微生物学免疫学进展2011年第39卷第1期
ProginMicrobiolImmunolFeb.2011，Vol.39No.1
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病毒蛋白质相互作用的研究方法及其应用
�郭舒杨1综述;周旭1，国泰2校审
�(1兰州生物制品研究所，兰州730046;2中国药品生物制品检定所，北京
�
摘
100050)
要:该文对研究病毒蛋白质之间以及病毒蛋白质与人体蛋白相互作用的几种实验方法的原理�作用机制�优缺
点进行了综述�同时对各种在蛋白功能研究方法的最新进展与运用进行了概述，展望了各种方法发展的前景�关键词:病毒蛋白质;相互作用;酵母双杂交;荧光能量共振转移;RNA干扰
中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:1005-5673(2011)01-0071�
-05
随着后基因组时代的到来，蛋白质功能研究已经成为蛋白质组学研究的核心内容，是生物科学极
具挑战的领域之一�因为全基因组的序列信息并不足以解释及推测细胞的各种生命活动现象，蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行者，而蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥功能的重要途［1-4］
�径
随着蛋白质相互作用研究的深入，病毒蛋白质之间的相互作用也逐渐受到人们重视�病毒蛋白决定了病毒的形态结构，常作为抗原来激发人体内的免疫反应，作用于宿主细胞信号转导途径，导致宿主细胞内信号转导发生紊乱［5-7］;并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作为细胞毒素作用于宿主细［8］
胞�因此对于病毒蛋白质-蛋白质之间相互作用的研究具有极其深远的意义�
目前用于研究病毒蛋白质之间相互作用的方法有很多，每种研究方法都有自身的适用范围和优缺点�本文着重综述了酵母双杂交技术�荧光共振能量转移技术和RNA干扰的原理�应用和发展�1酵母双杂交技术
1.1酵母双杂交系统的基本原理
asttwo-hbridsstem，酵母双杂交系统(YeY2H)是由Field和Song
［9］
编码其中一种蛋白质(通常为已知功能蛋白)的基因与编码DNA结合结构域的基因序列融合称为BD-Bait;编码另一种蛋白(通常为未知功能蛋白)的
基因与编码转录激活结构域的序列融合称为AD-Pre�把这两种融合蛋白共表达于同一酵母细胞中，如果这两个待测蛋白间在空间构象上有关并可以相互作用，那么待测蛋白便会结合，并起桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子激活相应的报告基因表达�通过对报告基因表型的测定，可以很容易地知道待测蛋白分子之间是否发生了相互作用�反之，如果待测蛋白之间不发生相互作用，则BD和AD不能结合，报告基因的转录不能被激e换成基因文库，活［10］�如果将Pr即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的基因［111.2
-13］
�
酵母双杂交系统在病毒蛋白相互作用研究中
的应用
酵母双杂交系统在病毒蛋白相互作用研究中的应用主要有以几个方面:验证病毒蛋白和人体蛋白之间的相互作用;验证病毒蛋白之间的相互作用;从人体细胞cDNA文库中筛选与病毒蛋白有相互作用的蛋白;用(自激活作用)�
1.2.1验证病毒蛋白和人体蛋白之间的相互作用
Parr等［14］通过酵母双杂交系统验证了轮状病毒(RV)非结构蛋白NSP4同人体小窝蛋白-1(Caveolin-1)之间的相互作用�他们扩增了轮状病150-157�2-22�毒SA11株的NSP4的120-147�113-149�161-178位氨基酸基因，连接酵母双杂交载体，最终筛选出同小窝蛋白结合的区域为NSP4的第114-135位的氨基酸残基，同时还发现C末端第161-175位氨基酸可能与VP6结合定位于内质
同一种病毒蛋白自身的相互作
在1989年研究真核生物
基因转录调控时首次发明的一种在酵母中利用转录
激活物的重组来鉴定蛋白质之间相互作用的方法�在酵母双杂交系统中，转录起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域，即DNA
bindingdomain，BD)与转录激活结合结构域(DNA-anscriptionalactivationdomain，AD)�将结构域(Tr
收稿日期:2010-10-20;修回日期:2010-12-30
作者简介:郭舒杨(1986-)，男，硕士研究生，主要从事轮状病毒疫
苗的研究工作�
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网内，N末端定位于内质网外且第8位和第18位氨
基酸糖基化，可能与VP7结合有关�周飞等［15］
通过酵母双杂交系统用乙型肝炎全S蛋白作为诱饵蛋白
正向筛选出肝细胞cDNA文库中与之相关的蛋白，
发现阳性克隆猎物载体含有纤维蛋白原链的中下游部分第226
664为氨基酸�再以纤维蛋白原
链作为诱饵反向验证了其与乙肝全S蛋白之间的
相互作用，结果发现反向验证
链同全S蛋白之间
的作用呈阳性，无自激活作用且激活酵母MAV203中另外的U和H报告基因，初步判断出两种蛋白之间是具有相互作用�1.2.2
验证病毒蛋白之间的相互作用
孙芬芬
等［16］通过Gatewa技术构建了鸡贫血病毒(CAV)
结构蛋白VP1�VP2和VP3酵母双杂交载体，验证了
三种结构蛋白之间的相互作用�将每种已连接病毒蛋白基因的双杂交载体与空载体共转入同一酵母细胞内，验证了三种蛋白各自无自激活作用，并发现将三种蛋白载体分别同空载体转入酵母细胞内在有氨基三唑(3AT)的培养基上均无法生长�而其两两之间的X-GAL实验全部都呈阳性，初步判断三种蛋
白之间有相互作用，从而为下一步验证VP1�VP2�VP3之间的相互关系奠定了基础�
1.2.3从人体细胞�
cDNA文库中筛选和病毒蛋白有相互作用的蛋白�张健等［17］构建丙型肝炎非结构蛋白5B的诱饵载体，通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库，寻找可与NS5B相互作用的人体蛋白�最终通过文库筛选与测序，挑选出31个同5B相关的阳性克隆，分别为人类3BAC完整序列�人类天冬氨酸酰化酶-3�人类C1酯酶抑制因子等16种基因，为揭示NS5B潜在的生物学功能提供依据�陈国凤等［18］通过酵母双杂交系统在人肝细
胞c
DNA文库中筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白，最终筛选出包括人类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)�RNA聚合酶亚单位(hsRPB7)�血浆铜蓝蛋白(CP)等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因与之相关�
1.2.4同一种病毒蛋白自身的相互作用Kal-pana等［19］通过酵母双杂交系统验证了HIV逆转录病毒整合酶蛋白(IN)自身之间的相互作用，将构建有IN片段的猎物载体同诱饵空载体同时转入酵母细胞内，在抑制自激活作用的氨基三唑(3-AT)培养基上培养，发现10100mol/L的3AT都未抑制自激活作用，并通过构建片段缺失的逆转录病毒整
合酶蛋白载体来进行酵母双杂交，发现整合酶中的N末端锌指结构在形成复合物时非必须�1.3酵母双杂交技术的发展前景
酵母双杂交系统自提出至今，得到了不断的发展与完善�如今，Gatewa［20-23］技术为酵母双杂交构建载体提供了极大的方便�Gatewa克隆技术是快速有效地在载体之间进行高流通量DNA转移的一种基因重组技术，其包括LR反应和BP反应两种
反应，克隆效率高达95%或更高�当构建完成入门克隆载体后，用带有a
ttL和attR重组位点的酵母双杂交载体作为目的载体，基因可以在目的表达载体
之间快速简便的穿梭并保证阅读框方向正确，因而反应后不必再进行新的表达克隆的测序�
传统的酵母双杂交系统无法以硫氧还原蛋白
(TRX)作为诱饵载体来筛选与其有相互作用的蛋白，因为酵母基因组中含有TRX基因�Vignols等［24］开发出一种新的酵母菌株CY306，这种菌株通过基因敲除技术删除菌株本身含有的TRXs基因，使得TRX可以作为诱饵蛋白来筛选与其相关的蛋白，并筛选出抗氧化蛋白AHP1和TSA1与其有相互关系，而这些是在传统的酵母双杂交系统中无法完成的�
三杂交系统是SenGupta等［25］
发展起来的，与
双杂交系统原理相似，只是两个杂交蛋白结合需通过第三个分子介导�三杂交系统必须具备以下两个条件:两蛋白无直接作用，必须通过第三个成分才
能激活转录;第三个分子具有结合两蛋白的位点�三杂交系统根据第3个介导分子的种类的不同分为蛋白质三杂交系统�激酶三杂交系统�小配体三杂交系统�
RNA三杂交系统等�2荧光共振能量转移技术2.1
荧光共振能量转移技术的基本原理
荧光能量共振转移(Fl
uorescenceresonanceen-ergtransfer，FRET)是发展较早的一门技术�随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检
测活体中生物大分子纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析�细胞生理研究�免疫分析等方面有着广泛的应用［26-29］�荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光淬灭)，而受体发射的荧光却大大增
强(敏化荧光)［30，31］
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2.2荧光共振能量转移技术在病毒蛋白研究方面内源性或外源性双链RNA(DoublestrandRNA，dsR-NA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解导致靶
基因的表达沉默，并产生相应的功能表型缺
的应用
荧光共振能量转移技术的优点是可以在生理条
［38-40］
�这一现象属于转录后的基因沉默(Postt-件下无损伤�动态地研究蛋白质的相互作用，同时还失
�
能检测蛋白质在细胞内的定位，因此更有利于研究ranscriptionalgenesilencing，PTGS)［41］�RNAi是小�病毒蛋白质的相互作用�Toth等［32］同时将CXCR4干扰RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)在体内与
mRNA互补结合，受体构建到增强型蓝绿色荧光蛋白载体(EYFP)和从而诱导mRNA特异性的降解现
�增强型黄色荧光蛋白载体(ECFP)上，并将载体转入象�siRNA是长约2123bp的双链RNA，由一种
人胚肾细胞(HEK)tsA201中，通过荧光共振能量转
移来分析融合蛋白与趋化因子SDF-1和HIV-1的gp120之间的相互作用，发现在细胞中缺乏hCD4表
达时，gp120IIIB针对CXCR4受体的荧光能量共振转移率降低，当hCD4存在时gp120IIIB的荧光能量
共振转移率随时间升高，而SDF-1同CXCR4之间的比率降低�同时发现在CX
CR4受体二聚体存在时gp120和SDF-1之间的荧光能量共振转移率明显升高，因此得出结论CXCR4受体二聚体在SDF-1
和HIV-1的gp120细胞内信号转导过程中起重要作用�另外Alves等［33］人发现在蛋白酶的作用过
程中，可溶性肽段起主要作用，并将混有荧光能量共振转移的肽段引入肽库来验证这种作用，检测荧光信号大小来判断蛋白酶在作用过程中可溶性肽段数�量的变化，可溶性肽段的作用最终在人类组织蛋白
酶S和登革热病毒NS2B-NS3的肽库中得以验证�2.3
荧光共振能量转移技术的发展前景
FRET技术的应用非常广泛，也是非常有价值
和发展前途的一种蛋白质相互作用研究手段�今后
目标主要是以活体细胞和动物为载体，在其生理条件下适时动态地阐明生物大分子分子间的相互作用规律，提高对生命活动基本规律的认识［34-36］�如Mochiuki等［37］通过FRET技术研究了关于细胞内Ras和Rapl激活�他们将Raf的Ras结合结构域(Ras-bindingdomainofRaf，RafRBD)分别与YFP和CFP连接构建融合蛋白，Ras部分同YFP融合，Raf部分同CFP融合，当两分子在一定距离之内便会激发FRET�当设计好的融合蛋白与特异性的鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine-nucleotideechangefactors，GEFs)和GTP酶活化蛋白(GTPase-activa-tingproteins，GAPs)共表达时，可明显观察到FRET的增减同Ras的激活和抑制有关�另外他们还用相同原理检测了Rap1的激活�3RNA干扰(RNA)
3.1
RNA干扰的基本原理
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是指
ATP依赖性RNA酶Dicer切割双链RNA所形成的�
siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomple，RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶
mRNA并使其降解，从而导致特定基因沉默［42-45］�3.2RNA干扰在病毒蛋白功能研究中的应用
RNA干扰在病毒蛋白质功能研究方面有着很广泛的应用�Zambrano等［46］通过siRNA分别沉默
了轮状病毒的NSP4基因和VP7基因，通过West-ern-blot监测了基因沉默前后病毒VP7和NSP4的表达状况，并测定了分别沉默NSP4和VP7以及同
时沉默两种基因时细胞内钙离子的变化情况�最终
发现VP7被沉默时细胞内钙离子的浓度有所降低，沉默NSP4的时候细胞内钙离子的浓度有很大程度的降低�并发现在沉默NSP4之后VP7的量在细胞
中也有所减少，最终得出在轮状病毒感染培养细胞
的过程中NSP4是导致Ca2+
发生变化的主要原因�Cao等［47］建立了稳定的细胞株来表达带有FLAG标
签的丁型肝炎抗原-S(FLAG-HDAg-S)，并通过RNA
干扰沉默了细胞株中可能同HDV复制相关的一些蛋白基因，最终确定了RNA聚合酶复合物在
HDV复制装配过程中起重要作用�4其他方法
除上述介绍的方法外，还有串联亲和纯化技术(Tandemaffinitpurification，TAP)�X射线晶体衍射技术(X-radiffraction)�GSTpull-down技术等在研究病毒蛋白相互作用方面都有独特的优势�5总结
对病毒蛋白质相互作用的研究是蛋白质研究中的核心内容之一，虽然它还处于一个初级发展阶段，其研究方法和系统也不够完善，但随着其不断深入发展，相信在揭示病毒复制�与人体蛋白相互结合产生免疫应答�药物对于病毒的影响等方面会有所突破�病毒蛋白相互作用研究将为从细胞和分子水平上探讨人类重大疾病的机制�诊断�防治和新药开发提供重要的理论基础，从而使蛋白质科学研究达到
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［9］
编码其中一种蛋白质(通常为已知功能蛋白)的基因与编码DNA结合结构域的基因序列融合称为BD-Bait;编码另一种蛋白(通常为未知功能蛋白)的
基因与编码转录激活结构域的序列融合称为AD-Pre�把这两种融合蛋白共表达于同一酵母细胞中，如果这两个待测蛋白间在空间构象上有关并可以相互作用，那么待测蛋白便会结合，并起桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子激活相应的报告基因表达�通过对报告基因表型的测定，可以很容易地知道待测蛋白分子之间是否发生了相互作用�反之，如果待测蛋白之间不发生相互作用，则BD和AD不能结合，报告基因的转录不能被激e换成基因文库，活［10］�如果将Pr即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的基因［111.2
-13］
�
酵母双杂交系统在病毒蛋白相互作用研究中
的应用
酵母双杂交系统在病毒蛋白相互作用研究中的应用主要有以几个方面:验证病毒蛋白和人体蛋白之间的相互作用;验证病毒蛋白之间的相互作用;从人体细胞cDNA文库中筛选与病毒蛋白有相互作用的蛋白;用(自激活作用)�
1.2.1验证病毒蛋白和人体蛋白之间的相互作用
Parr等［14］通过酵母双杂交系统验证了轮状病毒(RV)非结构蛋白NSP4同人体小窝蛋白-1(Caveolin-1)之间的相互作用�他们扩增了轮状病150-157�2-22�毒SA11株的NSP4的120-147�113-149�161-178位氨基酸基因，连接酵母双杂交载体，最终筛选出同小窝蛋白结合的区域为NSP4的第114-135位的氨基酸残基，同时还发现C末端第161-175位氨基酸可能与VP6结合定位于内质
同一种病毒蛋白自身的相互作
在1989年研究真核生物
基因转录调控时首次发明的一种在酵母中利用转录
激活物的重组来鉴定蛋白质之间相互作用的方法�在酵母双杂交系统中，转录起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域，即DNA
bindingdomain，BD)与转录激活结合结构域(DNA-anscriptionalactivationdomain，AD)�将结构域(Tr
收稿日期:2010-10-20;修回日期:2010-12-30
作者简介:郭舒杨(1986-)，男，硕士研究生，主要从事轮状病毒疫
苗的研究工作�
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网内，N末端定位于内质网外且第8位和第18位氨
基酸糖基化，可能与VP7结合有关�周飞等［15］
通过酵母双杂交系统用乙型肝炎全S蛋白作为诱饵蛋白
正向筛选出肝细胞cDNA文库中与之相关的蛋白，
发现阳性克隆猎物载体含有纤维蛋白原链的中下游部分第226
664为氨基酸�再以纤维蛋白原
链作为诱饵反向验证了其与乙肝全S蛋白之间的
相互作用，结果发现反向验证
链同全S蛋白之间
的作用呈阳性，无自激活作用且激活酵母MAV203中另外的U和H报告基因，初步判断出两种蛋白之间是具有相互作用�1.2.2
验证病毒蛋白之间的相互作用
孙芬芬
等［16］通过Gatewa技术构建了鸡贫血病毒(CAV)
结构蛋白VP1�VP2和VP3酵母双杂交载体，验证了
三种结构蛋白之间的相互作用�将每种已连接病毒蛋白基因的双杂交载体与空载体共转入同一酵母细胞内，验证了三种蛋白各自无自激活作用，并发现将三种蛋白载体分别同空载体转入酵母细胞内在有氨基三唑(3AT)的培养基上均无法生长�而其两两之间的X-GAL实验全部都呈阳性，初步判断三种蛋
白之间有相互作用，从而为下一步验证VP1�VP2�VP3之间的相互关系奠定了基础�
1.2.3从人体细胞�
cDNA文库中筛选和病毒蛋白有相互作用的蛋白�张健等［17］构建丙型肝炎非结构蛋白5B的诱饵载体，通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库，寻找可与NS5B相互作用的人体蛋白�最终通过文库筛选与测序，挑选出31个同5B相关的阳性克隆，分别为人类3BAC完整序列�人类天冬氨酸酰化酶-3�人类C1酯酶抑制因子等16种基因，为揭示NS5B潜在的生物学功能提供依据�陈国凤等［18］通过酵母双杂交系统在人肝细
胞c
DNA文库中筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白，最终筛选出包括人类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)�RNA聚合酶亚单位(hsRPB7)�血浆铜蓝蛋白(CP)等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因与之相关�
1.2.4同一种病毒蛋白自身的相互作用Kal-pana等［19］通过酵母双杂交系统验证了HIV逆转录病毒整合酶蛋白(IN)自身之间的相互作用，将构建有IN片段的猎物载体同诱饵空载体同时转入酵母细胞内，在抑制自激活作用的氨基三唑(3-AT)培养基上培养，发现10100mol/L的3AT都未抑制自激活作用，并通过构建片段缺失的逆转录病毒整
合酶蛋白载体来进行酵母双杂交，发现整合酶中的N末端锌指结构在形成复合物时非必须�1.3酵母双杂交技术的发展前景
酵母双杂交系统自提出至今，得到了不断的发展与完善�如今，Gatewa［20-23］技术为酵母双杂交构建载体提供了极大的方便�Gatewa克隆技术是快速有效地在载体之间进行高流通量DNA转移的一种基因重组技术，其包括LR反应和BP反应两种
反应，克隆效率高达95%或更高�当构建完成入门克隆载体后，用带有a
ttL和attR重组位点的酵母双杂交载体作为目的载体，基因可以在目的表达载体
之间快速简便的穿梭并保证阅读框方向正确，因而反应后不必再进行新的表达克隆的测序�
传统的酵母双杂交系统无法以硫氧还原蛋白
(TRX)作为诱饵载体来筛选与其有相互作用的蛋白，因为酵母基因组中含有TRX基因�Vignols等［24］开发出一种新的酵母菌株CY306，这种菌株通过基因敲除技术删除菌株本身含有的TRXs基因，使得TRX可以作为诱饵蛋白来筛选与其相关的蛋白，并筛选出抗氧化蛋白AHP1和TSA1与其有相互关系，而这些是在传统的酵母双杂交系统中无法完成的�
三杂交系统是SenGupta等［25］
发展起来的，与
双杂交系统原理相似，只是两个杂交蛋白结合需通过第三个分子介导�三杂交系统必须具备以下两个条件:两蛋白无直接作用，必须通过第三个成分才
能激活转录;第三个分子具有结合两蛋白的位点�三杂交系统根据第3个介导分子的种类的不同分为蛋白质三杂交系统�激酶三杂交系统�小配体三杂交系统�
RNA三杂交系统等�2荧光共振能量转移技术2.1
荧光共振能量转移技术的基本原理
荧光能量共振转移(Fl
uorescenceresonanceen-ergtransfer，FRET)是发展较早的一门技术�随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检
测活体中生物大分子纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析�细胞生理研究�免疫分析等方面有着广泛的应用［26-29］�荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光淬灭)，而受体发射的荧光却大大增
强(敏化荧光)［30，31］
�
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2.2荧光共振能量转移技术在病毒蛋白研究方面内源性或外源性双链RNA(DoublestrandRNA，dsR-NA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解导致靶
基因的表达沉默，并产生相应的功能表型缺
的应用
荧光共振能量转移技术的优点是可以在生理条
［38-40］
�这一现象属于转录后的基因沉默(Postt-件下无损伤�动态地研究蛋白质的相互作用，同时还失
�
能检测蛋白质在细胞内的定位，因此更有利于研究ranscriptionalgenesilencing，PTGS)［41］�RNAi是小�病毒蛋白质的相互作用�Toth等［32］同时将CXCR4干扰RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)在体内与
mRNA互补结合，受体构建到增强型蓝绿色荧光蛋白载体(EYFP)和从而诱导mRNA特异性的降解现
�增强型黄色荧光蛋白载体(ECFP)上，并将载体转入象�siRNA是长约2123bp的双链RNA，由一种
人胚肾细胞(HEK)tsA201中，通过荧光共振能量转
移来分析融合蛋白与趋化因子SDF-1和HIV-1的gp120之间的相互作用，发现在细胞中缺乏hCD4表
达时，gp120IIIB针对CXCR4受体的荧光能量共振转移率降低，当hCD4存在时gp120IIIB的荧光能量
共振转移率随时间升高，而SDF-1同CXCR4之间的比率降低�同时发现在CX
CR4受体二聚体存在时gp120和SDF-1之间的荧光能量共振转移率明显升高，因此得出结论CXCR4受体二聚体在SDF-1
和HIV-1的gp120细胞内信号转导过程中起重要作用�另外Alves等［33］人发现在蛋白酶的作用过
程中，可溶性肽段起主要作用，并将混有荧光能量共振转移的肽段引入肽库来验证这种作用，检测荧光信号大小来判断蛋白酶在作用过程中可溶性肽段数�量的变化，可溶性肽段的作用最终在人类组织蛋白
酶S和登革热病毒NS2B-NS3的肽库中得以验证�2.3
荧光共振能量转移技术的发展前景
FRET技术的应用非常广泛，也是非常有价值
和发展前途的一种蛋白质相互作用研究手段�今后
目标主要是以活体细胞和动物为载体，在其生理条件下适时动态地阐明生物大分子分子间的相互作用规律，提高对生命活动基本规律的认识［34-36］�如Mochiuki等［37］通过FRET技术研究了关于细胞内Ras和Rapl激活�他们将Raf的Ras结合结构域(Ras-bindingdomainofRaf，RafRBD)分别与YFP和CFP连接构建融合蛋白，Ras部分同YFP融合，Raf部分同CFP融合，当两分子在一定距离之内便会激发FRET�当设计好的融合蛋白与特异性的鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine-nucleotideechangefactors，GEFs)和GTP酶活化蛋白(GTPase-activa-tingproteins，GAPs)共表达时，可明显观察到FRET的增减同Ras的激活和抑制有关�另外他们还用相同原理检测了Rap1的激活�3RNA干扰(RNA)
3.1
RNA干扰的基本原理
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是指
ATP依赖性RNA酶Dicer切割双链RNA所形成的�
siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomple，RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶
mRNA并使其降解，从而导致特定基因沉默［42-45］�3.2RNA干扰在病毒蛋白功能研究中的应用
RNA干扰在病毒蛋白质功能研究方面有着很广泛的应用�Zambrano等［46］通过siRNA分别沉默
了轮状病毒的NSP4基因和VP7基因，通过West-ern-blot监测了基因沉默前后病毒VP7和NSP4的表达状况，并测定了分别沉默NSP4和VP7以及同
时沉默两种基因时细胞内钙离子的变化情况�最终
发现VP7被沉默时细胞内钙离子的浓度有所降低，沉默NSP4的时候细胞内钙离子的浓度有很大程度的降低�并发现在沉默NSP4之后VP7的量在细胞
中也有所减少，最终得出在轮状病毒感染培养细胞
的过程中NSP4是导致Ca2+
发生变化的主要原因�Cao等［47］建立了稳定的细胞株来表达带有FLAG标
签的丁型肝炎抗原-S(FLAG-HDAg-S)，并通过RNA
干扰沉默了细胞株中可能同HDV复制相关的一些蛋白基因，最终确定了RNA聚合酶复合物在
HDV复制装配过程中起重要作用�4其他方法
除上述介绍的方法外，还有串联亲和纯化技术(Tandemaffinitpurification，TAP)�X射线晶体衍射技术(X-radiffraction)�GSTpull-down技术等在研究病毒蛋白相互作用方面都有独特的优势�5总结
对病毒蛋白质相互作用的研究是蛋白质研究中的核心内容之一，虽然它还处于一个初级发展阶段，其研究方法和系统也不够完善，但随着其不断深入发展，相信在揭示病毒复制�与人体蛋白相互结合产生免疫应答�药物对于病毒的影响等方面会有所突破�病毒蛋白相互作用研究将为从细胞和分子水平上探讨人类重大疾病的机制�诊断�防治和新药开发提供重要的理论基础，从而使蛋白质科学研究达到
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