医学考试之家论坛（www.yixue33.com）
2017年临床检验技师考试生化检验第五章重要考点（1）
诊断酶学
本章考点：
1.血清酶
(1)分类、生理变异与病理生理机制
(2)酶活性与酶质量测定方法及其评价
(3)同工酶及其亚型测定的临床意义
2.血清酶活性检测技术
(1)酶活性概念和表示方法
(2)酶活性测定方法分类、原理、优缺点及应用
(3)影响酶作用的因素
(4)工具酶的概念、代谢物测定中常用的指示反应
3.常用血清酶及同工酶测定的参考值及临床意义
(1)肌酸激酶及同工酶和其亚型
(2)乳酸脱氢酶及同工酶
(3)氨基转移酶及同工酶
(4)碱性磷酸酶及同工酶
(5)谷氨酰基转移酶及同工酶
(6)淀粉酶及同工酶
(7)酸性磷酸酶及同工酶
4.代谢物酶法测定
第一节 血清酶
一、血清酶的分类
根据酶的来源及其在血清中发挥催化功能的情况，可将血清酶分为两大类。
(一)血浆特异酶
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶(CHE)、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试验的一部分。
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
(有少部分酶在细胞合成后分泌到血液中行使其功能，如凝血因子及有关的纤溶因子。它们以酶原状态分泌人血，在一定的条件下被激活，引起相应的生理或病理变化。)
(二)非血浆特异酶
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
1.分泌酶：
来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶(AMY)、前列腺酸性磷酸酶(ACP)、脂肪酶(LPS)、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。
正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化作用。
在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
2.代谢酶：(细胞酶)
在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。
当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。
这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。
二、血清酶生理变异及其病理生理机制
(一)血清酶生理变异
除病理因素外，有不少生理因素可以影响血清酶测定数值，这些变化无临床病理意义。
1.性别：大多数酶无性别差异，只有少数酶如CK和GGT存在明显差异，CK和GGT都是男性高于女性，因此不能以一个参考值作为判断标准。
2.年龄：不少酶在儿童期和成人时活性不同，例如新生儿的CK和LD活性常为成人的2～3倍，以后逐渐降低，到一定年龄和成人一样。变化最明显的酶是和骨的生长发育有密切关系的碱性磷酸酶。有些酶在进入老年期也可能有变化，如ALP和GGT到老年时可能有轻度升高。
3.进食：多数酶不受进食影响，但酗酒可引起GGT明显升高。
4.运动：剧烈运动可引起血清中多种酶升高，升高程度和运动量、运动时间以及是否经常运动有关。升高的酶多为肌肉中含量丰富的酶，如CK、LD、AST等。
5.妊娠与分娩：妊娠时有许多生理变化，也可出现一些酶升高，如妊娠时ALP(因有胎盘ALP同工酶)升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。
(二)血清酶病理改变机制
疾病时，影响血清酶的因素很多，主要机制如下：
1.酶合成异常：
血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。如血清胆碱酯酶活性在有肝功能障碍时可下降。
由于酶基因变异也可引起特定酶减少或消失，如肝-豆状核综合征患者血中铜氧化酶活性可明显下降。如有骨细胞增生时，血中ALP可上升。
此外恶性肿瘤，应用某些药物，也可引起相应的血清酶变化。
2.细胞酶的释放：
是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：
(1)细胞内、外酶浓度的差异：
非血浆特异酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，只要有少量细胞受损伤，酶从细胞中释出，就可使血液中酶明显升高;
(2)酶在细胞内的定位和存在的形式：
胞质中游离的酶如ALT、LD最容易释放人血，而在亚细胞结构中的酶则较难释放出来，特别是线粒体酶，如肝细胞中的AST常需细胞出现坏死病变时才能释放人血;
(3)酶蛋白分子量的大小：
酶释放的速度大约和分子量成反比，此因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响，例如LD分子量大于CK，而当有心肌梗死时，LD在血液中升高的时间就晚于CK。
3.酶在细胞外间隙的分布和运送：
细胞中酶有三种途径进入血液：
①血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液;
②酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血;
③酶大部分进入组织间隙后再入血。
这些因素都会影响酶进入血液的时间和升高的程度。
4.血液中酶的清除：
不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期以及一些其他因素有关。
第二节 血清酶活性检测技术
一、酶活性测定的基本知识
酶测定包括酶量测定和酶活性测定。
酶在体液中含量极微，仅为ng/L水平，测定酶量十分困难。因此临床上大都采用酶活性测定，以酶活性间接表示酶量。
(一)酶活性的概念与表示法
1.概念：
酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。反应速度是指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。
2.表示方法：
酶活性的大小通常以酶单位数表示。
(1)酶的国际单位
在实验规定的条件下(温度、最适pH、最适底物浓度时)，在1分钟内催化1μmol底物发生反应所需的酶量为1个酶活力国际单位(U)。
(2)Katal(催量)：
即每秒钟转化1个摩尔底物(mol /s)的酶量。
国际单位和katal间换算关系如下：
1U=1μmol / min = 1×10-6 / 60s =16.67nkatal
(二)酶活性单位的计算
计算酶活性单位之前，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，然后进行计算： 酶单位/升=
如果采用分光光度法，并知产物或底物的摩尔吸光系数，可变换为：
ε为摩尔(线性)吸光体系(L·mol-1·cm-1)
△A为吸光度变化
v为标本体积(ml)
V为反应体系体积(ml)
L为管径(cm)
在实际测定中后面几项皆为常数，用K表示，叫做酶活力浓度测定转化因子：
常数K值设置：
在测酶时，常数K值的选择是很重要的。比值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。
K值设置的出发点应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠，所以转氨酶的常数K一般在3000左右。
(三)酶促反应进程
够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。
酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。
习题.酶单位Katal的含义是
A.每秒钟能催化1μmol底物的酶量为1Katal
B.每分钟能催化1μmol底物的酶量为1Katal
C.每秒钟能催化1个单位的底物的酶量为1Katal
D.每分钟能催化1个单位的底物的酶量为1Katal
E.每秒钟能催化1 mol底物的酶量为1Katal
『正确答案』E
二、标本采集要点
在实验室测定酶之前，标本要经过采集、分离血清和储存等一系列处理过程，而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。
1.不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如LDH高150倍，ALT高7倍。
2.及时分离血细胞：防止血细胞内酶大量进入血浆;
3.及时测定：防止酶蛋白变性;
4.尽量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用;(除非测定与凝血或纤溶有关的酶)
5.有些标本不能冷冻：有的酶在低温下不稳定。
常用酶如ALT、AST、ALP、CK、GGT、和AMY，冷冻保存在10个月活性变化不大。但有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。
采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后1～2小时实验室必须及时离心，分离血清。
一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性。
酶蛋白不稳定，易失活。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存。
三、酶的测定
(一)酶活性测定方法
1.按反应时间分类法：
20世纪50年代以前大都使用固定时间法。这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50年代中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。
(1)定时法：(两点法)
通过测定酶反应开始后某一时间段内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。
酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止(也叫中止反应法)。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。
该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。
优点：简单易行，对试剂要求不高。
缺点：难保证测定结果的真实性。
难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。
(2)连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。
因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。
实际工作中，采用工具酶的酶耦联法已经成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。
(3)平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
2.按检测方法分类法：
①分光光度法;②旋光法;③荧光法;④电化学方法;⑤化学反应法;⑥核素测定法;⑦量热法。
(二)酶质量测定法
利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、μg/L来表示酶含量的高低。
免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。如肌酸激酶同工酶MB(CKMB)质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
四、酶活力测定的影响因素(酶反应动力学)
大多数酶促反应是可逆反应，酶反应动力学中所指速度是反应的初速度。
影响酶活性的因素包括底物的浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。
(一)底物浓度的影响：
在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。其中以底物的种类和浓度最为重要。
底物浓度的影响不是简单的直线关系，米氏方程描述了底物浓度对酶促反应速度的影响。
1.
米氏方程：
随着底物浓度增加，反应速度增加当
[S] >>Km
当底物浓度足够大，反应速度不再受底物浓度影响，反应速度达到最大反应速度，是零极反应。所以检测酶活性时，要保证有足够的底物浓度。
2.Km：Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。
Km反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小，反应速度越慢。底物浓度的影响主要是两个方面即底物的种类和浓度，两者都与Km有关。
(1)如果所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，Km最小的是酶的最适底物。(生理底物)在临床测定酶活性时，应选Km最小的底物，有利于降低试剂成本和防止底物难溶。
(2)选择适宜的底物浓度
由米-曼氏方程计算得出，底物浓度范围设计在10～20Km，初速度可达最大速度的90%～95%。
举例：
已知Km，求使反应速度达到95%Vmax的底物浓度。
(以上介绍的米氏方程式只能适应用于单一底物的酶。)
习题.对于单底物酶促反应，当底物浓度 [S] 小于酶的米氏常数Km时，反应速度的变化为
A.反应速度最大
B.反应速度随底物浓度增加而加快
C.增加底物浓度反应速度不受影响
D.反应速度随底物浓度增加而减慢
E.酶促反应呈零级反应
『正确答案』B
(二)反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度：
1.pH影响
pH可以影响酶与底物的亲和力，也影响酶的稳定。测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH。多数酶的最适pH在5～8之间。 最适pH时酶反应速度最大，测定灵敏度最高;要使pH值保持稳定在测定酶活性时要使用缓冲液。
2.缓冲液
依据缓冲液对酶活性的影响可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液三大类。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，一般选择与生理环境或体液比较接近的离子强度。
理想的缓冲液应具备以下条件：
(1)有足够的缓冲容量：缓冲液的pKa与最适pH越接近，缓冲容量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反应，对缓冲容量的要求更高。
(2)纯度高，不含有抑制酶活性的杂质。
(3)温度依赖性小，受温度波动pH变化小。
(4)尽量选择活性缓冲液或惰性缓冲液。
(5)对酶有稳定作用。
(三)温度的控制：
温度对酶活性影响有双重性。
一般说来在25～35℃之间随温度升高酶促反应加快。酶的Ql0值约在1.5～2.5。 Ql0值即温度增加l0℃化学速度的变化率。
温度继续升高可使酶变性，反应速度下降。在最适温度时，反应速度最快。
不同的温度酶反应的速率不同，可直接影响测定结果。为保证最适温度要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
37℃是目前使用最广泛的测定酶催化活性的温度。目前在常规实验室中广泛使用半自动全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差。
(四)其他因素
1.辅助因子：在酶活性测定时，要保证辅基或辅酶的供给。
2.激活剂：在酶活性测定时，要满足酶对激活剂或表面活性剂的需要。如Cl-是淀粉酶的激活剂，N-乙酰半胱氨酸时是CK检测的激活剂。
3.抑制剂：使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。
使酶活性降低或丧失的物质称为抑制剂。抑制分为竞争性抑制和非竞争性抑制，在酶活性测定过程中，应尽量避免抑制剂存在。但在有的反应体系中，加入竞争性抑制剂可以提高工具酶的米氏常数。
为了减少上述诸多因素对酶催化活性浓度的影响，国际临床化学学会(IFCC)推荐采用具有量值溯源的，互换性好的标准物质用于血清酶催化活性浓度的测定的校正。目前，IFCC已经公布了包括ALT，AST，ALP，GGT，CK，LDH，Amylase在内的数个常用酶测定的参考方法，该参考方法主要应用于酶学测定参考实验室，对厂家的试剂进行溯源性考核。
综上所述，根据酶的特性及定量原理，测定酶活力时，必须注意以下几点：
(1)酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶活性成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。
(2)要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的±1℃，pH应恒定。
(3)配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。
(5)在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。
习题5.温度对酶促反应影响说法正确的是
A.能降低反应的活化能
B.温度可影响酶促反应的平衡点
C.温度升高酶促反应变慢
D.温度升高酶促反应加快
E.一般来说，在25～35℃温度每增加10℃，酶促反应速度增加1～2倍
『正确答案』E
五、工具酶及其指示反应
(一)工具酶的概念：
作为试剂用于测定酶活力或化合物浓度的酶称为工具酶。对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应，采用酶耦联法测定。 最简单的酶耦联反应：
A：底物 B：待测酶产物(不能直接测定) C：代表指示酶产物(可以直接测定)
Ex：待测酶 Ei：代表指示酶
Ex是所要测定的酶，A、B二物质分别为其底物和产物，对此二物质变化，无法直接监测，此时可加入其他酶，其底物为Ex的产物B，其反应产物C可直接监测，这样通过第二个酶反应有可能推测出第一个酶的活性浓度，外加的第二酶称为指示酶Ei。
酶耦联反应与一般酶反应的一个重要区别处是有一个明显的延滞期。酶耦联反应一开始存在着底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。显然这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。设计或选择酶测定方法时，如果用酶耦联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。
由于工具酶所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则将导致误差。
如果一些酶反应找不到合适的指示酶与其直接耦联，此时往往可以加入另一种酶，将两者连接起来：
将这种联接的酶称为辅助酶(Ea)。个别情况可能使用两种乃至两种以上的辅助酶。 指示酶和辅助酶都是工具酶。
例如要测定ALT活性
检测340nm吸光度的改变测得ALT活性。
在这里ALT为待测酶，LDH为工具酶，它的作用相当于试剂。
(二)指示反应
1.耦联的脱氢酶及其指示反应 —— NADH(NADPH)+或NAD(NADP)
NAD(P)+是由维生素PP(烟酰胺)参与构成的辅酶，是体内最常见的脱氢酶的辅酶。 常用的酶：乳酸脱氢酶(LD)、苹果酸脱氢酶(MD)、谷氨酸脱氢酶(GLD)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(C-6-PD)。
催化的反应：
P + NAD(P) H + H+
PH2 + NAD (P)+
NAD(P)H的特征性光吸收在340nm，可以通过分光光度计测定340nm光吸收的增加或减少表示酶活性。
另外可用365nm波长紫外光激发NAD(P)H，使其在460nm发射强烈荧光加以测定。
(二)耦联H202的工具酶及其指示反应
有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2,后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。
葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，(代谢物浓度测定)可使相应底物被氧化，生成H202，H202可通过下列指示反应来检测。
1.使单一的色素原显色：
色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶(POD)存在下被H202氧化后可生成有色的色素。
2.使成对的色素原显色：
必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶(POD)的催化下生成色素。如酚和4-氨基安替比林作用，生成红色色素。
习题:以NAD+还原成NADH反应为基础的生化分析，采用的波长及吸光度变化为
A.340nm从小到大
B.340nm从大到小
C.405nm从小到大
D.405nm从大到小
E.280nm从小到大
『正确答案』A
六、同工酶和亚型测定的临床意义
同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。
同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上还有许多问题需要进一步研究，但在临床应用上，对疾病的诊断和鉴别诊断都是很有帮助的，可以把同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这一族中虽然都催化相同的生化反应，但各个同工酶在理化性质上有差异，因此可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。
从根本上说，这些差异和酶蛋白结构有关，这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的变化，因此现在利用免疫原理来测定同工酶的方法有了很大发展，并用之于临床。
1.构成：一般由多亚基构成，亚基不同组合方式构成不同形式。
例如：乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5)由H亚基和M亚基构成的四聚体
2.分布特点：
(1)明显的组织器官特异性;
(2)细胞内定位不同;
(3)有些同工酶在不同发育阶段类型不同。
3.临床应用：
(1)可根据同工酶的变化来推测受损的组织或器官。
因同工酶的分布具有器官特异性、组织特异性和细胞特异性，可以较为准确地反映病变器官、组织和细胞的种类及其功能损伤的程度。
如心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1>LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5>LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰引起肝淤血的状况。
(2)可判断某些疾病的程度和预后
有一些同工酶在细胞内定位不同，线粒体中有些酶的性质和结构与胞质中同工酶有明显差异，有临床意义。用的较多的是线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。
有些同工酶在从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即所谓同工酶亚型。CK—MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。所以，同工酶和同工酶亚型的临床应用还是很有发展前途的。
医学考试之家论坛（www.yixue33.com）
2017年临床检验技师考试生化检验第五章重要考点（1）
诊断酶学
本章考点：
1.血清酶
(1)分类、生理变异与病理生理机制
(2)酶活性与酶质量测定方法及其评价
(3)同工酶及其亚型测定的临床意义
2.血清酶活性检测技术
(1)酶活性概念和表示方法
(2)酶活性测定方法分类、原理、优缺点及应用
(3)影响酶作用的因素
(4)工具酶的概念、代谢物测定中常用的指示反应
3.常用血清酶及同工酶测定的参考值及临床意义
(1)肌酸激酶及同工酶和其亚型
(2)乳酸脱氢酶及同工酶
(3)氨基转移酶及同工酶
(4)碱性磷酸酶及同工酶
(5)谷氨酰基转移酶及同工酶
(6)淀粉酶及同工酶
(7)酸性磷酸酶及同工酶
4.代谢物酶法测定
第一节 血清酶
一、血清酶的分类
根据酶的来源及其在血清中发挥催化功能的情况，可将血清酶分为两大类。
(一)血浆特异酶
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶(CHE)、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试验的一部分。
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
(有少部分酶在细胞合成后分泌到血液中行使其功能，如凝血因子及有关的纤溶因子。它们以酶原状态分泌人血，在一定的条件下被激活，引起相应的生理或病理变化。)
(二)非血浆特异酶
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
1.分泌酶：
来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶(AMY)、前列腺酸性磷酸酶(ACP)、脂肪酶(LPS)、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。
正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化作用。
在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
2.代谢酶：(细胞酶)
在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。
当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。
这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。
二、血清酶生理变异及其病理生理机制
(一)血清酶生理变异
除病理因素外，有不少生理因素可以影响血清酶测定数值，这些变化无临床病理意义。
1.性别：大多数酶无性别差异，只有少数酶如CK和GGT存在明显差异，CK和GGT都是男性高于女性，因此不能以一个参考值作为判断标准。
2.年龄：不少酶在儿童期和成人时活性不同，例如新生儿的CK和LD活性常为成人的2～3倍，以后逐渐降低，到一定年龄和成人一样。变化最明显的酶是和骨的生长发育有密切关系的碱性磷酸酶。有些酶在进入老年期也可能有变化，如ALP和GGT到老年时可能有轻度升高。
3.进食：多数酶不受进食影响，但酗酒可引起GGT明显升高。
4.运动：剧烈运动可引起血清中多种酶升高，升高程度和运动量、运动时间以及是否经常运动有关。升高的酶多为肌肉中含量丰富的酶，如CK、LD、AST等。
5.妊娠与分娩：妊娠时有许多生理变化，也可出现一些酶升高，如妊娠时ALP(因有胎盘ALP同工酶)升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。
(二)血清酶病理改变机制
疾病时，影响血清酶的因素很多，主要机制如下：
1.酶合成异常：
血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。如血清胆碱酯酶活性在有肝功能障碍时可下降。
由于酶基因变异也可引起特定酶减少或消失，如肝-豆状核综合征患者血中铜氧化酶活性可明显下降。如有骨细胞增生时，血中ALP可上升。
此外恶性肿瘤，应用某些药物，也可引起相应的血清酶变化。
2.细胞酶的释放：
是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：
(1)细胞内、外酶浓度的差异：
非血浆特异酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，只要有少量细胞受损伤，酶从细胞中释出，就可使血液中酶明显升高;
(2)酶在细胞内的定位和存在的形式：
胞质中游离的酶如ALT、LD最容易释放人血，而在亚细胞结构中的酶则较难释放出来，特别是线粒体酶，如肝细胞中的AST常需细胞出现坏死病变时才能释放人血;
(3)酶蛋白分子量的大小：
酶释放的速度大约和分子量成反比，此因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响，例如LD分子量大于CK，而当有心肌梗死时，LD在血液中升高的时间就晚于CK。
3.酶在细胞外间隙的分布和运送：
细胞中酶有三种途径进入血液：
①血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液;
②酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血;
③酶大部分进入组织间隙后再入血。
这些因素都会影响酶进入血液的时间和升高的程度。
4.血液中酶的清除：
不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期以及一些其他因素有关。
第二节 血清酶活性检测技术
一、酶活性测定的基本知识
酶测定包括酶量测定和酶活性测定。
酶在体液中含量极微，仅为ng/L水平，测定酶量十分困难。因此临床上大都采用酶活性测定，以酶活性间接表示酶量。
(一)酶活性的概念与表示法
1.概念：
酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。反应速度是指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。
2.表示方法：
酶活性的大小通常以酶单位数表示。
(1)酶的国际单位
在实验规定的条件下(温度、最适pH、最适底物浓度时)，在1分钟内催化1μmol底物发生反应所需的酶量为1个酶活力国际单位(U)。
(2)Katal(催量)：
即每秒钟转化1个摩尔底物(mol /s)的酶量。
国际单位和katal间换算关系如下：
1U=1μmol / min = 1×10-6 / 60s =16.67nkatal
(二)酶活性单位的计算
计算酶活性单位之前，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，然后进行计算： 酶单位/升=
如果采用分光光度法，并知产物或底物的摩尔吸光系数，可变换为：
ε为摩尔(线性)吸光体系(L·mol-1·cm-1)
△A为吸光度变化
v为标本体积(ml)
V为反应体系体积(ml)
L为管径(cm)
在实际测定中后面几项皆为常数，用K表示，叫做酶活力浓度测定转化因子：
常数K值设置：
在测酶时，常数K值的选择是很重要的。比值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。
K值设置的出发点应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠，所以转氨酶的常数K一般在3000左右。
(三)酶促反应进程
够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。
酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。
习题.酶单位Katal的含义是
A.每秒钟能催化1μmol底物的酶量为1Katal
B.每分钟能催化1μmol底物的酶量为1Katal
C.每秒钟能催化1个单位的底物的酶量为1Katal
D.每分钟能催化1个单位的底物的酶量为1Katal
E.每秒钟能催化1 mol底物的酶量为1Katal
『正确答案』E
二、标本采集要点
在实验室测定酶之前，标本要经过采集、分离血清和储存等一系列处理过程，而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。
1.不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如LDH高150倍，ALT高7倍。
2.及时分离血细胞：防止血细胞内酶大量进入血浆;
3.及时测定：防止酶蛋白变性;
4.尽量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用;(除非测定与凝血或纤溶有关的酶)
5.有些标本不能冷冻：有的酶在低温下不稳定。
常用酶如ALT、AST、ALP、CK、GGT、和AMY，冷冻保存在10个月活性变化不大。但有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。
采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后1～2小时实验室必须及时离心，分离血清。
一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性。
酶蛋白不稳定，易失活。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存。
三、酶的测定
(一)酶活性测定方法
1.按反应时间分类法：
20世纪50年代以前大都使用固定时间法。这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50年代中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。
(1)定时法：(两点法)
通过测定酶反应开始后某一时间段内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。
酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止(也叫中止反应法)。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。
该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。
优点：简单易行，对试剂要求不高。
缺点：难保证测定结果的真实性。
难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。
(2)连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。
因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。
实际工作中，采用工具酶的酶耦联法已经成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。
(3)平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
2.按检测方法分类法：
①分光光度法;②旋光法;③荧光法;④电化学方法;⑤化学反应法;⑥核素测定法;⑦量热法。
(二)酶质量测定法
利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、μg/L来表示酶含量的高低。
免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。如肌酸激酶同工酶MB(CKMB)质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
四、酶活力测定的影响因素(酶反应动力学)
大多数酶促反应是可逆反应，酶反应动力学中所指速度是反应的初速度。
影响酶活性的因素包括底物的浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。
(一)底物浓度的影响：
在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。其中以底物的种类和浓度最为重要。
底物浓度的影响不是简单的直线关系，米氏方程描述了底物浓度对酶促反应速度的影响。
1.
米氏方程：
随着底物浓度增加，反应速度增加当
[S] >>Km
当底物浓度足够大，反应速度不再受底物浓度影响，反应速度达到最大反应速度，是零极反应。所以检测酶活性时，要保证有足够的底物浓度。
2.Km：Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。
Km反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小，反应速度越慢。底物浓度的影响主要是两个方面即底物的种类和浓度，两者都与Km有关。
(1)如果所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，Km最小的是酶的最适底物。(生理底物)在临床测定酶活性时，应选Km最小的底物，有利于降低试剂成本和防止底物难溶。
(2)选择适宜的底物浓度
由米-曼氏方程计算得出，底物浓度范围设计在10～20Km，初速度可达最大速度的90%～95%。
举例：
已知Km，求使反应速度达到95%Vmax的底物浓度。
(以上介绍的米氏方程式只能适应用于单一底物的酶。)
习题.对于单底物酶促反应，当底物浓度 [S] 小于酶的米氏常数Km时，反应速度的变化为
A.反应速度最大
B.反应速度随底物浓度增加而加快
C.增加底物浓度反应速度不受影响
D.反应速度随底物浓度增加而减慢
E.酶促反应呈零级反应
『正确答案』B
(二)反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度：
1.pH影响
pH可以影响酶与底物的亲和力，也影响酶的稳定。测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH。多数酶的最适pH在5～8之间。 最适pH时酶反应速度最大，测定灵敏度最高;要使pH值保持稳定在测定酶活性时要使用缓冲液。
2.缓冲液
依据缓冲液对酶活性的影响可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液三大类。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，一般选择与生理环境或体液比较接近的离子强度。
理想的缓冲液应具备以下条件：
(1)有足够的缓冲容量：缓冲液的pKa与最适pH越接近，缓冲容量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反应，对缓冲容量的要求更高。
(2)纯度高，不含有抑制酶活性的杂质。
(3)温度依赖性小，受温度波动pH变化小。
(4)尽量选择活性缓冲液或惰性缓冲液。
(5)对酶有稳定作用。
(三)温度的控制：
温度对酶活性影响有双重性。
一般说来在25～35℃之间随温度升高酶促反应加快。酶的Ql0值约在1.5～2.5。 Ql0值即温度增加l0℃化学速度的变化率。
温度继续升高可使酶变性，反应速度下降。在最适温度时，反应速度最快。
不同的温度酶反应的速率不同，可直接影响测定结果。为保证最适温度要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
37℃是目前使用最广泛的测定酶催化活性的温度。目前在常规实验室中广泛使用半自动全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差。
(四)其他因素
1.辅助因子：在酶活性测定时，要保证辅基或辅酶的供给。
2.激活剂：在酶活性测定时，要满足酶对激活剂或表面活性剂的需要。如Cl-是淀粉酶的激活剂，N-乙酰半胱氨酸时是CK检测的激活剂。
3.抑制剂：使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。
使酶活性降低或丧失的物质称为抑制剂。抑制分为竞争性抑制和非竞争性抑制，在酶活性测定过程中，应尽量避免抑制剂存在。但在有的反应体系中，加入竞争性抑制剂可以提高工具酶的米氏常数。
为了减少上述诸多因素对酶催化活性浓度的影响，国际临床化学学会(IFCC)推荐采用具有量值溯源的，互换性好的标准物质用于血清酶催化活性浓度的测定的校正。目前，IFCC已经公布了包括ALT，AST，ALP，GGT，CK，LDH，Amylase在内的数个常用酶测定的参考方法，该参考方法主要应用于酶学测定参考实验室，对厂家的试剂进行溯源性考核。
综上所述，根据酶的特性及定量原理，测定酶活力时，必须注意以下几点：
(1)酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶活性成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。
(2)要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的±1℃，pH应恒定。
(3)配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。
(5)在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。
习题5.温度对酶促反应影响说法正确的是
A.能降低反应的活化能
B.温度可影响酶促反应的平衡点
C.温度升高酶促反应变慢
D.温度升高酶促反应加快
E.一般来说，在25～35℃温度每增加10℃，酶促反应速度增加1～2倍
『正确答案』E
五、工具酶及其指示反应
(一)工具酶的概念：
作为试剂用于测定酶活力或化合物浓度的酶称为工具酶。对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应，采用酶耦联法测定。 最简单的酶耦联反应：
A：底物 B：待测酶产物(不能直接测定) C：代表指示酶产物(可以直接测定)
Ex：待测酶 Ei：代表指示酶
Ex是所要测定的酶，A、B二物质分别为其底物和产物，对此二物质变化，无法直接监测，此时可加入其他酶，其底物为Ex的产物B，其反应产物C可直接监测，这样通过第二个酶反应有可能推测出第一个酶的活性浓度，外加的第二酶称为指示酶Ei。
酶耦联反应与一般酶反应的一个重要区别处是有一个明显的延滞期。酶耦联反应一开始存在着底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。显然这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。设计或选择酶测定方法时，如果用酶耦联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。
由于工具酶所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则将导致误差。
如果一些酶反应找不到合适的指示酶与其直接耦联，此时往往可以加入另一种酶，将两者连接起来：
将这种联接的酶称为辅助酶(Ea)。个别情况可能使用两种乃至两种以上的辅助酶。 指示酶和辅助酶都是工具酶。
例如要测定ALT活性
检测340nm吸光度的改变测得ALT活性。
在这里ALT为待测酶，LDH为工具酶，它的作用相当于试剂。
(二)指示反应
1.耦联的脱氢酶及其指示反应 —— NADH(NADPH)+或NAD(NADP)
NAD(P)+是由维生素PP(烟酰胺)参与构成的辅酶，是体内最常见的脱氢酶的辅酶。 常用的酶：乳酸脱氢酶(LD)、苹果酸脱氢酶(MD)、谷氨酸脱氢酶(GLD)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(C-6-PD)。
催化的反应：
P + NAD(P) H + H+
PH2 + NAD (P)+
NAD(P)H的特征性光吸收在340nm，可以通过分光光度计测定340nm光吸收的增加或减少表示酶活性。
另外可用365nm波长紫外光激发NAD(P)H，使其在460nm发射强烈荧光加以测定。
(二)耦联H202的工具酶及其指示反应
有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2,后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。
葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，(代谢物浓度测定)可使相应底物被氧化，生成H202，H202可通过下列指示反应来检测。
1.使单一的色素原显色：
色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶(POD)存在下被H202氧化后可生成有色的色素。
2.使成对的色素原显色：
必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶(POD)的催化下生成色素。如酚和4-氨基安替比林作用，生成红色色素。
习题:以NAD+还原成NADH反应为基础的生化分析，采用的波长及吸光度变化为
A.340nm从小到大
B.340nm从大到小
C.405nm从小到大
D.405nm从大到小
E.280nm从小到大
『正确答案』A
六、同工酶和亚型测定的临床意义
同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。
同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上还有许多问题需要进一步研究，但在临床应用上，对疾病的诊断和鉴别诊断都是很有帮助的，可以把同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这一族中虽然都催化相同的生化反应，但各个同工酶在理化性质上有差异，因此可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。
从根本上说，这些差异和酶蛋白结构有关，这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的变化，因此现在利用免疫原理来测定同工酶的方法有了很大发展，并用之于临床。
1.构成：一般由多亚基构成，亚基不同组合方式构成不同形式。
例如：乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5)由H亚基和M亚基构成的四聚体
2.分布特点：
(1)明显的组织器官特异性;
(2)细胞内定位不同;
(3)有些同工酶在不同发育阶段类型不同。
3.临床应用：
(1)可根据同工酶的变化来推测受损的组织或器官。
因同工酶的分布具有器官特异性、组织特异性和细胞特异性，可以较为准确地反映病变器官、组织和细胞的种类及其功能损伤的程度。
如心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1>LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5>LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰引起肝淤血的状况。
(2)可判断某些疾病的程度和预后
有一些同工酶在细胞内定位不同，线粒体中有些酶的性质和结构与胞质中同工酶有明显差异，有临床意义。用的较多的是线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。
有些同工酶在从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即所谓同工酶亚型。CK—MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。所以，同工酶和同工酶亚型的临床应用还是很有发展前途的。