在纳米孔径的中心放置单个分子
Stephan F. Heucke, †Fabian Baumann, †Guillermo P. Acuna, ‡Philip M. D. Severin, †Stefan W. Stahl, †Mathias Strackharn,†Ingo H. Stein,†Philipp Altpeter,†Philip Tinnefeld,*,‡and Hermann E. Gaub ††
Center for Nanoscience and Department of Physics, University of Munich, Amalienstrasse 54, 80799 Munich, Germany ‡Physical and Theoretical Chemistry - NanoBioScience, TU Braunschweig, Hans-Sommer-Strasse 10, 38106 Braunschweig, Germany
支持信息
摘要：虽然在单分子荧光的研究纳米光学器件显示了其潜力，但是在这些结构上的发生的淬火和空间位阻，对目标分子的特定地点固定化提高了要求。此处。我们通过光学超分辨率的常规方法来改善单分子剪切和粘贴技术，把单个荧光分子固定在纳米孔的中心。通过比较随机固定的荧光寿命和强度，在这些纳米孔表征其电力学环境来证明装载方法的毫微米级的精度。
关键词：纳米孔径，零模式波导，异常穿透，单分子剪切和粘贴， 单分子荧光，荧光寿命成像
单一酶的光学光谱对于他们的活动提供了独特的观察，但同时需要复杂的手段来满足高浓度的要求。一个显著的方法来克服的浓度限制是在零模式波导（ZMWs ）安置分子。 在不透明金属膜这些纳米孔的直径低于截止直径，也就是说比入射光的波长小一半。由此导致在孔的底部激发光所产生瞬逝场比衍射极限瞬逝场小3数量级。标准的纳米光刻技术使他们的大规模生产，纳米光子单分子技术的应用为单分子实时DNA 测序ZMWs 成为商业化的旗舰。单配位体的快速而明确的光学读出也导致了直接观察转化过程，蛋白质−交互, 甚至允许外来DNA 测序。
在所有这些研究中, 酶固定化来自解决方案导致低产量ZMWs 只有一个固定化酶。这个随机固定、单一占据可以最大化理论的泊松限制仅为37%。此外，由于固定化酶的随机分布举例直到荧光猝灭金属壁，荧光信号强度预计变化强烈。这进一步减少ZMWs 的分数, 可用于分析以及定量光谱测量生物分子过程。
在这里, 我们研究了这种各向异性通过将单个荧光分子ZMWs 首先在一个随机, 然后以一种受控制的方式。我们精制最近开发了单分子剪切和粘贴技术(SMC&P)超限分辨例程将单个荧光体粘贴到中心的纳米孔。相比, 大大减少了异构性随机固定演示了我们的技术的纳米精度同时另外提供第一个图片的空间差异的电动式环境零模波导。
描述个人荧光素纳米孔径的荧光性质, 单一的双链DNA 分子标记与一个ATTO647N 染料随机固定化在纳米孔在第一组实验中使用钝化金属墙和生物亲和素相互作用对纳米孔的底部和支持信息(图1) 。通过共焦荧光寿命成像, 我们量化的荧光强度和荧光寿命。图1 b 显示了假彩色荧光图像的单分子在150 nm纳米孔。在一个额外的背景频道, 绿色所示, 我们从金属包层和漏记录反射通过二向色滤使纳米孔可见作为一个昏暗的常规电网。不同强度的红点的纳米孔径表示与ATTO647N 从固定化DNA 分子标记的荧光。荧光体一直低的密度减少多个入住率的概率。此外, 单步在荧光光漂白瞬态记录最大的亮点, 比如c 如图1所示, 确认了荧光, 事实上, 可以归结于单一荧光体。不同强度的荧光斑点已经表明大量的异构性。这是进一步特征概率密度地图相关的荧光强度和荧光寿命超过1700染料固定在不同大小的纳米孔和一个玻璃参考面(图1 d) 。纳米孔, 玻璃的荧光寿命是短于参考。所有孔径大小、人口的强烈的猝灭荧光寿命接近的时间分辨率设置观察延伸至长寿命在一定程度上, 取决于纳米孔径的大小。有趣的是, 荧光强度归一化平均荧光强度的玻璃引用(称为相对强度) 不是按比例与荧光寿命。虽然短时间的表现出弱荧光斑点, 一些分子中间寿命甚至比玻璃更强的荧光显示参考。荧光体之间的交互和金属结构理论。研究了简单的几何图形, 如镜子和领域, 而对于更复杂的
几何图形, 如纳米孔径数值模拟工作。金属一般缩短荧光寿命, 特别是在接近到金属表面附近的增加非辐射的盛行率。荧光增强, 例如, 报告染料扩散通过纳米孔在金和铝的电影, 但小空间分布信息或寿命和强度的相关报道。
为了克服异质性, 将荧光寿命分配给在纳米孔位置, 我们基于原子力显微镜(AFM)的SMC&P9适应的需要放置到纳米孔。我们使用的AFM 悬臂作为装载纳米孔的纳米机械手臂和DNA 管理可编程处理和锚(参见图2) 。在以前的研究中, 如DNA 单分子, 亲和素结合位点, 功能性寡核苷酸适配子, 或整个蛋白质沉积的精度相对于另一个∼11 nm。这种方法不仅要克服泊松限制, 但也应该启用信号均化和最大化通过限制分子固定到纳米孔的中心。
粘贴分子到纳米孔的先决条件是对齐的位置处理DNA 低聚糖AFM 提示和纳米孔的位置与光学显微镜。功能化后的AFM 悬臂顶端是一个随机的过程, 只有功能化密度控制和保持在泊松限额内, 那些有一个活跃的悬臂选择处理。这是通过监测破裂事件的数量在SMC&P力跟踪记录过程和丢弃的悬臂显示不止一个破裂的事件。然后本地化一个活动处理低聚糖的AFM 提示不是已知的先验的一部分, 我们首先拿起个体DNA 低聚糖的荧光团的仓库面积, 然后粘贴在一个大型参考窗口旁边的纳米孔。本地化的高斯拟合收益率点扩散函数的位置活跃SMC&P处理AFM 提示的坐标系统的精密光学显微镜几个纳米(图2 b) 。定位目标nanoaperture, 我们用非凡的传输通过亚波长孔径, 这种现象首先发现艾布森和同事。透射光允许本地化的孔径高斯适合其强度分布(图2) 。因为位置与纳米精度由本程序定义坐标系统的光学显微镜、个体DNA 管理现在可能贴底部的纳米孔。相对于AFM 地形扫描使用在早先的研究中, 这个过程是快速、无创, 因为它不损害的活动处理DNA 在悬臂通过机械接触。横向精度的方法确定19 nm(见支持信息详细的误差分析) 。
检测到的光强度在130 nm纳米孔径的加载如图3所示,b(看电影还支持信息补充) 。最初, 有针对性的纳米孔(红色箭头) 与AFM 和可见传播白光。白光是关掉后纳米孔径是含有一个DNA 链。的高信号开始粘贴事件(第三阶段)) 源于非弹性散射悬臂的小费。撤销后, 荧光从DNA 链的标签仍然是单步直到漂白剂。同时结合单一破裂事件记录力曲线的粘贴(图3 c), 这个单一光漂白一步证明单分子入住率。假设100%的交互效率, 最小化荧光采集时代, 一个加载周期的持续时间是有限的旅行和牵引速度AFM 3 s 。在这里, 一个载荷循环包括单个分子的传感器, 其传输孔径, 荧光粘贴到光圈控制, 随后返回悬臂的仓库。这里应该注意, 经过漂白的标签, 粘贴DNA 链可以用作其他分子锚点的兴趣纳米孔的中心。
除了全内反射荧光的能力(TIRF)同步和SMC&P成像, 我们设置了一个共焦显微镜荧光寿命成像。这使我们能够执行SMC&P,想象成功的粘贴在纳米孔, 并随后切换到单分子光谱共焦模式相同的分子。我们提取荧光寿命与仪器响应函数和量化卷积正常化的荧光强度的强度染料分子粘贴在金属自由领域实验部分(见支持信息) 。
通过这个协议, 荧光体粘贴到直径375纳米的纳米孔。荧光寿命被发现在一系列大约ns 接近最大分布随机获得的固定(如图4所示, 红色数据点) 。狭窄的荧光寿命分布表明, 所有的分子都成功地粘贴接近纳米孔的中心。此外,3纳米寿命的纳米孔的中心是一致的解释, 中部地区经验至少淬火。有趣的是, 荧光强度主要是高于玻璃参考按照随机固定化分子的分布(见图4) 。
我们的研究表明, 随机固定化分子在纳米孔结果的明显的异质性荧光性质强烈淬火高分数的分子。我们先进的单分子剪切和粘贴技术来克服这些限制使用基于超分辨光学导航技术。定量分析共焦单分子成像显示, 最亮的分子纳米孔的中心附近发现, 淬火尺度的接近金属墙。我们的数据表明, 有针对性的把单分子纳米孔, 使用一种方法, 不是Poisson-limited, 是一个关键的优化在纳米孔单分子光谱。虽然提出了串行加载技术可能不够时间和成本高效的大规模并行加载化验(成千上万的ZMWs) 商业目的, 直接固定的可能性, 例如, 不同的酶突变体在邻国ZMWs 带来新的利益也为中等数量的并行单分子分析。此外, 特定网站的一个一个固定
的单分子通常可以促进电磁环境的探测等纳米结构光学发射器的耦合天线。
在纳米孔径的中心放置单个分子
Stephan F. Heucke, †Fabian Baumann, †Guillermo P. Acuna, ‡Philip M. D. Severin, †Stefan W. Stahl, †Mathias Strackharn,†Ingo H. Stein,†Philipp Altpeter,†Philip Tinnefeld,*,‡and Hermann E. Gaub ††
Center for Nanoscience and Department of Physics, University of Munich, Amalienstrasse 54, 80799 Munich, Germany ‡Physical and Theoretical Chemistry - NanoBioScience, TU Braunschweig, Hans-Sommer-Strasse 10, 38106 Braunschweig, Germany
支持信息
摘要：虽然在单分子荧光的研究纳米光学器件显示了其潜力，但是在这些结构上的发生的淬火和空间位阻，对目标分子的特定地点固定化提高了要求。此处。我们通过光学超分辨率的常规方法来改善单分子剪切和粘贴技术，把单个荧光分子固定在纳米孔的中心。通过比较随机固定的荧光寿命和强度，在这些纳米孔表征其电力学环境来证明装载方法的毫微米级的精度。
关键词：纳米孔径，零模式波导，异常穿透，单分子剪切和粘贴， 单分子荧光，荧光寿命成像
单一酶的光学光谱对于他们的活动提供了独特的观察，但同时需要复杂的手段来满足高浓度的要求。一个显著的方法来克服的浓度限制是在零模式波导（ZMWs ）安置分子。 在不透明金属膜这些纳米孔的直径低于截止直径，也就是说比入射光的波长小一半。由此导致在孔的底部激发光所产生瞬逝场比衍射极限瞬逝场小3数量级。标准的纳米光刻技术使他们的大规模生产，纳米光子单分子技术的应用为单分子实时DNA 测序ZMWs 成为商业化的旗舰。单配位体的快速而明确的光学读出也导致了直接观察转化过程，蛋白质−交互, 甚至允许外来DNA 测序。
在所有这些研究中, 酶固定化来自解决方案导致低产量ZMWs 只有一个固定化酶。这个随机固定、单一占据可以最大化理论的泊松限制仅为37%。此外，由于固定化酶的随机分布举例直到荧光猝灭金属壁，荧光信号强度预计变化强烈。这进一步减少ZMWs 的分数, 可用于分析以及定量光谱测量生物分子过程。
在这里, 我们研究了这种各向异性通过将单个荧光分子ZMWs 首先在一个随机, 然后以一种受控制的方式。我们精制最近开发了单分子剪切和粘贴技术(SMC&P)超限分辨例程将单个荧光体粘贴到中心的纳米孔。相比, 大大减少了异构性随机固定演示了我们的技术的纳米精度同时另外提供第一个图片的空间差异的电动式环境零模波导。
描述个人荧光素纳米孔径的荧光性质, 单一的双链DNA 分子标记与一个ATTO647N 染料随机固定化在纳米孔在第一组实验中使用钝化金属墙和生物亲和素相互作用对纳米孔的底部和支持信息(图1) 。通过共焦荧光寿命成像, 我们量化的荧光强度和荧光寿命。图1 b 显示了假彩色荧光图像的单分子在150 nm纳米孔。在一个额外的背景频道, 绿色所示, 我们从金属包层和漏记录反射通过二向色滤使纳米孔可见作为一个昏暗的常规电网。不同强度的红点的纳米孔径表示与ATTO647N 从固定化DNA 分子标记的荧光。荧光体一直低的密度减少多个入住率的概率。此外, 单步在荧光光漂白瞬态记录最大的亮点, 比如c 如图1所示, 确认了荧光, 事实上, 可以归结于单一荧光体。不同强度的荧光斑点已经表明大量的异构性。这是进一步特征概率密度地图相关的荧光强度和荧光寿命超过1700染料固定在不同大小的纳米孔和一个玻璃参考面(图1 d) 。纳米孔, 玻璃的荧光寿命是短于参考。所有孔径大小、人口的强烈的猝灭荧光寿命接近的时间分辨率设置观察延伸至长寿命在一定程度上, 取决于纳米孔径的大小。有趣的是, 荧光强度归一化平均荧光强度的玻璃引用(称为相对强度) 不是按比例与荧光寿命。虽然短时间的表现出弱荧光斑点, 一些分子中间寿命甚至比玻璃更强的荧光显示参考。荧光体之间的交互和金属结构理论。研究了简单的几何图形, 如镜子和领域, 而对于更复杂的
几何图形, 如纳米孔径数值模拟工作。金属一般缩短荧光寿命, 特别是在接近到金属表面附近的增加非辐射的盛行率。荧光增强, 例如, 报告染料扩散通过纳米孔在金和铝的电影, 但小空间分布信息或寿命和强度的相关报道。
为了克服异质性, 将荧光寿命分配给在纳米孔位置, 我们基于原子力显微镜(AFM)的SMC&P9适应的需要放置到纳米孔。我们使用的AFM 悬臂作为装载纳米孔的纳米机械手臂和DNA 管理可编程处理和锚(参见图2) 。在以前的研究中, 如DNA 单分子, 亲和素结合位点, 功能性寡核苷酸适配子, 或整个蛋白质沉积的精度相对于另一个∼11 nm。这种方法不仅要克服泊松限制, 但也应该启用信号均化和最大化通过限制分子固定到纳米孔的中心。
粘贴分子到纳米孔的先决条件是对齐的位置处理DNA 低聚糖AFM 提示和纳米孔的位置与光学显微镜。功能化后的AFM 悬臂顶端是一个随机的过程, 只有功能化密度控制和保持在泊松限额内, 那些有一个活跃的悬臂选择处理。这是通过监测破裂事件的数量在SMC&P力跟踪记录过程和丢弃的悬臂显示不止一个破裂的事件。然后本地化一个活动处理低聚糖的AFM 提示不是已知的先验的一部分, 我们首先拿起个体DNA 低聚糖的荧光团的仓库面积, 然后粘贴在一个大型参考窗口旁边的纳米孔。本地化的高斯拟合收益率点扩散函数的位置活跃SMC&P处理AFM 提示的坐标系统的精密光学显微镜几个纳米(图2 b) 。定位目标nanoaperture, 我们用非凡的传输通过亚波长孔径, 这种现象首先发现艾布森和同事。透射光允许本地化的孔径高斯适合其强度分布(图2) 。因为位置与纳米精度由本程序定义坐标系统的光学显微镜、个体DNA 管理现在可能贴底部的纳米孔。相对于AFM 地形扫描使用在早先的研究中, 这个过程是快速、无创, 因为它不损害的活动处理DNA 在悬臂通过机械接触。横向精度的方法确定19 nm(见支持信息详细的误差分析) 。
检测到的光强度在130 nm纳米孔径的加载如图3所示,b(看电影还支持信息补充) 。最初, 有针对性的纳米孔(红色箭头) 与AFM 和可见传播白光。白光是关掉后纳米孔径是含有一个DNA 链。的高信号开始粘贴事件(第三阶段)) 源于非弹性散射悬臂的小费。撤销后, 荧光从DNA 链的标签仍然是单步直到漂白剂。同时结合单一破裂事件记录力曲线的粘贴(图3 c), 这个单一光漂白一步证明单分子入住率。假设100%的交互效率, 最小化荧光采集时代, 一个加载周期的持续时间是有限的旅行和牵引速度AFM 3 s 。在这里, 一个载荷循环包括单个分子的传感器, 其传输孔径, 荧光粘贴到光圈控制, 随后返回悬臂的仓库。这里应该注意, 经过漂白的标签, 粘贴DNA 链可以用作其他分子锚点的兴趣纳米孔的中心。
除了全内反射荧光的能力(TIRF)同步和SMC&P成像, 我们设置了一个共焦显微镜荧光寿命成像。这使我们能够执行SMC&P,想象成功的粘贴在纳米孔, 并随后切换到单分子光谱共焦模式相同的分子。我们提取荧光寿命与仪器响应函数和量化卷积正常化的荧光强度的强度染料分子粘贴在金属自由领域实验部分(见支持信息) 。
通过这个协议, 荧光体粘贴到直径375纳米的纳米孔。荧光寿命被发现在一系列大约ns 接近最大分布随机获得的固定(如图4所示, 红色数据点) 。狭窄的荧光寿命分布表明, 所有的分子都成功地粘贴接近纳米孔的中心。此外,3纳米寿命的纳米孔的中心是一致的解释, 中部地区经验至少淬火。有趣的是, 荧光强度主要是高于玻璃参考按照随机固定化分子的分布(见图4) 。
我们的研究表明, 随机固定化分子在纳米孔结果的明显的异质性荧光性质强烈淬火高分数的分子。我们先进的单分子剪切和粘贴技术来克服这些限制使用基于超分辨光学导航技术。定量分析共焦单分子成像显示, 最亮的分子纳米孔的中心附近发现, 淬火尺度的接近金属墙。我们的数据表明, 有针对性的把单分子纳米孔, 使用一种方法, 不是Poisson-limited, 是一个关键的优化在纳米孔单分子光谱。虽然提出了串行加载技术可能不够时间和成本高效的大规模并行加载化验(成千上万的ZMWs) 商业目的, 直接固定的可能性, 例如, 不同的酶突变体在邻国ZMWs 带来新的利益也为中等数量的并行单分子分析。此外, 特定网站的一个一个固定
的单分子通常可以促进电磁环境的探测等纳米结构光学发射器的耦合天线。