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&%%%年)月
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""微生物学报!"#$%&"’()&(*(&"$,&-&"$+0I8>$%HI>+JD
猪瘟病毒的形态结构与形态发生!
王镇闵光伟李明义藤俊琳丁明孝
（北京大学生命科学学院北京’）%%!,’
摘要：建立了猪瘟病毒（-弱毒疫苗1（1株）与中国兔化弱毒疫苗-株在./0）23456478株
其病毒滴度明显提高，从而为应用电9:;细胞中的感染模式。使用9:;细胞增殖-./0，
镜超薄切片技术研究猪瘟病毒的形态结构与形态发生提供了可能性。猪瘟病毒呈圆形颗粒，直径约为,直径约为$有时呈六角形；外有包膜包裹。%
可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。此外，猪瘟在-./0感染的9:;细胞质中，
病毒的感染能够引起某些宿主细胞超微结构上的变化。
，超微结构，形态发生，电子显微镜技术关键词：猪瘟病毒（-./0）
中图分类号：.!"&>)"文献标识码：?文章编号：（）%%%’*)&%(&%%%%+*%&+,*$&
猪瘟病毒（-，-属瘟病毒属（:）、黄病毒科87@@3A78@B3
［］’（/），是一种严重危害养猪业的正链G被《国际动物卫生法典》列为87434363F75H?病毒，
［］猪瘟病毒一直被列为我国家畜病害研究及兽病?类’)种法定传染病之一&。长期以来，
检测与防治的一个重点项目。近些年来，虽然已测出几株-并且对其./0基因组全序列，表达的蛋白功能也有了不同程度的了解。但由于-其形态./0在体外细胞中增殖力弱，学研究依然非常困难。至今在国内外对-./0的形态结构及其在宿主细胞内成熟和释放
［，］+$过程仍知之甚少，甚至对病毒粒子的大小的报导也各不相同，幅度在+%!!%
［］"!(间。
以-（1株）和中国兔化弱毒疫苗-株感染的9./0法国弱毒疫苗123456478株:;细胞及野毒株（/株）感染的:较为系统地对-;’"为实验材料，./0的形态结构及其宿主细胞的超微病变进行了观察，在此基础上侧重研究了猪瘟病毒1株在9:;细胞中的增殖过程。由于我们建立的猪瘟病毒1株与-株在9病毒滴度明:;细胞中的感染模式，
［］’%显提高，从而有可能在电镜下清晰地观察到-并为今后深入研究其./0的形态结构，
形态发生过程的细节提供了可能性。
!材料和方法
!>!材料
（?；-./0毒株由中国兽药监察所提供；:;’"细胞购于美国典型培养物中心1--）
在本室培养至第"代。9:;细胞由意大利/566763教授惠赠，
（）和国家重点基础研究发展规划项目资助!国家攀登计划!"#$$#%&#%"
作者简介：王镇（，女，山东人，北京大学生命科学学院讲师，博士，现为美国纽约大学博士后，主要从事’()(*）
细胞生物学和病毒学研究
，修回日期：收稿日期：’((!#’&#+%’(((#%$#&+
卷
!!"方法
用"#!!"!!细胞培养及病毒感染：$#培养液加%&’胎牛血清作为#()细胞的培养
液（）。维持液加.+,-%’胎牛血清。用"#$#培养液加/&’胎牛血清作为()/.细胞*
的培养液（）。维持液加%于0+,-%’胎牛血清。待细胞接近长满单层时接毒，,1感作*
用+加维持液培养，，。/2后，3456洗涤，789:;株、9株培养?2
对照细胞及7!!"!"电镜样品制备：89:;株、7株感染的#()细胞及9株感染的
／从细胞培养瓶中刮取，离心沉淀的细()/.细胞用&-/@ABC*+,-%的(D8缓冲液洗涤，
胞用%再用/-.’戊二醛预固定，’锇酸固定。常规梯度脱水后包埋于$A4E=/%树脂中。*
超薄切片用%于7’醋酸双氧铀、&-%’柠檬酸铅染色后，#/%&DFAGHF4电镜下观察。
将细胞培养在/接近长满单层时，用一定!!"!#免疫荧光技术：&@@I/&@@的盖片上，
稀释度的7，加维持液培养。;株培89:7株、;株于0,1分别感作/2+3456液洗涤后，
养%；。用&／（含&）冲洗盖片，自J7株培养
然干燥后在固定剂中固定/，干燥备用。未接毒的细胞按同样方法处理作为对照组。.@F4
用&／加入抗7-&/@ABC*+,-%的(D8缓冲液冲洗细胞后，89:多抗或单抗，0,1温育/；加9／2(D8缓冲液冲洗，/’D8L封闭后，M;7标记的二抗温育。&-&/@ABC*+,-%的(甘油封片后于N或D8缓冲液反复冲洗，B@P6荧光显微镜下.4@激发波长观察，O*
于激光共聚焦显微镜CQFR3"#SD$下观察。
"实验结果
"!!猪瘟病毒增殖的一步生长曲线
子
#(
#(
到
;7
度
粒相
D期王镇等：猪瘟病毒的形态结构与形态发生*DC要存在于细胞内，特别是在核周的某些区域荧光更强，可清楚地勾画出细胞核的轮廓。在细胞质中，在某些区域中荧光很强（图版%。使用抗!"#$抗原也并非均匀分布，&’，&(）
也得!"#$包膜蛋白)*和抗!"#$非结构蛋白+&*,的单克隆抗体进行免疫荧光检测，
到了类似的结果（图版%。与+&!，&-）&*,相比，!"#$的)*蛋白在感染细胞中的分布更不均质，免疫荧光染色后，其特异性的荧光呈明显的斑状分布。根据免疫荧光技术检测到的!为进一步在电镜下观察病毒的形态"#$结构及非结构蛋白在其宿主细胞中的部位，
发生奠定了基础。
!."猪瘟病毒的形态结构与形态发生
在病毒感染晚期的细胞表面与细胞内均可观察到成熟的!.".#猪瘟病毒的形态与大小：
病毒样粒子。病毒粒子呈球形，直径较为均一，多在/有包膜（图版%，图版%,01左右，*%
，内含2某些核衣壳呈清晰的六角形。!&箭头）,01的电子致密的核衣壳，"#$疫苗株3株与!株及野毒#株形态相似，大小无明显差异（图版%，图版%）。*%
在!粗面内质网与高尔基体周围常常可见!.".!病毒的形态发生："#$感染的细胞中，
各种囊泡。根据其形态与大小可清楚地辨认出它们多属于!（）包被的运输456789:79;
小泡（图版%，而并非病毒粒子。在胞质中也可观察到直径与病毒核衣壳直径%%&箭号）
（约2类似的电子致密球形颗粒，它们很可能代表处于不同装配阶段的病毒核衣壳。,01）
有时可观察到上述颗粒结构聚集在一起（图版%。偶而在一些囊泡中可观察到%%&箭头）
病毒样粒子，但无法确认囊泡是属内质网还是高尔基体膜泡。细胞质中的病毒常常分散存在于较大的膜囊结构中，其中充满了无定型基质（图版%，图版%）。有时可观察到*%*
这种膜结构开口于细胞外，因而细胞表面的病毒也多包囊在絮状无定形基质中（图版%%%）。偶尔可见吸附在细胞表面的病毒样粒子（图版%，尚不知它们是正侵入细胞*%&箭号）
还是正在出芽释放的病毒。值得注意的是：细胞外分散存在于无定型絮状基质中的某些病毒粒子的包膜不完整，似乎是受到某种水解作用的结果（图版%。%%*箭号）
!.$缩主细胞的超微病变
虽然!（，，但在电"#$感染的细胞在光镜下检测不到病理变化69789>
镜下却可以观察到某些细胞在超微结构水平上发生的一些明显病理变化。如细胞的核膜发生皱褶，以至某些细胞核呈多形性。有时可见细胞内质网池扩张（图版%），以及线%%&
粒体肿胀（图版%）等现象。此外，胞质中也常常可见大量纤维结构（图版%*，图版%*%%）。这些显然都与病毒的感染有关。*
"讨论
虽然人们对!但对其形态发生过程至今尚不清楚，"#$的超微结构进行了一些研究，
只是推测猪瘟病毒的核衣壳是在细胞中装配，并通过内质网或高尔基体以出芽的方式披上包膜，发育成为成熟的病毒。成熟病毒以何种方式向外释放也未见报导。其主要原因可能有两个方面：一是!从而加大了对其形态学研究的难度。二是需要适时"#$滴度低，
取材，即在!"#$形态发生过程高峰时固定样品。由于我们建立了!"#$@A5B细胞的感
［］&,染模式，子代病毒滴度明显提高。同时对!"#$感染的一步生长曲线及细胞中病毒抗
原的变化时相的分析，也为!"#$的超微形态学研究打下了基础。
+.-微生物学报.-卷本实验首先使用免疫荧光法对!"#$抗原在宿主细胞内的存在部位进行检测。使用抗!结果表明!"#$的多克隆抗体检测!"#$%株及!株感染的&’()细胞，"#$抗原主要存在于感染细胞质中，尤其是细胞核周围的区域。进一步使用抗!"#$包膜蛋白*+及非结构蛋白,它存在的部位在(+-的单克隆抗体进行检测。*+是!"#$的结构蛋白，
一定程度上反应出!(+-在病毒复制过程中起重"#$的成熟与在细胞内聚集的部位。,
［］((!(.要的作用，它存在的部位在一定程度上反映了病毒在胞内的复制部位。实验结果表明有丰富内膜系统的细胞核周围是!"#$在胞内增殖的主要部位。
（%株、，大小较均一，为/我们所观察到的!"#$三株病毒!株和#株）-01左右。
偶尔也可观察到直径大于/-01的病毒样颗粒。对瘟病毒属病毒粒子大小的报导一直有很大的差异。其中包括形态学研究最多的该属代表种———牛病毒性腹泻病毒（234506
［)］!(/，。早期报导2，后来倾向于2$>$）$>$的大小为+-!(--01(45789:5877;368457
［@，］［-］(A，但仍有人认为2.-!?-01($>$的大小随宿主细胞的种类不同而异+
病!"#$%株的超微结构研究尚未见报导。(A@A年龚人雄等首次报导纯化的!株，
［］毒大小为B-!/-01/。(AA/年丘惠深等从得猪瘟的病猪体内分离并加以纯化的四种
［］!"#$田间野毒的电镜观察结果也在同一范围之内A。然而这些观察基于病毒纯化并经
纯化过程可能造成病毒粒子有不同程度的损伤。负染色制样，由于!"#$病毒包膜脆弱，
相比之下，超薄切片可能更为真实地反映病毒的形态与大小。当然，应用不同的电镜制样
［］+(技术所观察到的病毒形态与大小也有所差异。
细胞质中成熟的病毒粒子多见于充满无定型基质的膜囊中。有时可观察到膜囊在质膜处的开口以及周围的无定型基质和其中的成熟病毒。提示!"#$可能是通过这一特殊结构向外释放，且多数释放的病毒依然吸附在无定型基质中。这与前人关于释放的病毒
［］+主要是吸附或结合在细胞质膜上的推测不同。
［)，］(@目前尚未观察到瘟病毒出芽成熟的过程，包括该属的代表种2。其可能的$>$(
原因是胞质中病毒核衣壳数量很少，且出芽过程较为迅速。我们曾在辛德毕斯病毒（，的?观察到大量正在出芽成熟的子代病"50:C5=457
［，］+++B毒。显然，构建与之相似的!或以某种方式阻断病毒出芽成熟的过程，"#$突变株，
将有助于对这一过程及其作用机制的深入了解。此外，释放到细胞外的某些病毒粒子，其形态结构已不完整，这也可能是对其大小报道不一且病毒滴度较低的原因之一。
光镜下!但电镜下，某些细胞却表现出明显"#$感染的细胞虽不产生明显的!&*，
的病变现象，如：内质网池扩张，线粒体肿胀，胞质小泡数量明显增加等，尤其是细胞核形态发生了改变以及胞质中出现的大量纤维结构，此外，宿主细胞的细胞核也发生形变，产生了指状突起，严重的呈多叶状。我们使用>D&E染色在荧光显微镜下也观察到了
［］(-“调亡小体”样结构。这些都反映了!!"#$感染细胞核的形变或裂解成"#$增殖对
宿主细胞不同程度的影响。研究!"#$的形态发生过程及其对宿主细胞的影响有助于深入地了解!"#$的复制过程及其致病机理。
参考文献
［(］F：，，（）60967HI#[1**********]5:86IE0#780K;5LE2#8P!"#$%6:!98==5Q5K8N53080:GJ#M
@期王镇等：猪瘟病毒的形态结构与形态发生?D=
，0，!"#$%&’()*+$",-.+*/$/.,)12$"+)",)1$4%)$+%()."%(’5"%##.))$$"%6(7"%"#,-.+*/$/9+.%$+38"3:
，，-$+’(,;$+’.%>=??@!?@@
［?］殷震，刘景华>ABC?!BBD
［@］E，：$$+/F，2*#$%(,6，61.$’GHIJ>!"!CCC!CBA
［D］E，E，：""+#(%%2IE，K(%F$%%..$M$#(FNO，&’(%)*!"#$%，=>>B"#AB@!AAP
［C］Q，O，：%R#(%%LI$.’(%M0AJ$"@@>!@DJ
［B］S，：(*M$GAA$%D=!C=
［A］龚人雄，陈太平，张晓琴，等J>"D!A
［J］李成，赫桂玉，谷守林，等J>"?D!?C
［>］丘惠深，郎洪武，王在时
大疫病免疫防制研究>A=PP!=PD
［］王镇，陆宇，周鹏程，等>>&’@=J>!=>C
［］O，：==./T$+&1$%E，5"’’$))E9>=!(%@D=!@CP
［］6，，，：=?(#*+(IN，O(++$%$+L5"’’$))E9!"#$%，=>>@!’&=!=P
［］O，，：=@(++$%$+L5"’’$))E9>C)’=A?P!=A?B
［］，，，，：=D6(*)R!E$$+/F61.$’GHI>@!’"AD!JC
［］U，：=C1#(%%;G，;’"&1;J?"!CA!AD
［］5，：=B1(/$2"$M$+LSJ=)"@?C!@@?
［］O，，：=A(+MW59N($X$+’$ESJD%$=BC!=AP
［］F，：=J+(!$))’$)"%L0JA)(?@@>!?@DB
［］张荣兴，王新华，葛锡锐=>>C!#JB!>=
［］5，，：?P1*GHIY$$Z5JD%$JDC!JCP
［］丁明孝，焦仁杰，梁风霞，等>=!#=PB!===
［］F，：??$M.TH!.)/&1T"N，V.%W(&1’$K&’(%)!"#$%，=>>P!"$?J?!?>=
［］梁风霞，丁明孝>@(??B!?@D
*+,-./0+123/451/6/789:654/92**807/;96:**89:6
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=?=微生物学报?;
卷
图版说明
!"$%&%’()&)*$%’+,##
图版-
（免疫荧光技术检测），示激光共聚焦荧光显微镜下3（8）和3./猪瘟病毒抗原在01.2细胞中的定位4567株
株（9）感染细胞中病毒抗原的定位（；以及3（3）和非结构蛋白#（>）在胞内的分布:;;
。（?;;
（，）。成熟的病毒（箭头）散在于胞质中含有无定型基质=/猪瘟病毒7株感染的@01细胞中成熟的病毒粒子%A
（!）的囊泡中。细胞的线粒体肿胀（@），胞质中出现大量纤维（5）。（箭号）（标尺B%示六角形的病毒核衣壳
（插图标尺B=2;&C）.;;&C）
图版--
（大箭头）和释放在细胞外的成熟病毒粒子（小箭头）。偶./猪瘟病毒7株感染的@01细胞中存在于胞质囊泡中
尔可见存在于细胞表面的病毒粒子（箭号）（标尺BD;;&C）
猪瘟病毒3株感染的@（箭号）中的成熟病毒粒子（标尺B=/01细胞中散在于含有无定型基质的胞质囊泡
=;;&C）
图版---
（箭号）及聚集的直径?（箭./猪瘟病毒感染的@01细胞中3E0包被的运输小泡;C&左右的病毒核衣壳样颗粒
头）（标尺B?;;&C）
（箭头），示无定型絮状基质（!）和可能部分降解的病毒粒子（箭号）（标尺B=/释放到细胞外的3456病毒粒子
D;;&C）
0$%’+-
（），./7F+$)G%$(H%’()&)*3456%&’(+&(&01.2G+$$,J+’+G’+JA(CCL&)*$L)M+,G+&G+’+GF&(L+,F)O(&+$$,(&*+G’+JIKNI3
（8）（9）（，；A4567,’M%(&%&J3,’M%(&L&J+MG)&*)G%$C(GM),G)+:;;
（3）（>）（%&J&)&P,’MLG’LM%$M)’+(&#.=2)*3456?;;
（，）（）=/7F+C%’LM+Q(M%$%M’(G$+,(&@01G+$$,(&*+G’+JA4567,’M%(&%A/6(M%$%M’(G$+,%MM)OF+%J%M+,LMM)L&J+J#K3#
!（），AC)MF)L,*$)GGL$%MC%’+M(%$(&’F+G’)$%,C(GQ+,(G$+’F+C(’)GF)&JM(%$))R,,O+$$(&&J’F+M+%M+%$%M+K%#K#I%I
（5）（9（9%C)L&’)**(AM+(&’F+G’)$%,C/8MM)O,,F)O’F+F+"%)&%$&LG$+)G%,(J,)*3456%MB=2;&C）%M)*(&,+’K#I#
B.;;&C）
0$%’+--
（./7F+C%’LM+Q(M%$%M’(G$+,(&@01G+$$,(&*+G’+JA4567,’M%(&/6(M%$%M’(G$+,%M+(&G’)$%,C(GQ+,(G$+$%M+#K3#K#I
）（），（（9%MM)OF+%J)M)L’,(J+G+$$,,C%$$%MM)OF+%J%&J,)C+’(C+,)&G+$$C+CAM%&+%MM)O）%MBD;;&C）
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（（9AC)MF)L,*$)GGL$%MC%’+M(%$(&Q+,(G$+,%MM)O）%MB=;;&C）K%#
0$%’+---
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（9%MB?;;&C）G’)$%,C)*3456P(&*+G’+J@01G+$$,K#
（），（!）=/7F+M+$+%,+JQ(M%$%M’(G$+,%MM)OF+%J,F)O(&’F+%C)MF)L,*$)GGL$%MC%’+M(%$)L’,(J+G+$$,%&J),,(A$%M’$#I##K#K
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王镇闵光伟李明义藤俊琳丁明孝
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其病毒滴度明显提高，从而为应用电9:;细胞中的感染模式。使用9:;细胞增殖-./0，
镜超薄切片技术研究猪瘟病毒的形态结构与形态发生提供了可能性。猪瘟病毒呈圆形颗粒，直径约为,直径约为$有时呈六角形；外有包膜包裹。%
可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。此外，猪瘟在-./0感染的9:;细胞质中，
病毒的感染能够引起某些宿主细胞超微结构上的变化。
，超微结构，形态发生，电子显微镜技术关键词：猪瘟病毒（-./0）
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［］猪瘟病毒一直被列为我国家畜病害研究及兽病?类’)种法定传染病之一&。长期以来，
检测与防治的一个重点项目。近些年来，虽然已测出几株-并且对其./0基因组全序列，表达的蛋白功能也有了不同程度的了解。但由于-其形态./0在体外细胞中增殖力弱，学研究依然非常困难。至今在国内外对-./0的形态结构及其在宿主细胞内成熟和释放
［，］+$过程仍知之甚少，甚至对病毒粒子的大小的报导也各不相同，幅度在+%!!%
［］"!(间。
以-（1株）和中国兔化弱毒疫苗-株感染的9./0法国弱毒疫苗123456478株:;细胞及野毒株（/株）感染的:较为系统地对-;’"为实验材料，./0的形态结构及其宿主细胞的超微病变进行了观察，在此基础上侧重研究了猪瘟病毒1株在9:;细胞中的增殖过程。由于我们建立的猪瘟病毒1株与-株在9病毒滴度明:;细胞中的感染模式，
［］’%显提高，从而有可能在电镜下清晰地观察到-并为今后深入研究其./0的形态结构，
形态发生过程的细节提供了可能性。
!材料和方法
!>!材料
（?；-./0毒株由中国兽药监察所提供；:;’"细胞购于美国典型培养物中心1--）
在本室培养至第"代。9:;细胞由意大利/566763教授惠赠，
（）和国家重点基础研究发展规划项目资助!国家攀登计划!"#$$#%&#%"
作者简介：王镇（，女，山东人，北京大学生命科学学院讲师，博士，现为美国纽约大学博士后，主要从事’()(*）
细胞生物学和病毒学研究
，修回日期：收稿日期：’((!#’&#+%’(((#%$#&+
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用"#!!"!!细胞培养及病毒感染：$#培养液加%&’胎牛血清作为#()细胞的培养
液（）。维持液加.+,-%’胎牛血清。用"#$#培养液加/&’胎牛血清作为()/.细胞*
的培养液（）。维持液加%于0+,-%’胎牛血清。待细胞接近长满单层时接毒，,1感作*
用+加维持液培养，，。/2后，3456洗涤，789:;株、9株培养?2
对照细胞及7!!"!"电镜样品制备：89:;株、7株感染的#()细胞及9株感染的
／从细胞培养瓶中刮取，离心沉淀的细()/.细胞用&-/@ABC*+,-%的(D8缓冲液洗涤，
胞用%再用/-.’戊二醛预固定，’锇酸固定。常规梯度脱水后包埋于$A4E=/%树脂中。*
超薄切片用%于7’醋酸双氧铀、&-%’柠檬酸铅染色后，#/%&DFAGHF4电镜下观察。
将细胞培养在/接近长满单层时，用一定!!"!#免疫荧光技术：&@@I/&@@的盖片上，
稀释度的7，加维持液培养。;株培89:7株、;株于0,1分别感作/2+3456液洗涤后，
养%；。用&／（含&）冲洗盖片，自J7株培养
然干燥后在固定剂中固定/，干燥备用。未接毒的细胞按同样方法处理作为对照组。.@F4
用&／加入抗7-&/@ABC*+,-%的(D8缓冲液冲洗细胞后，89:多抗或单抗，0,1温育/；加9／2(D8缓冲液冲洗，/’D8L封闭后，M;7标记的二抗温育。&-&/@ABC*+,-%的(甘油封片后于N或D8缓冲液反复冲洗，B@P6荧光显微镜下.4@激发波长观察，O*
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D期王镇等：猪瘟病毒的形态结构与形态发生*DC要存在于细胞内，特别是在核周的某些区域荧光更强，可清楚地勾画出细胞核的轮廓。在细胞质中，在某些区域中荧光很强（图版%。使用抗!"#$抗原也并非均匀分布，&’，&(）
也得!"#$包膜蛋白)*和抗!"#$非结构蛋白+&*,的单克隆抗体进行免疫荧光检测，
到了类似的结果（图版%。与+&!，&-）&*,相比，!"#$的)*蛋白在感染细胞中的分布更不均质，免疫荧光染色后，其特异性的荧光呈明显的斑状分布。根据免疫荧光技术检测到的!为进一步在电镜下观察病毒的形态"#$结构及非结构蛋白在其宿主细胞中的部位，
发生奠定了基础。
!."猪瘟病毒的形态结构与形态发生
在病毒感染晚期的细胞表面与细胞内均可观察到成熟的!.".#猪瘟病毒的形态与大小：
病毒样粒子。病毒粒子呈球形，直径较为均一，多在/有包膜（图版%，图版%,01左右，*%
，内含2某些核衣壳呈清晰的六角形。!&箭头）,01的电子致密的核衣壳，"#$疫苗株3株与!株及野毒#株形态相似，大小无明显差异（图版%，图版%）。*%
在!粗面内质网与高尔基体周围常常可见!.".!病毒的形态发生："#$感染的细胞中，
各种囊泡。根据其形态与大小可清楚地辨认出它们多属于!（）包被的运输456789:79;
小泡（图版%，而并非病毒粒子。在胞质中也可观察到直径与病毒核衣壳直径%%&箭号）
（约2类似的电子致密球形颗粒，它们很可能代表处于不同装配阶段的病毒核衣壳。,01）
有时可观察到上述颗粒结构聚集在一起（图版%。偶而在一些囊泡中可观察到%%&箭头）
病毒样粒子，但无法确认囊泡是属内质网还是高尔基体膜泡。细胞质中的病毒常常分散存在于较大的膜囊结构中，其中充满了无定型基质（图版%，图版%）。有时可观察到*%*
这种膜结构开口于细胞外，因而细胞表面的病毒也多包囊在絮状无定形基质中（图版%%%）。偶尔可见吸附在细胞表面的病毒样粒子（图版%，尚不知它们是正侵入细胞*%&箭号）
还是正在出芽释放的病毒。值得注意的是：细胞外分散存在于无定型絮状基质中的某些病毒粒子的包膜不完整，似乎是受到某种水解作用的结果（图版%。%%*箭号）
!.$缩主细胞的超微病变
虽然!（，，但在电"#$感染的细胞在光镜下检测不到病理变化69789>
镜下却可以观察到某些细胞在超微结构水平上发生的一些明显病理变化。如细胞的核膜发生皱褶，以至某些细胞核呈多形性。有时可见细胞内质网池扩张（图版%），以及线%%&
粒体肿胀（图版%）等现象。此外，胞质中也常常可见大量纤维结构（图版%*，图版%*%%）。这些显然都与病毒的感染有关。*
"讨论
虽然人们对!但对其形态发生过程至今尚不清楚，"#$的超微结构进行了一些研究，
只是推测猪瘟病毒的核衣壳是在细胞中装配，并通过内质网或高尔基体以出芽的方式披上包膜，发育成为成熟的病毒。成熟病毒以何种方式向外释放也未见报导。其主要原因可能有两个方面：一是!从而加大了对其形态学研究的难度。二是需要适时"#$滴度低，
取材，即在!"#$形态发生过程高峰时固定样品。由于我们建立了!"#$@A5B细胞的感
［］&,染模式，子代病毒滴度明显提高。同时对!"#$感染的一步生长曲线及细胞中病毒抗
原的变化时相的分析，也为!"#$的超微形态学研究打下了基础。
+.-微生物学报.-卷本实验首先使用免疫荧光法对!"#$抗原在宿主细胞内的存在部位进行检测。使用抗!结果表明!"#$的多克隆抗体检测!"#$%株及!株感染的&’()细胞，"#$抗原主要存在于感染细胞质中，尤其是细胞核周围的区域。进一步使用抗!"#$包膜蛋白*+及非结构蛋白,它存在的部位在(+-的单克隆抗体进行检测。*+是!"#$的结构蛋白，
一定程度上反应出!(+-在病毒复制过程中起重"#$的成熟与在细胞内聚集的部位。,
［］((!(.要的作用，它存在的部位在一定程度上反映了病毒在胞内的复制部位。实验结果表明有丰富内膜系统的细胞核周围是!"#$在胞内增殖的主要部位。
（%株、，大小较均一，为/我们所观察到的!"#$三株病毒!株和#株）-01左右。
偶尔也可观察到直径大于/-01的病毒样颗粒。对瘟病毒属病毒粒子大小的报导一直有很大的差异。其中包括形态学研究最多的该属代表种———牛病毒性腹泻病毒（234506
［)］!(/，。早期报导2，后来倾向于2$>$）$>$的大小为+-!(--01(45789:5877;368457
［@，］［-］(A，但仍有人认为2.-!?-01($>$的大小随宿主细胞的种类不同而异+
病!"#$%株的超微结构研究尚未见报导。(A@A年龚人雄等首次报导纯化的!株，
［］毒大小为B-!/-01/。(AA/年丘惠深等从得猪瘟的病猪体内分离并加以纯化的四种
［］!"#$田间野毒的电镜观察结果也在同一范围之内A。然而这些观察基于病毒纯化并经
纯化过程可能造成病毒粒子有不同程度的损伤。负染色制样，由于!"#$病毒包膜脆弱，
相比之下，超薄切片可能更为真实地反映病毒的形态与大小。当然，应用不同的电镜制样
［］+(技术所观察到的病毒形态与大小也有所差异。
细胞质中成熟的病毒粒子多见于充满无定型基质的膜囊中。有时可观察到膜囊在质膜处的开口以及周围的无定型基质和其中的成熟病毒。提示!"#$可能是通过这一特殊结构向外释放，且多数释放的病毒依然吸附在无定型基质中。这与前人关于释放的病毒
［］+主要是吸附或结合在细胞质膜上的推测不同。
［)，］(@目前尚未观察到瘟病毒出芽成熟的过程，包括该属的代表种2。其可能的$>$(
原因是胞质中病毒核衣壳数量很少，且出芽过程较为迅速。我们曾在辛德毕斯病毒（，的?观察到大量正在出芽成熟的子代病"50:C5=457
［，］+++B毒。显然，构建与之相似的!或以某种方式阻断病毒出芽成熟的过程，"#$突变株，
将有助于对这一过程及其作用机制的深入了解。此外，释放到细胞外的某些病毒粒子，其形态结构已不完整，这也可能是对其大小报道不一且病毒滴度较低的原因之一。
光镜下!但电镜下，某些细胞却表现出明显"#$感染的细胞虽不产生明显的!&*，
的病变现象，如：内质网池扩张，线粒体肿胀，胞质小泡数量明显增加等，尤其是细胞核形态发生了改变以及胞质中出现的大量纤维结构，此外，宿主细胞的细胞核也发生形变，产生了指状突起，严重的呈多叶状。我们使用>D&E染色在荧光显微镜下也观察到了
［］(-“调亡小体”样结构。这些都反映了!!"#$感染细胞核的形变或裂解成"#$增殖对
宿主细胞不同程度的影响。研究!"#$的形态发生过程及其对宿主细胞的影响有助于深入地了解!"#$的复制过程及其致病机理。
参考文献
［(］F：，，（）60967HI#[1**********]5:86IE0#780K;5LE2#8P!"#$%6:!98==5Q5K8N53080:GJ#M
@期王镇等：猪瘟病毒的形态结构与形态发生?D=
，0，!"#$%&’()*+$",-.+*/$/.,)12$"+)",)1$4%)$+%()."%(’5"%##.))$$"%6(7"%"#,-.+*/$/9+.%$+38"3:
，，-$+’(,;$+’.%>=??@!?@@
［?］殷震，刘景华>ABC?!BBD
［@］E，：$$+/F，2*#$%(,6，61.$’GHIJ>!"!CCC!CBA
［D］E，E，：""+#(%%2IE，K(%F$%%..$M$#(FNO，&’(%)*!"#$%，=>>B"#AB@!AAP
［C］Q，O，：%R#(%%LI$.’(%M0AJ$"@@>!@DJ
［B］S，：(*M$GAA$%D=!C=
［A］龚人雄，陈太平，张晓琴，等J>"D!A
［J］李成，赫桂玉，谷守林，等J>"?D!?C
［>］丘惠深，郎洪武，王在时
大疫病免疫防制研究>A=PP!=PD
［］王镇，陆宇，周鹏程，等>>&’@=J>!=>C
［］O，：==./T$+&1$%E，5"’’$))E9>=!(%@D=!@CP
［］6，，，：=?(#*+(IN，O(++$%$+L5"’’$))E9!"#$%，=>>@!’&=!=P
［］O，，：=@(++$%$+L5"’’$))E9>C)’=A?P!=A?B
［］，，，，：=D6(*)R!E$$+/F61.$’GHI>@!’"AD!JC
［］U，：=C1#(%%;G，;’"&1;J?"!CA!AD
［］5，：=B1(/$2"$M$+LSJ=)"@?C!@@?
［］O，，：=A(+MW59N($X$+’$ESJD%$=BC!=AP
［］F，：=J+(!$))’$)"%L0JA)(?@@>!?@DB
［］张荣兴，王新华，葛锡锐=>>C!#JB!>=
［］5，，：?P1*GHIY$$Z5JD%$JDC!JCP
［］丁明孝，焦仁杰，梁风霞，等>=!#=PB!===
［］F，：??$M.TH!.)/&1T"N，V.%W(&1’$K&’(%)!"#$%，=>>P!"$?J?!?>=
［］梁风霞，丁明孝>@(??B!?@D
*+,-./0+123/451/6/789:654/92**807/;96:**89:6
!*
O(%1$%E.%F*(%\$.S.E.%.6$%I*%’.%V.%.%7.(":Y::8::E:
（3）$%%&&$%"&0,"&2,&0，6&7"22"9�"’;&""2PPJA=45548:，
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（6ELN&$’’/(+$$/)(X’./1$M
，5/)+(.%(%M0/)+(.%）",590-\$+$/)*M.$MX’)+(H)1.%/$&)."%$’$&)+"%/)+(.%8*
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（）!61$!()."%(’L+"$&)"%E("+;(/.&2$/$(+&1JC_DD_P?_PC^^
=?=微生物学报?;
卷
图版说明
!"$%&%’()&)*$%’+,##
图版-
（免疫荧光技术检测），示激光共聚焦荧光显微镜下3（8）和3./猪瘟病毒抗原在01.2细胞中的定位4567株
株（9）感染细胞中病毒抗原的定位（；以及3（3）和非结构蛋白#（>）在胞内的分布:;;
。（?;;
（，）。成熟的病毒（箭头）散在于胞质中含有无定型基质=/猪瘟病毒7株感染的@01细胞中成熟的病毒粒子%A
（!）的囊泡中。细胞的线粒体肿胀（@），胞质中出现大量纤维（5）。（箭号）（标尺B%示六角形的病毒核衣壳
（插图标尺B=2;&C）.;;&C）
图版--
（大箭头）和释放在细胞外的成熟病毒粒子（小箭头）。偶./猪瘟病毒7株感染的@01细胞中存在于胞质囊泡中
尔可见存在于细胞表面的病毒粒子（箭号）（标尺BD;;&C）
猪瘟病毒3株感染的@（箭号）中的成熟病毒粒子（标尺B=/01细胞中散在于含有无定型基质的胞质囊泡
=;;&C）
图版---
（箭号）及聚集的直径?（箭./猪瘟病毒感染的@01细胞中3E0包被的运输小泡;C&左右的病毒核衣壳样颗粒
头）（标尺B?;;&C）
（箭头），示无定型絮状基质（!）和可能部分降解的病毒粒子（箭号）（标尺B=/释放到细胞外的3456病毒粒子
D;;&C）
0$%’+-
（），./7F+$)G%$(H%’()&)*3456%&’(+&(&01.2G+$$,J+’+G’+JA(CCL&)*$L)M+,G+&G+’+GF&(L+,F)O(&+$$,(&*+G’+JIKNI3
（8）（9）（，；A4567,’M%(&%&J3,’M%(&L&J+MG)&*)G%$C(GM),G)+:;;
（3）（>）（%&J&)&P,’MLG’LM%$M)’+(&#.=2)*3456?;;
（，）（）=/7F+C%’LM+Q(M%$%M’(G$+,(&@01G+$$,(&*+G’+JA4567,’M%(&%A/6(M%$%M’(G$+,%MM)OF+%J%M+,LMM)L&J+J#K3#
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=/7F+C%’LM+Q(M%$%M’(G$+,(&@01G+$$,(&*+G’+JA4563,’M%(&/8MM)OF+%J,,F)O’F+Q(M%$%M’(G$+,,LLM)L&J+J#K3#
（（9AC)MF)L,*$)GGL$%MC%’+M(%$(&Q+,(G$+,%MM)O）%MB=;;&C）K%#
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（%（%./7F+3E0PG)%’+JQ+,(G$+,MM)O）%&J’F+&LG$+)G%,(JP$(R+#%M’(G$+,O(’F?;&C(&J(%C+’+MMM)OF+%J）(&’F+#
（9%MB?;;&C）G’)$%,C)*3456P(&*+G’+J@01G+$$,K#
（），（!）=/7F+M+$+%,+JQ(M%$%M’(G$+,%MM)OF+%J,F)O(&’F+%C)MF)L,*$)GGL$%MC%’+M(%$)L’,(J+G+$$,%&J),,(A$%M’$#I##K#K
（（9%MM)O）%MBD;;&C）J+M%J+JQ(M%$%M’(G$+,I#