创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

中国组织工程研究与临床康复

第 15 卷 第 15 期 2011–04–09 出版

Vol.15, No.15

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 9, 2011

创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路*☆

莫建文1，胡海澜2，白 波1，李 颖1，张姝江1，陈 艺1，邓晋京1

Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis

Mo Jian-wen1, Hu Hai-lan2, Bai Bo1, Li Ying1, Zhang Shu-jiang1, Chen Yi1, Deng Jin-jing1

Abstract

1

Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; 2 Department of Orthopaedics, the Second Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China Mo Jian-wen☆, Doctor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China [email protected] Correspondence to: Bai Bo, Professor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China [email protected] Supported by: the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. [**************]5* Received: 2010-11-25 Accepted: 2011-01-30

BACKGROUND: The molecular mechanism of traumatic deep vein thrombosis is complex. The influence of focal adhesion kinase (FAK) signaling pathway on the development of deep vein thrombosis remains poorly understood. OBJECTIVE: To study the effects of FAK signaling pathway in traumatic deep vein thrombosis. METHODS: Twenty SD rats were prepared for femoral fracture models and divided into 2 groups according to thrombosis states, namely, the thrombosis and no thrombosis groups, with 10 animals in each group. Additional 10 rats served as controls. The femoral vein was incised and total RNA was extracted. The femoral vein RNA expression was detected by Genechip Rat genome 430 2.0 genechips, and the changes of FAK signaling pathway gene was analyzed. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with no thrombosis group, the key genes of thrombosis group related to FAK signaling pathway of extracellular matrix, protein kinase C, Fyn, actinin and Vav were up-regulated, and integrinα, myosin light chain phosphatase and c-Jun were down-regulated. FAK signaling pathway may be one of the most important pathways to control the biological states of thrombus. Mo JW, Hu HL, Bai B, Li Y, Zhang SJ, Chen Y, Deng JJ. Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(15): 2790-2793. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要

背景：创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂，黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。 目的：探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。 方法：取 20 只 SD 大鼠制备股骨骨折模型。造模后 5 d，根据血栓形成情况将模型大鼠分为 2 组：血栓形成组和无血栓形成 组，每组 10 只。另取 10 只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织，抽取总 RNA，Genechip Rat Genome 430 2.0 芯片测定股静脉 RNA 的表达，并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。 结果与结论：与无血栓形成组比较，血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶 C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav 等关键基因均上调；下调的有整联蛋白 α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun 基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血 栓生物学状态的重要信号通路。 关键词：创伤；深静脉血栓形成；黏着斑激酶信号通路；基因芯片 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.15.031 莫建文，胡海澜，白波，李颖，张姝江，陈艺，邓晋京.创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路[J].中国组织工程研 究与临床康复，2011，15(15):2790-2793. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

实验旨在探讨该通路对血栓形成的影响，以 0 引言 创伤性深静脉血栓是指由于创伤/手术等因 素引起的静脉栓塞性疾病，具有极大的潜在危 害性，如栓子脱落可引发致命性肺栓塞、脑梗 死及深静脉瓣膜功能不全等[1-6]，该疾患被公认 为创伤/术后严重的并发症之一。静脉血栓形成 是三大血栓性疾病(心肌梗死、缺血性卒中及静 脉血栓)之一，是多因素致病的疾病，多发生于 严重创伤及骨科大手术后的患者。 黏着斑激酶 (focal adhesion kinase, FAK) 是一种非受体型的酪氨酸激酶， 主要参与整合 素介导的信号传导，在细胞迁移、分化等多方 面具有重要影响 [7-11]。FAK信号通路在创伤性 深静脉血栓形成过程中的作用机制尚未明了。 设计：随机对照动物实验。 时间及地点：于2008-10/2009-10在广州 呼吸疾病研究所实验室完成。 材料：

实验动物：健康SPF级SD大鼠30只，体质

期进一步了解创伤性深静脉血栓的发病机 制。 1 材料和方法

量(250±20) g，雌雄不限。购于广东省医学实 验动物中心， 许可证号： SCXK(粤)2003-0002。 动物饲养于国家呼吸疾病研究所动物实验中 心，室温20~25 ℃，光线、通风良好，自由饮 水、进食。适应性喂养2周。

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com

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莫建文，等. 创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

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试剂和仪器：

试剂及仪器 彩色病理图像分析仪 总 RNA 抽提试剂盒 基因芯片，扫描仪，芯片 分析软件 来源 日本 OLYMPUS 公司 美国 invitrogen 公司 美国 Affymetrix, West Sacramento 公司

30只，均进入结果分析。 2.2 股静脉组织的总RNA提取及电泳图 各 组股静脉组织总 RNA 的 A260/A280 介于 1.8~2.0 之间。 琼脂糖凝胶电泳显示， 28 S RNA和18 S RNA条带整齐， 28 S与18 S的吸光度值之比约 为2，说明制备的总RNA样品完整性好、质量 高、无降解，见图1

1

广州医学院第一 附属医院骨科， 广 东 省 广 州 市 510120；2 广州医 学院第二附属医 院骨科， 广东省广 州市 510260 莫建文☆，男， 1978 年生，广东 省肇庆市人，汉 族，2008 年昆明 医学院毕业，博 士， 主要从事创伤 后深静脉血栓形 成的基础与临床 研究。 mjw1997@126. com 通讯作者：白波， 教授， 广州医学院 第一附属医院骨 科， 广东省广州市 510120 drbobai@yahoo. com

方法：

动物模型的建立及分组：从30只SD大鼠中随

机取20只，参照文献的方法进行造模[12]。实验 大鼠不麻醉， 采用定量打击装置进行定点打击， 瞬间打击能量为5 J。大鼠俯卧位，击打大鼠双 侧后肢大腿近端外侧各1次(大转子至大转子下 1 cm)造成股骨骨折后，均行髋人字石膏固定。 造模后5 d，取材进行镜下观察，根据血栓形成 情况将模型大鼠分为2组： 血栓形成组和无血栓 形成组，每组10只。另外10只大鼠不造模，正 常饲养作为对照组。

取材：造模后5 d，大鼠麻醉后，无菌条件

A B C A: control group; B: thrombosis group; C: no thrombosis group 28 S 18 S

Figure 1 图1

Total RNA electrophoretogram of 3 groups specimens 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图

中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)15-02790-04 收稿日期： 2010-11-25 修回日期： 2011-01-30 ([1**********]/WLM ·Z)

下沿双侧大腿股静脉走行切开皮肤约3 cm，暴 露双侧股静脉及主要属支，无创分离动静脉， 切取长约3 cm的股静脉及主要属支，有血栓形 成的血管去除血管内的血栓，并用生理盐水冲 洗干净管壁及管腔内的血液， 迅速放入冻存管， 置入液氮罐保存。

基因表达谱芯片检测： Trizol一步法提取上述

2.3

差异基因表达情况

经扫描分析，得到

差异表达的基因。与对照组比较，血栓形成组 共有1 906个差异表达基因，其中，上调1 590 个，下调316个。无血栓形成组与对照组比较 共有1 568个差异表达基因，其中，上调1 103 个，下调465个，见图2。

3组股静脉标本总 RNA，并进行纯化和质检。 以各组总RNA为模板合成双链cDNA；体外转 录生成生物素标记的 cRNA；纯化和片段化处 理 后 ， 取 10 µg cRNA 与 Genechip Rat Genome 430 2.0芯片进行杂交、洗脱、染色 扫描检测信号。

芯片图像的采集与数据分析：采用Affymetrix

扫描仪进行扫描，采用芯片分析软件(5.0版)进 行分析。差异表达基因的判断标准为：change 为 I ， Ratio≥1 ，血栓形成组和无血栓形成组 Detection 为 P 的 为 上 调 基 因 ； change 为 D ， Ratio≤ -1， 对照组Detection为P的为下调基因。

pathway 查 询 分 析 ： 通 过 kegg pathway

a: Control group

b: Thrombosis group

database(www.genome.jp/kegg/) 查 询 差 异 基 因参与的pathway信号传导通路。 主要观察指标：FAK信号通路基因表达的 变化。 2.4 2 结果 2.1 实验动物数量分析

CN 21-1539/R

c: No thrombosis group

Figure 2 Gene expression in rats 图 2 各组大鼠基因的表达情况

pathway 查询结果

在创伤性深静脉血

栓形成过程中，在各个生物学状态中，涉及到 的信号通路有FAK、Ca2+、凋亡、Toll-like等， 实验共纳入SD大鼠

CODEN: ZLKHAH

见图3。

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ISSN 1673-8225

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莫建文，等. 创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

Up-regulated Down-regulated

Figure 3

Schematic diagram of focal adhesion signaling pathway 图 3 FAK 信号通路示意图

图 3 是血栓形成组和无血栓形成组对比的差异表 达基因映射入FAK信号通路的结果，上调的有细胞外基 质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因； 下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-jun基因。 3 讨论 有研究报道：骨科大手术术后深静脉血栓的形成率 高达40%~80%[13-16]。既往的研究表明深静脉血栓是一 个涉及多基因， 多系统的疾病[17-20]。 这些基因相互作用， 共同调控着血栓的生物学状态。 细胞黏附不是单纯的机械连接，探讨这些黏附分子 所介导的信号转导过程已成为信息传递领域的新热点。 整合蛋白是广泛存在于各种哺乳动物细胞的主要黏附 分子之一，它引起细胞与基质成分黏附而介导信号转 导，FAK作为胞内第一个信号分子，其研究倍受重视。 FAK广泛分布于血小板、内皮细胞、中性粒细胞和单核 细胞等细胞的胞质中

[21-25]

kinase, MAPK)。MAPK是一类广泛存在于真核细胞中 具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，活化 后可显著增强c-fos和c-jun等基因的表达， FAK作为MAPK 上游关键信号调控分子对细胞迁移起着重要作用[26]。FAK 参与的信号转导途径较多，其中细胞外信号调节激酶 (extracellular-signal regulated protein kinases, ERK) 的激活在FAK调节细胞迁移中较关键[27-29]。 实验中，差异表达基因呈上调趋势的有细胞外基 质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因； 下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun等。 这些基因并非各自孤立，而是通过网络途径紧密连接在 一起，相互影响、相互协调的。其中细胞外基质、蛋白 激酶C、Fyn、整联蛋白α处于FAK信号通路的上游，在 机体接受外界刺激后，这些基因呈现差异表达状态，调 控下游基因，如辅肌动蛋白、Vav、肌球蛋白轻链磷酸 酶等，并将不同基因信号通路整合，起着基因信号交汇 点的作用。FAK信号通道末端效应基因如c-jun基因等异 常表达，呈下调抑制状态，影响细胞功能，调控着细胞 的增殖、分化、细胞周期等，从而影响血管内皮细胞功 能进而影响着血栓的状态。因此，推测FAK信号通路通 过上述基因参与调控血栓的生物学状态。 综上所述，实验提示血管内皮细胞的功能受FAK信 号通路调控，进而影响着血栓的形成。在临床上，一方

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，在细胞迁移中发挥作用，首

先是磷酸化激活。FAK活化后，第397位的酪氨酸发生 自身磷酸化，成为Src家族激酶具有高亲和力的结合位 点，二者结合形成FAK/Src复合体，并进一步促进其自 身磷酸化。接着通过信号转导，激活Ras蛋白，后者活 化 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein

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莫建文，等. 创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

www.CRTER.org [20] Guzmán N, Salazar LA. Frequency of prothrombotic risk factors in patients with deep venous thrombosis and controls: their implications for thrombophilia screening in Chilean subjects. Genet Test Mol Biomarkers. 2010;14(5):599-602. Sasaki H, Nagura K, Ishino M, et al. Cloning and characterization of cell adhesion kinase beta, a novel protein tyrosine kinase of the focal adhesion kinase subfamily. J Biol Chem. 1995;270(36): 21206-21219. Jones ML, Shawe-Taylor AJ, Williams CM, et al. Characterization of a novel focal adhesion kinase inhibitor in human platelets. Biochem Biophys Res Commun. 2009;389(1):198-203. Tavora B, Batista S, Reynolds LE, et al. Endothelial FAK is required for tumour angiogenesis. EMBO Mol Med. 2010;2(12): 516-528. Kasorn A, Alcaide P, Jia Y, et al. Focal adhesion kinase regulates pathogen-killing capability and life span of neutrophils via mediating both adhesion-dependent and -independent cellular signals. J Immunol. 2009;183(2):1032-1043. Park YM, Febbraio M, Silverstein RL. CD36 modulates migration of mouse and human macrophages in response to oxidized LDL and may contribute to macrophage trapping in the arterial intima. J Clin Invest. 2009;119(1):136-145. Saleem S, Li J, Yee SP, et al. beta1 integrin/FAK/ERK signalling pathway is essential for human fetal islet cell differentiation and survival. J Pathol. 2009;219(2):182-192. Chen YC, Lee DC, Tsai TY, et al. Induction and regulation of differentiation in neural stem cells on ultra-nanocrystalline diamond films. Biomaterials. 2010;31(21):5575-5587. Han H, Du B, Pan X, et al. CADPE inhibits PMA-stimulated gastric carcinoma cell invasion and matrix metalloproteinase-9 expression by FAK/MEK/ERK-mediated AP-1 activation. Mol Cancer Res. 2010;8(11):1477-1488. Li Y, Wang JP, Santen RJ, et al. Estrogen stimulation of cell migration involves multiple signaling pathway interactions. Endocrinology. 2010;151(11):5146-5156.

面有望通过检测 FAK 信号通路中上述基因对应的分子 标志物从而早期准确判断机体血栓状态；另一方面通过 干扰其中的途径就有可能预先中止血栓的形成，从而为 临床深静脉血栓的防治提供一种新的思路。

[21]

[22]

4 参考文献

[1] [2] [3] [4] [5] Xu B. DVT in acute stroke--the use of graduated compression stockings. Aust Fam Physician. 2010;39(6):485-487. Kong KH, Chua SG. Deep vein thrombosis based on D-dimer screening in ischaemic stroke patients undergoing rehabilitation. Singapore Med J. 2009;50(10):971-975. Mehta KV, Lee HC, Loh JS. Mechanical thromboprophylaxis for patients undergoing hip fracture surgery. J Orthop Surg (Hong Kong). 2010;18(3):287-289. Roberts A, Young WF. Prophylactic retrievable inferior vena cava filters in spinal cord injured patients. Surg Neurol Int. 2010;30(1): 68. Ashrani AA, Silverstein MD, Lahr BD, et al. Risk factors and underlying mechanisms for venous stasis syndrome: a population-based case-control study. Vasc Med. 2009;14(4): 339-349. McAndrew CM, Fitzgerald SJ, Kraay MJ, et al. Incidence of postthrombotic syndrome in patients undergoing primary total knee arthroplasty for osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res. 2010; 468(1):178-181. Tseng WP, Su CM, Tang CH. FAK activation is required for TNF-alpha-induced IL-6 production in myoblasts. J Cell Physiol. 2010;223(2):389-396. Huang J, Zheng DL, Qin FS, et al. Genetic and epigenetic silencing of SCARA5 may contribute to human hepatocellular carcinoma by activating FAK signaling. J Clin Invest. 2010;120(1): 223-241. Sugimura K, Fukumoto Y, Nawata J, et al.Hypertension promotes phosphorylation of focal adhesion kinase and proline-rich tyrosine kinase 2 in rats: implication for the pathogenesis of hypertensive vascular disease. Tohoku J Exp Med. 2010;222(3):201-210. Dasari VR, Kaur K, Velpula KK, et al. Downregulation of Focal Adhesion Kinase (FAK) by cord blood stem cells inhibits angiogenesis in glioblastoma. Aging (Albany NY). 2010;2(11): 791-803. Dun ZN, Zhang XL, An JY, et al. Specific shRNA targeting of FAK influenced collagen metabolism in rat hepatic stellate cells. World J Gastroenterol. 2010;16(32):4100-4106. Mo JW, Huang H, Zhang CQ, et al. Zhongguo Jijiu Yixue. 2008; 28(3):244-246. 莫建文,黄河,张春强,等. 创伤性深静脉血栓形成中补体相关基因表 达变化的实验研究.中国急救医学,2008,28(3):244-246. Sokolowska B, Piecuch W, Walter-Croneck A, et al. Evaluation of selected Parameters of blood coagulation and the fibrinolysis system in Patients undergoing total hip replacement. Przegl Lek. 2002;59(7):502-508. Colwell CW. The ACCP guidelines for thromboprophylaxis in total hip and knee arthroplasty. Orthopedics. 2009;32(12 Suppl):67-73. Chotanaphuti T, Foojareonyos T, Panjapong S, et al. Incidence of deep vein thrombosis in postoperative hip fracture patients in Phramongkutklao Hospital. J Med Assoc Thai. 2005;88( Suppl 3): S159-163. Yamaguchi T, Hasegawa M, Niimi R, et al. Incidence and time course of asymptomatic deep vein thrombosis with fondaparinux in patients undergoing total joint arthroplasty. Thromb Res. 2010; 126(4):e323-326. Akhter MS, Biswas A, Ranjan R, et al. The nitric oxide synthase 3 gene polymorphisms and their association with deep vein thrombosis in Asian Indian patients. Clin Chim Acta. 2010; 411(9-10): 649-652. Vergeer M, Cohn DM, Boekholdt SM, et al. Lack of association between common genetic variation in endothelial lipase (LIPG) and the risk for CAD and DVT. Atherosclerosis. 2010;211(2): 558-564. Ikejiri M, Wada H, Sakamoto Y, et al. The association of protein S Tokushima-K196E with a risk of deep vein thrombosis. Int J Hematol. 2010;92(2):302-305.

[23] [24]

[25]

[26] [27] [28]

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[7] [8]

[29]

[9]

来自本文课题的更多信息-基金资助：广东省自然科学基金面上项目(915101820

1000035)，课题名称：蛋白质组学研究对创伤性深静脉血 栓形成早期诊断的价值。

[10]

作者贡献：莫建文进行实验设计，实验实施为莫建文、

胡海澜，实验评估为李颖，资料收集为邓晋京、张姝江，莫 建文、陈艺成文，白波审校，莫建文对文章负责。

[11] [12]

利益冲突： 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济

组织直接或间接的经济或利益的赞助。

[13]

伦理批准： 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和

国科学技术部 2006 年颁布的《关于善待实验动物的指导性 意见》的相关要求。

[14] [15]

本文创新性：

提 供 证 据 ： 检 索 CNKI(2007/2010) 和 Pubmed (2002/2010)数据库，中英文检索词分别为“创伤、并发症、 高危因素、深静脉血栓形成、黏着斑激酶信号通路、基因芯 片”和“trauma, complication, high risk factor, deep vein thrombosis, fak signaling pathway, genechip” 。 检索结果中 未见 FAK 信号通路在创伤后深静脉血栓形成过程中的作用 的报道。 创新点说明： 实验首次应用血清蛋白质组学技术及基因 芯片技术对创伤性深静脉血栓形成进行研究， 旨在发现能准 确早期诊断创伤后深静脉血栓形成的分子标志物。

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创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路*☆

莫建文1，胡海澜2，白 波1，李 颖1，张姝江1，陈 艺1，邓晋京1

Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis

Mo Jian-wen1, Hu Hai-lan2, Bai Bo1, Li Ying1, Zhang Shu-jiang1, Chen Yi1, Deng Jin-jing1

Abstract

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Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; 2 Department of Orthopaedics, the Second Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China Mo Jian-wen☆, Doctor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China [email protected] Correspondence to: Bai Bo, Professor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China [email protected] Supported by: the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. [**************]5* Received: 2010-11-25 Accepted: 2011-01-30

BACKGROUND: The molecular mechanism of traumatic deep vein thrombosis is complex. The influence of focal adhesion kinase (FAK) signaling pathway on the development of deep vein thrombosis remains poorly understood. OBJECTIVE: To study the effects of FAK signaling pathway in traumatic deep vein thrombosis. METHODS: Twenty SD rats were prepared for femoral fracture models and divided into 2 groups according to thrombosis states, namely, the thrombosis and no thrombosis groups, with 10 animals in each group. Additional 10 rats served as controls. The femoral vein was incised and total RNA was extracted. The femoral vein RNA expression was detected by Genechip Rat genome 430 2.0 genechips, and the changes of FAK signaling pathway gene was analyzed. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with no thrombosis group, the key genes of thrombosis group related to FAK signaling pathway of extracellular matrix, protein kinase C, Fyn, actinin and Vav were up-regulated, and integrinα, myosin light chain phosphatase and c-Jun were down-regulated. FAK signaling pathway may be one of the most important pathways to control the biological states of thrombus. Mo JW, Hu HL, Bai B, Li Y, Zhang SJ, Chen Y, Deng JJ. Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(15): 2790-2793. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要

背景：创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂，黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。 目的：探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。 方法：取 20 只 SD 大鼠制备股骨骨折模型。造模后 5 d，根据血栓形成情况将模型大鼠分为 2 组：血栓形成组和无血栓形成 组，每组 10 只。另取 10 只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织，抽取总 RNA，Genechip Rat Genome 430 2.0 芯片测定股静脉 RNA 的表达，并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。 结果与结论：与无血栓形成组比较，血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶 C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav 等关键基因均上调；下调的有整联蛋白 α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun 基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血 栓生物学状态的重要信号通路。 关键词：创伤；深静脉血栓形成；黏着斑激酶信号通路；基因芯片 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.15.031 莫建文，胡海澜，白波，李颖，张姝江，陈艺，邓晋京.创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路[J].中国组织工程研 究与临床康复，2011，15(15):2790-2793. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

实验旨在探讨该通路对血栓形成的影响，以 0 引言 创伤性深静脉血栓是指由于创伤/手术等因 素引起的静脉栓塞性疾病，具有极大的潜在危 害性，如栓子脱落可引发致命性肺栓塞、脑梗 死及深静脉瓣膜功能不全等[1-6]，该疾患被公认 为创伤/术后严重的并发症之一。静脉血栓形成 是三大血栓性疾病(心肌梗死、缺血性卒中及静 脉血栓)之一，是多因素致病的疾病，多发生于 严重创伤及骨科大手术后的患者。 黏着斑激酶 (focal adhesion kinase, FAK) 是一种非受体型的酪氨酸激酶， 主要参与整合 素介导的信号传导，在细胞迁移、分化等多方 面具有重要影响 [7-11]。FAK信号通路在创伤性 深静脉血栓形成过程中的作用机制尚未明了。 设计：随机对照动物实验。 时间及地点：于2008-10/2009-10在广州 呼吸疾病研究所实验室完成。 材料：

实验动物：健康SPF级SD大鼠30只，体质

期进一步了解创伤性深静脉血栓的发病机 制。 1 材料和方法

量(250±20) g，雌雄不限。购于广东省医学实 验动物中心， 许可证号： SCXK(粤)2003-0002。 动物饲养于国家呼吸疾病研究所动物实验中 心，室温20~25 ℃，光线、通风良好，自由饮 水、进食。适应性喂养2周。

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com

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试剂和仪器：

试剂及仪器 彩色病理图像分析仪 总 RNA 抽提试剂盒 基因芯片，扫描仪，芯片 分析软件 来源 日本 OLYMPUS 公司 美国 invitrogen 公司 美国 Affymetrix, West Sacramento 公司

30只，均进入结果分析。 2.2 股静脉组织的总RNA提取及电泳图 各 组股静脉组织总 RNA 的 A260/A280 介于 1.8~2.0 之间。 琼脂糖凝胶电泳显示， 28 S RNA和18 S RNA条带整齐， 28 S与18 S的吸光度值之比约 为2，说明制备的总RNA样品完整性好、质量 高、无降解，见图1

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广州医学院第一 附属医院骨科， 广 东 省 广 州 市 510120；2 广州医 学院第二附属医 院骨科， 广东省广 州市 510260 莫建文☆，男， 1978 年生，广东 省肇庆市人，汉 族，2008 年昆明 医学院毕业，博 士， 主要从事创伤 后深静脉血栓形 成的基础与临床 研究。 mjw1997@126. com 通讯作者：白波， 教授， 广州医学院 第一附属医院骨 科， 广东省广州市 510120 drbobai@yahoo. com

方法：

动物模型的建立及分组：从30只SD大鼠中随

机取20只，参照文献的方法进行造模[12]。实验 大鼠不麻醉， 采用定量打击装置进行定点打击， 瞬间打击能量为5 J。大鼠俯卧位，击打大鼠双 侧后肢大腿近端外侧各1次(大转子至大转子下 1 cm)造成股骨骨折后，均行髋人字石膏固定。 造模后5 d，取材进行镜下观察，根据血栓形成 情况将模型大鼠分为2组： 血栓形成组和无血栓 形成组，每组10只。另外10只大鼠不造模，正 常饲养作为对照组。

取材：造模后5 d，大鼠麻醉后，无菌条件

A B C A: control group; B: thrombosis group; C: no thrombosis group 28 S 18 S

Figure 1 图1

Total RNA electrophoretogram of 3 groups specimens 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图

中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)15-02790-04 收稿日期： 2010-11-25 修回日期： 2011-01-30 ([1**********]/WLM ·Z)

下沿双侧大腿股静脉走行切开皮肤约3 cm，暴 露双侧股静脉及主要属支，无创分离动静脉， 切取长约3 cm的股静脉及主要属支，有血栓形 成的血管去除血管内的血栓，并用生理盐水冲 洗干净管壁及管腔内的血液， 迅速放入冻存管， 置入液氮罐保存。

基因表达谱芯片检测： Trizol一步法提取上述

2.3

差异基因表达情况

经扫描分析，得到

差异表达的基因。与对照组比较，血栓形成组 共有1 906个差异表达基因，其中，上调1 590 个，下调316个。无血栓形成组与对照组比较 共有1 568个差异表达基因，其中，上调1 103 个，下调465个，见图2。

3组股静脉标本总 RNA，并进行纯化和质检。 以各组总RNA为模板合成双链cDNA；体外转 录生成生物素标记的 cRNA；纯化和片段化处 理 后 ， 取 10 µg cRNA 与 Genechip Rat Genome 430 2.0芯片进行杂交、洗脱、染色 扫描检测信号。

芯片图像的采集与数据分析：采用Affymetrix

扫描仪进行扫描，采用芯片分析软件(5.0版)进 行分析。差异表达基因的判断标准为：change 为 I ， Ratio≥1 ，血栓形成组和无血栓形成组 Detection 为 P 的 为 上 调 基 因 ； change 为 D ， Ratio≤ -1， 对照组Detection为P的为下调基因。

pathway 查 询 分 析 ： 通 过 kegg pathway

a: Control group

b: Thrombosis group

database(www.genome.jp/kegg/) 查 询 差 异 基 因参与的pathway信号传导通路。 主要观察指标：FAK信号通路基因表达的 变化。 2.4 2 结果 2.1 实验动物数量分析

CN 21-1539/R

c: No thrombosis group

Figure 2 Gene expression in rats 图 2 各组大鼠基因的表达情况

pathway 查询结果

在创伤性深静脉血

栓形成过程中，在各个生物学状态中，涉及到 的信号通路有FAK、Ca2+、凋亡、Toll-like等， 实验共纳入SD大鼠

CODEN: ZLKHAH

见图3。

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ISSN 1673-8225

www.CRTER.org

莫建文，等. 创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

Up-regulated Down-regulated

Figure 3

Schematic diagram of focal adhesion signaling pathway 图 3 FAK 信号通路示意图

图 3 是血栓形成组和无血栓形成组对比的差异表 达基因映射入FAK信号通路的结果，上调的有细胞外基 质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因； 下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-jun基因。 3 讨论 有研究报道：骨科大手术术后深静脉血栓的形成率 高达40%~80%[13-16]。既往的研究表明深静脉血栓是一 个涉及多基因， 多系统的疾病[17-20]。 这些基因相互作用， 共同调控着血栓的生物学状态。 细胞黏附不是单纯的机械连接，探讨这些黏附分子 所介导的信号转导过程已成为信息传递领域的新热点。 整合蛋白是广泛存在于各种哺乳动物细胞的主要黏附 分子之一，它引起细胞与基质成分黏附而介导信号转 导，FAK作为胞内第一个信号分子，其研究倍受重视。 FAK广泛分布于血小板、内皮细胞、中性粒细胞和单核 细胞等细胞的胞质中

[21-25]

kinase, MAPK)。MAPK是一类广泛存在于真核细胞中 具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，活化 后可显著增强c-fos和c-jun等基因的表达， FAK作为MAPK 上游关键信号调控分子对细胞迁移起着重要作用[26]。FAK 参与的信号转导途径较多，其中细胞外信号调节激酶 (extracellular-signal regulated protein kinases, ERK) 的激活在FAK调节细胞迁移中较关键[27-29]。 实验中，差异表达基因呈上调趋势的有细胞外基 质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因； 下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun等。 这些基因并非各自孤立，而是通过网络途径紧密连接在 一起，相互影响、相互协调的。其中细胞外基质、蛋白 激酶C、Fyn、整联蛋白α处于FAK信号通路的上游，在 机体接受外界刺激后，这些基因呈现差异表达状态，调 控下游基因，如辅肌动蛋白、Vav、肌球蛋白轻链磷酸 酶等，并将不同基因信号通路整合，起着基因信号交汇 点的作用。FAK信号通道末端效应基因如c-jun基因等异 常表达，呈下调抑制状态，影响细胞功能，调控着细胞 的增殖、分化、细胞周期等，从而影响血管内皮细胞功 能进而影响着血栓的状态。因此，推测FAK信号通路通 过上述基因参与调控血栓的生物学状态。 综上所述，实验提示血管内皮细胞的功能受FAK信 号通路调控，进而影响着血栓的形成。在临床上，一方

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com

，在细胞迁移中发挥作用，首

先是磷酸化激活。FAK活化后，第397位的酪氨酸发生 自身磷酸化，成为Src家族激酶具有高亲和力的结合位 点，二者结合形成FAK/Src复合体，并进一步促进其自 身磷酸化。接着通过信号转导，激活Ras蛋白，后者活 化 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein

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面有望通过检测 FAK 信号通路中上述基因对应的分子 标志物从而早期准确判断机体血栓状态；另一方面通过 干扰其中的途径就有可能预先中止血栓的形成，从而为 临床深静脉血栓的防治提供一种新的思路。

[21]

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来自本文课题的更多信息-基金资助：广东省自然科学基金面上项目(915101820

1000035)，课题名称：蛋白质组学研究对创伤性深静脉血 栓形成早期诊断的价值。

[10]

作者贡献：莫建文进行实验设计，实验实施为莫建文、

胡海澜，实验评估为李颖，资料收集为邓晋京、张姝江，莫 建文、陈艺成文，白波审校，莫建文对文章负责。

[11] [12]

利益冲突： 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济

组织直接或间接的经济或利益的赞助。

[13]

伦理批准： 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和

国科学技术部 2006 年颁布的《关于善待实验动物的指导性 意见》的相关要求。

[14] [15]

本文创新性：

提 供 证 据 ： 检 索 CNKI(2007/2010) 和 Pubmed (2002/2010)数据库，中英文检索词分别为“创伤、并发症、 高危因素、深静脉血栓形成、黏着斑激酶信号通路、基因芯 片”和“trauma, complication, high risk factor, deep vein thrombosis, fak signaling pathway, genechip” 。 检索结果中 未见 FAK 信号通路在创伤后深静脉血栓形成过程中的作用 的报道。 创新点说明： 实验首次应用血清蛋白质组学技术及基因 芯片技术对创伤性深静脉血栓形成进行研究， 旨在发现能准 确早期诊断创伤后深静脉血栓形成的分子标志物。

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