无细胞蛋白表达系统研究进展

洪励上苏志宁

（南昌大学生命科学学院，江西南昌３３００３１）

摘

要：随着蛋白质组学研究的深入，无细胞表达系统备受人们重视。到目前为止，来自原核和真核生物的无细胞表达系统

已达十几种。本文就无细胞蛋白表达系统的现状、应用及所面临的问题作一综述。

关键词：无细胞系统；蛋白表达：蛋白质组学

１

引言到了大幅度的提高。

近年来，无细胞蛋门质表达系统再次受到关注。相比较体内表达，无细胞蛋白表达系统具有其明显的优点ｎ。例如．不受细胞生理限制可进行较大量的毒性蛋白表达；产物的活性和溶解性增加；产物不受胞内蛋白酶的降解；反应可以在短时间内进行；无需繁杂的下游处理；适合于高通量表达。而且通过优化反应系统，可以得到高产率表达产物。总之，在无细胞系统合成蛋白质可提高目标蛋一的表达效果。

随着核酸测序技术、芯片技术和ＲＮＡ干扰技术的建寺和突破，人们对核酸信息的了解越来越多。而生命过程最终多是以蛋白质形式执行其功能的，因此对蛋白质结构和功能的研究成为后基因组时代重要的工作。因此，发展能够合成任何目标蛋白系统以及实现高通苗表达是当今生物技术中重要的课题。

２无细胞蛋白表达系统

无细胞蛋门质合成系统是一种以外源ＤＮＡ或ｍＲＮＡ为模板，利用细胞抽提物中的蛋门合成机器、蛋一折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、竹聚合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统（如图一），１９５８年，Ｚａｍｅｃｎｉｋ首次证明，从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成；１９６１年，Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ和Ｍａｔｔｈａｅｉ［４］利用蛋广１质的无细胞合成体系，以破译遗传密码子。该方法对蛋白翻译机制的研究，同样也作出了重要贡献。然而，当时由于此方法的表达量有限，无法进行规模化生产，因此，在过去几十年一直没能被重视起来。

随着人们对蛋白质生物合成机制的深入了解，建立稳定的无细胞蛋白表达体系已成为可能。现已确定，蛋白质生物合成的机器是核糖体，如果存在有ｔＲＮＡ，以及蛋白折叠加工必需的酶和各种相关因子，只要提供外源的ＲＮＡ模板、氨基酸和能量，无需其他的细胞结构（如线粒体），蛋白质合成也能顺利进行。而在各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因子。因此，可以在无细胞体系中实现蛋白质表达，通过对尤细胞反应体系的优化。系统的稳定性和蛋白产率得

图一：无细胞体系工作原理

目前，已开发出来的无细胞表达系统有原核和真核系统两大类型。原核系统通常足通过Ｅ．ｃｏｉｌＢＬ２１（ＤＥ３）或其他敲除了内源蛋白酶和核酸水解酶的菌种，如Ａ１９来进行无细胞表达体系的建立；真核系统。目前较为成熟的是利用兔网织红细胞和麦芽提取物来实现无细胞蛋门表达系统的建立。理论ｆ：来说，任何遗传信息都可以在这两大类体外表达体系中进行翻译而得到目的蛋白，但不同的系统有着不同的特点，应该根据白己的需求来进行选择。

２．１原核系统

原核系统表达系统主要利用大肠杆菌的提取物来实现的。目前对大肠杆菌蛋白合成机制已有十分详细的认识，这使得大肠杆菌的体外表达系统也随之不断得到改进。大肠杆菌提取物基础上建立的无细胞蛋自表达系统有一个很大的优势就是它的耐受性，它可以在含有其它不同成份杂质时仍町以进行目标蛋白的表达。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋门酶抑制剂，分子伴侣，代谢物。非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。为此，该体系的

较高的分类性能，而对类别差异不大的类别的识别能力还有待提高，这说明文本的特征表示仍然是影响分类系统性能的主要原因，为此应设计合理的类别体系使文本类别之问的差别尽量大。

４结束语

本文探讨了文本分类系统的关键技术，提出的基于ＫＮＮ的

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一种性能比较优秀的分类方法，能够明显提高分类的准确宰和召回率。

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弹性非常大，可以加入许多其它必要成份以提高产率和提高溶解性。例如：微修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成ｉＦ确的二硫键．然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定的修饰，比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是，蛋白的翻译后加］：和如何正确折叠仍然是一个问题。特别是利用这一系统合成那些多结构域构成和含有二硫键的真核蛋白。不过，由于真核体外合成体系也未能解决蛋白质翻译后加］：的问题，而大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高，因而依旧是体外表达的热门选择。

２．２真核系统

２．２．】兔网织红细胞

兔网织红细胞是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（９０％以上）．以及球蛋门。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，而没有复杂的背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链ＲＮＡ的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的ＲＮＡ），因而可以合成较大的蛋白。

２．２．１麦芽提取物

麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的ｍＲＮＡ很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求ＲＮＡ有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高，直到最近例才通过延长合成时间的方式提高了产率。如果要保持麦芽提取物系统持续数日的合成效率，就必需保证反应体系不含有任何会破坏核糖体功能以及其它合成中使用到的相关的酶。这样此系统的合成效率可以被不断加强，南试验结果显示。２４小时内最高的合成量可达Ｉｍｇ／ｍｌ。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。

３应用利用无细胞体系表达蛋白质已经应用于很多方面。但是大致可以归属于以下两个方面。

３．１结构蛋白质组研究中的应用

首先，利用尤细胞体系可以进行蛋白质的高通量表达，能同时得到许多用于结品的蛋白质。进而开展结构蛋白质组的研究。第二，特别是膜蛋白和有细胞毒性的蛋白质都可以利用无细胞体系进行表达。第三，可以在蛋白质中人为地引入硒代半胱氨酸，有利于蛋白质的Ｘ射线结晶学研究。第四。因为可以在很小体积内进行无细胞体系的蛋门质表达，这样有利于蛋自质的同位素标记，例如进行了双重同位素标记蛋白质后，无需烦杂的纯化，即可进行灵敏的ＮＭＲ测定。

３．２功能蛋白质组研究中的应用

同样是由于无细胞体系可以进行蛋白质高通量、微量化的表达，表达后又可省去烦杂的分离纯化，因此对表达产物的活性测定非常容易，尤其是对酶的活性研究。如果进一步降低无细胞表达体系的体积，使得反应浓集在很小区域内（例如在９６孔板中），几乎可以达到蛋白质（微）阵列的目的。

在无细胞体系表达蛋白质时口丁以引入非天然氨基酸（其中包括荧光和生物素光标记的氨基酸、可以进行光化反应的修饰氨基酸），对蛋白质进行修饰和标记。这样可以更为有效地研究

蛋白质组中得到的各个组分的功能。

４讨论及展望

体外表达由于足在无细胞的条件下进行的，缺少蛋白质翻译后加１：所需要的细胞器和空间结构，所以其致命的弱点就是：即使是真核体外表达系统，目前依然无法对蛋白进行糖基化和其它天然蛋白必需的高级修饰。所以有必要对体系进行改进，如渗人单糖基化的氨基酸或加入微粒体（ｍｉｅｒｏｓｏｍｅ）等，理论上可以实现一些必要的修饰。

基于蛋白质组学的研究需要进行高通量的蛋白质表达，体积无需很大，表达量不必很多，但是要快的速度．表达的蛋白质可以被翻译后加工。而这几个方面正好是兄细胞蛋门质表达系统的专长。为了能使蛋白质的无细胞表达更有成效。在方法和技术上也需改进和发展。在方法改善的同时，其应用也日益拓展。

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２００９年第６期

无细胞蛋白表达系统研究进展

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

洪励上，苏志宁

南昌大学生命科学学院,江西,南昌,330031科技经济市场

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_kjjjsc200906008.aspx