显著的植物生长调节物质主要是生长素类和细胞分裂素类物质。生长素类物质影响茎尖和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等过程。在组织培养中生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。生长素类中的吲哚乙酸
(IAA)由于较易被氧化，因此常用的是2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D) 、萘乙酸(NAA)、吲
哚丁酸(IBA)。诱导愈伤组织可用2，4一D 、NAA ，诱导生根用IBA 效果较好。使用浓度因生长素种类而异，2，4一D 的作用比较剧烈，使用的浓度范围较窄，NAA 和IBA 的使用浓度可以高些。
细胞分裂素类物质在组织培养中的主要作用是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。细胞分裂素还能显著改变其他植物生长调节物质的作用。因此，在培养基中加入细胞分裂素可促进植物细胞的分裂和不定芽的形成，打破顶端优势形成丛生芽，有利于芽的增殖，常用于继代和增殖培养。
3．培养基的PH
大多数植物适宜的pH 为5．6～6．0。培养基pH 的变化会影响到一些离子的溶解度，使一些溶解度小的盐类沉淀，影响到 植物对各元素的吸收比例，甚至出现缺素症。 4。其他成分在培养基中往往因培养目的以及所培养植物材料的不同而加入一些其他成分。目前较常见的有活性炭、抗生素类、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂等。
二、培养基的种类
1．按培养基中培养材料的支撑物的有无分类
在培养基的组成中，除上述各种试剂外，为使培养材料在培养基上固定和生长，需要附加一些支撑物。若加入适量的凝固剂(琼脂、明胶等) ，则构成固体培养基，如果未加入凝固剂，即为液体培养基。
2．根据培养基中的成分、元素的浓度含量等特点分类
迄今世界上已研制出许多基本培养基配方，这些配方既有共性，又有特异性。依据培养基的成分、元素的浓度含量等特点可把它们分为以下4类。
(1)高盐成分培养基 这类培养基包括MS 培养基(Murashige和Skoog ，1962) 、LS
培养基(Linsmaier和Skoon ，1965) 、BL 培养基(Brown和Lawrence ，1968) 、BM 培养基
(Button，1975) 、ER 培养基(Eriksson，1965) 等，其特点是：①无机盐浓度高，元素间
的比例较适合、缓、冲．性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡；②营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机成分；③微量元素种类较全，浓度较高。应用较广泛，钾盐、铵盐和硝酸盐含量均较高，故又称富集元素平衡培养基。其中的MS 培养基应用最广泛，其营养成分和比例均比较合适，广泛用于植物的器官、细胞、组织和原生质体培养，也常用在植物脱毒和快繁等方面。
(2)硝酸盐含量较高的培养基 有B5、N6、LH 、GS 等培养基。这类培养基的特点
是：a ．硝酸钾的含量高；b ．氨态氮的含量低(高铵对有些植物有抑制作用) ；C ．含有较高的盐酸硫胺素。
①B5培养基(Gamborg等，1968) 。除含有较高的钾盐外，还含有较低的氨态氮和较高的盐酸硫胺素，较适合南洋杉、葡萄、豆科及十字花科等植物的培养。
②N6培养基(朱至清等，1975) 。适用于单子叶植物的花药培养，柑橘类花药培养也
较好，在楸树、针叶树等植物的组织培养中使用较多。
③SH 培养基(Sckenk和Hildebrandt ，1972) 。这是盐类浓度较高的一种培养基，其
中铵与磷酸是由磷酸二氢铵提供的。
(3)中等无机盐含量的培养基其特点是：a ．大量元素无机盐约为MS 培养基的一半；
b ．微量元素种类减少而含量增高；C ．维生素种类比MS 培养基多，如增加生物素、叶酸等。
①H 培养基(Bourgin和Nitsh ，1967) 。该培养基大量元素约为MS 培养基的一半，仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低，微量元素种类少，而含量较MS 培养基高，维生素种类也比MS 培养基的多，适用于花药培养和枣类的培养。
②尼厅(Nitsch，1969) 培养基。与H 培养基基本相同，仅生物素比H 培养基高10
倍，也适合于花药培养。
③米勒(Miller，1963) 培养基。适合于大豆愈伤组织培养和花药培养等。
④Rlaydes(1966)培养基。
(4)低无机盐类培养基 此类培养基大多数情况下用于生根培养，其特点为：a ．无机盐含量很低，一般为MS 培养基的1／4左右；b ．有机成分含量也很低；c ．多数情况用作生根培养基。包括以下几种。 ，
①改良White 培养基。
②WS(Wolter和Skoog ，1966) 培养基。
③克诺普液。多用于花卉培养。
④HB(Holly和Baker ，1963) 培养基。此培养基在花卉脱毒和木本植物的茎尖培养
中效果良好。其大量元素比1／2的克诺普液稍多，微量元素是贝尔什劳特液的一半。
3．常用的基本培养基
常用的基本培养基为MS 、B5、White 等。
培养基对药品、糖、琼脂和水质有一定的要求，特别是进行科学实验时一般采用分析纯(AR，二级) 或化学纯(CP，三级) 试剂，以防含有有毒有害杂质而影响培养效果，但一
般的生产性育苗可以用食用白糖代替分析纯蔗糖。