抗菌肽的研究进展与展望

2009, 43(10):11~19/韩文瑜, 等中国兽药杂志

抗菌肽的研究现状与展望

韩文瑜, 孙长江

(吉林大学畜牧兽医学院, 长春 130062)

[收稿日期]2009-09-18 [文献标识码]A [文章编号]1002-1280(2009) 10-0011-09 [中图分类号]S859. 4

[摘要] 耐药性细菌的出现致使现有抗菌药物对细菌感染治疗的疗效低下或无效, 形成的危害日益严重, 迫切需要开发出新型的抗菌制剂。高效、低毒、广谱的抗菌肽作为最有希望代替抗生素的新药制剂倍受国内外科研工作者的关注, 成为当前的研究热点。本文综述了抗菌肽的生物学特性, 生物学活性及其作用机制, 抗菌肽的筛选策略, 分析了影响抗菌肽应用中存在的问题, 并对其应用前景进行了展望。

[关键词] 抗菌肽; 研究进展; 应用前景

R esearch Progress on Anti m icrobial Pepti des and Its D evelop m ent Prospect

HAN W en-yu , SUN Chang-jiang

(Colle g e of An i ma lS cience and Ve t erina ryM ed i c i ne , J ili n Un i v e rsit y, Changchun 130062; China )

Abst ract :The e m ergence of an ti b i o tic-resistant bacteria m ake the bad or i n vali d therapeuti c effect of the curre -ntl y used anti b iotics used to co m bat bacterial i n fecti o ns , w hich severely har m the hu m an and ani m al hea lth , and every e ffort to develop nove l anti b acterial agents are i n great needed . Anti m icrob ial peptides have e m erged as effective broad-spectr um t h erapeutic agents w ith a pro m ising substitute for anti b iotic , and anti m i c rob ial peptides have been a pri m ary focus o f ne w drug research wo rl d w i d e . This paper deals w ith an overv i e w o f t h e types , bioactiv ities , antibacterialm echan is m s , se lection m et h ods . The prob le m s i n app lications of the anti b acteria l pept-i des and prospects for future researches are also m entioned . K ey w ords :anti m icrobia l pepti d es ; research pr ogress ; applicati o n prospect 当前, 细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势, 细菌耐药性的形成是一个重要的原因。由耐药性细菌, 如耐药性结核杆菌、大肠杆菌和被称为/超级细菌0耐甲氧西林金葡菌(MRSA) 等对人和动物造成的危害日趋严重。如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点。科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略, 这些策略包括:合理应用抗生素; 改造现有抗生素或研发新的抗生素; 微生态制剂的研究与应用; 噬菌体制剂研究与应用; 中草药细菌耐药抑制剂研究与应用; 抗菌肽研究与应用等。其中

抗菌肽研究与应用是最有前景的一个领域。1 抗菌肽的主要生物学特性

1. 1 抗菌肽的概念与来源分类抗菌肽(Anti b ac -terial pep ti d e) 又叫抗微生物肽(Anti m icrobia l pep -tide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide), 是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。1974年, 瑞典科学家G. Bo m an 等人向眉纹天蚕蛾(Sam ia Cynthia ) 蛹注入大肠杆菌后, 在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的

作者简介:韩文瑜(1955年-) , 男, 博士, 教授, 主要从事分子细菌学与分子免疫学研究。E -m a i:l hanwy @jl u . edu . cn

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碱性多肽类物质, 随后诱导惜古比天蚕(Hyalo phra

[1-2]

C ecro p ia ) 蛹也发现了类似的抗菌活性物质。1981年, 将这种具有抗菌活性的物质被命名为

[3]

cecrop i n , 这是人们第一次真正意义上发现抗菌肽。随后, 又在多种生物体内陆续发现了多种抗菌肽, 抗菌肽广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物中, 是天然免疫防御系统的一个重要组成部分, 被称为/第二防御体系0。迄今为止, 国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出来, 以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。1. 1. 1 昆虫抗菌肽昆虫是种群最大的生物种类, 抗菌肽的数量难以估量。现在, 仅在鳞翅目、双翅目、鞘翅目和蜻蜓目等8个目的昆虫中发现超过200多种昆虫抗菌肽类物质, 仅从家蚕这一种昆虫获得了40个抗菌肽基因, 已报道的天蚕素约有30余种。1. 1. 2 哺乳动物抗菌肽 1989年, Lee 等首次从猪小肠中分离到哺乳动物抗菌肽Cecr opin P1。目前, 从猪中分离出至少18种, 绵羊中至少30种, 牛中至少30种抗菌肽。人类机体中发现的防御素属于抗菌肽中的一个大家族, 根据其氨基酸的空间结构和分泌部位的差别又分为三大类:人A -防御素(hum and A -defensi n ) 、人B -防御素(hu m an B -defensi n , H B D ) 、人H -防御素(hu m an H -[5]

defensi n ) , 现已发现人防御素达35种以上, 其中非常重要的防御素有10种。1. 1. 3 两栖动物抗菌肽两栖类动物裸露的具多种功能, 在皮肤的分泌物中存在的大量皮肤活性肽具有多样的生物学活性, 其中大多数多肽类物质均具有一定的抗微生物活性, 在进化上是一类非常古老而有效的天然防御物质, 往往归为抗菌肽。在非洲爪蟾中就有十多种抗菌肽, 不仅在皮肤颗粒腺表达, 也有存在于胃粘膜和小肠道细胞

[8]

[6-7]

[4]

一种含有35个氨基酸残基抗菌肽Par dax i n 是最早从鱼类分离得到的两亲性阳离子A 螺旋结构具有穿膜作用的多肽, 该肽是离子型神经毒素, 由该肽衍生出了一系列具有比蜂毒素抗菌活性更强, 溶血

[9-10]

活性更低的抗菌活性肽。1998年, Park 等报道了鲶(Parasilurus asotus ) 受伤时上皮粘膜细胞层分泌一种19个氨基酸残基的组蛋白H 2A 抗菌肽parasi n Ñ, 具有广谱强抗菌活性, 其抗菌活性是蛙

[11]

皮素m agai n i n 2的12~100倍。目前, 从鱼类分离得到49种以上抗菌肽。

防御素是贻贝等海洋软体动物的重要抗微生物肽, 迄今发现的贻贝防御素根据其初级结构、性质和共有的半胱氨酸序列分为Defensi n 、m ytilin 和

[12]

m ytic i n 3种。虾经细菌感染后可诱导多种基因表达, 其中含有多种抗菌肽基因

[13]

。自1997年

Destou m i e ux 等首次报道甲壳动物抗菌肽氨基酸全

[14]

序列以来, 从甲壳类动物如对虾血细胞中分离出多种抗菌肽。1. 1. 5 植物抗菌肽植物中也存在一些结构上与昆虫、哺乳动物防御素结构相似的植物抗菌肽, 称为植物防御素。大多数植物抗菌肽对植物病原具有良好活性, 部分植物抗菌肽对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性。Th-i oni n s 是最早从植物中分离的抗菌肽, 新近的研究表明小麦抗菌肽具有很好的杀利什曼原虫活性。1. 1. 6 细菌抗菌肽细菌抗菌肽又称细菌素(bacteri o c i n ), 包括阳离子肽和中性肽, 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可分泌。细菌中已发现的抗菌肽有杆菌肽(Bacitrac i n ) 、短杆菌肽S (G ra m ici d i n S) 、多粘菌素E(Po l y m yx i n E ) 和乳链菌肽(N isi n ) 4种类型。目前, APD 数据库中就收录的细菌素有119种, 其中乳酸链球菌肽n isin 是由乳球菌产生的含3~4个氨基酸残基的短肽, 它是一种耐酸性物质, 即使在胃这样低p H 环境中稳定性也很高, 能抑制革兰氏阳性菌如梭状芽孢杆菌和李氏杆菌。B acillus s pp. 产生的杆菌肽m ersacidi n 对/超级耐药菌0) ) ) 耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA) 具有良好的抑制作用, 通过腹腔给药可以清除MRSA 感染小鼠血液、肺、肝、肾、脾等脏器中的细菌, 并且对小鼠各器官没有造成明显的损害

[16]

[15]

。在非

洲爪蟾皮肤中发现的小分子抗菌肽) ) ) 爪蟾素

(magaini n s) 是较早发现的两栖动物抗菌肽, 具有很高的抗菌活性, 此后相继发现了多种蛙类抗菌肽。据不完全统计, 目前已经从无尾两栖动物8个属约40多种两栖类动物的皮肤中提取出了数百种抗菌肽, APD 数据库中就收录了其中的548种。大量研究发现蛙类抗菌肽具有协同效应, 但不同的蛙类抗菌肽很少具有同源性。

1. 1. 4 鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽 , m s ) 。

1. 2 抗菌肽的理化特性与结构分类抗菌肽一般10~

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成, 分子量小, 热稳定性好, 免疫原性低; (2) 富含疏水和碱性氨基酸残基, 所以大多数抗菌肽都带正电荷且具有两亲性; (3) 抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的pH 值下仍可保持较强的活性; (4) 部分抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。

不同来源、不同结构的抗菌肽的一级结构具有较强的保守性, 且N 端富含极性氨基酸, 绝大多数抗菌肽的第二位氨基酸残基是T r p , C 端通常酰胺化, 分子中间富含Pro , 这些特征对抗菌肽广谱的杀菌活性的高低起着至关重要的作用, 甚至直接影响抗菌肽的杀菌活性。

根据其化学组成, 高级结构以及其功能进行分类可将抗菌肽分为5类:(1) A -螺旋结构类, 如天蚕素(Cecrop i n s), 蛙皮素(Maga i n i n s) 等; (2) B -折叠型, 该类抗菌肽是在分子内有2个或2个以上二硫键, 动物防御素多数属此类结构, 如绿蝇防御素分子内有6个半胱氨酸形成3个分子内二硫键, 肽链C 末段是带有拟B 转角的反向平行的B 片层; (3) 伸展性螺旋结构类, 该类抗菌肽不含半胱氨酸, 但富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸残基, 如从蜜蜂体内分离到的ap i d aecins 中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33%和17%, 通常由15~34个氨基酸残基组成在两亲性分子内部形成分子内A -螺旋; (4) 环链结构类, 该类抗菌肽在C 末端有一个分子内二硫键, 在C 末端形成一个环链结构, 而N 末端为线状结构, 如青蛙皮肤细胞产生的brevinins 和bacte -necin 均属于此类; (5) 由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。2 抗菌肽的生物活性及作用机制

2. 1 抗菌肽的抗细菌作用在APD 数据库中有1158个抗细菌肽, 至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。抗菌肽的抗菌作用机理的研究比较多。一是基于膜攻击作用的杀菌机制有以

[17-18]

下几个模型:(1) 桶板模型(barre l-stave m ode l):带正电荷的含A -螺旋抗菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面, 多个抗菌肽分子形成多聚体, 扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序, 并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层, 形成横跨细胞膜的离子通道, 造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失, 细胞膜崩解而导致细胞死亡; (2) 地毯模型([1]

细胞膜内部, 但在电荷作用下, 一定浓度的抗菌肽像地毯样展开平行排列在细胞膜表面或形成颗物, 利用疏水作用和分子张力作用改变细胞膜的表面张力, 从而在细胞膜上出现暂时的孔洞, 除了细胞液的相互渗透, 抗菌肽还可通过此孔洞进入细胞; (3) 穿孔螺旋模型(toroida l-ho le m odel):抗菌肽分子的极性端与磷脂分子的极性端相对一起形成以螺旋状形式的连续翻转, 从而导致膜的完整性破坏和功能丧失; (4) 分子团聚集式(m ice llar aggregate) 是抗菌肽分子以不规则形式聚集于膜表面, 类似地毯式模型的作用形成跨膜电势差而导致膜损伤。二是基于抗菌肽的非膜结构破坏型机制, 包括抗菌肽穿过细胞膜或核膜, 作用于胞内DNA 、RNA, 酶和蛋白质等分子, 可抑制细胞外膜蛋白质, 细胞壁的合成, 抑制细胞的呼吸作用。如Carlsson 等研究发现, attac i n 能够抑制大肠杆菌细胞外膜蛋白相关基因的转录, 导致细胞的通透性增加, 从而抑制细菌生长

[19]

。Feh l b aum 等用40L M 的昆虫抗菌肽

thanati n 处理大肠杆菌1h 后细胞呼吸作用明显变

弱, 处理6h 时后呼吸作用则完全停止, 从而推断thanati n 可能是通过抑制细胞的呼吸作用杀灭细菌。

2. 2 抗菌肽的抗病毒作用目前在APD 数据库中有97个抗病毒肽, 研究证明抗菌肽可以3种不同的机制起到抗病毒的作用:(1) 可直接与病毒颗粒相互作用, 如A -防御素等直接与对疱疹病毒粒子相结合而起作用; (2) 干扰病毒的侵染过程, 蜂毒素及其类似物K7I 的结构与烟草花叶病毒衣壳蛋白的部分氨基酸序列存在相似性, 以伪装成病毒包被蛋白, 干扰病毒的正常组装; (3) 抑制病毒的复制, 蜂毒素和杀菌肽A 可抑制H I V 的复制。2. 3 抗菌肽对真菌的作用目前在APD 数据库中有97个抗真菌肽。来源于哺乳动物的防御素对一些人类致病真菌具有杀伤作用; 截取天蚕素A 和蜂毒素分子的片段, 合成杂合肽分子处理真菌孢子原生质体, 发现不但真菌细胞壁无法恢复, 而且细胞也被破坏, 无法保持正常的细胞形态。抗菌肽抗真菌的作用机理包括:(1) 阻止、破坏真菌细胞壁的合成, 如棘球白素(ech i n ocandins) 是1, 3-B -葡聚糖合成酶的抑制物, 通过非竞争性抑制葡聚糖的合成而抑制真菌细胞生长; (2) 与真菌细胞内线粒体、核酸等大分子细胞器相互作用导致真菌死亡; ,

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外泄。2. 4 抗菌肽的抗原虫作用部分抗菌肽可以有效地杀灭寄生于人类和动物的寄生虫。杀菌肽的类

[20]

似物Sh i v a I 在体外可以杀死恶性疟原虫; 杀菌肽/蜂毒素的杂合肽可以杀伤利什曼鞭毛虫。抗菌肽杀灭寄生虫时主要作用于寄生虫细胞质膜, 损坏质膜形态, 迅速降低W /OH的通透性, 破坏膜电势。2. 5 抗菌肽的抑制肿瘤细胞作用目前在APD 数据库中还有95个抗肿瘤肽。肿瘤细胞对抗菌肽的敏感度比正常细胞要高, 这可能与肿瘤细胞外膜含有较高的酸性磷脂成分有关, 而肿瘤细胞的细胞骨架系统不完善, 也可能是易受抗菌肽作用的原因。抗菌肽对癌细胞的作用主要是可以插入质膜, 使双分子层发生融解、完整性被破坏, 细胞膜上形成的孔洞使内容物外泄, 线粒体出现空泡化, 嵴脱落, 核膜破损, 界限模糊不清, 核染色体DNA 断裂, 并抑制染色体DNA 的合成。

抗菌肽的抗肿瘤作用的另外一个可能机制是诱导细胞凋亡。M a i 等研究发现, 将抗菌肽DP1局部注射到小鼠的肿瘤内, DP1可以迅速诱导肿瘤细胞凋亡, 因此诱导细胞凋亡可能是抗菌肽作用机制中的一种。抗菌肽在体内还可以调节机体的免疫机能, 增强机体的免疫力发挥抗肿瘤作用。2. 6 抗菌肽具有促进创伤愈合、促进血管生成功能 LL-37在体内和体外均可以促进创伤愈合。LL-37可以调节转录因子, 活化基质蛋白酶, 促有丝分裂蛋白酶, 激活磷酸激酶信号转导途径, 最终反式激活内皮生长因子的表达, 促进表皮细胞再生或形成肉芽组织愈合伤口。在体内LL-37以剂量依赖性的方式诱导血管内皮生长因子(VEGF),角质形成细胞生长因子(KGF) 等多种细胞生长因子表达, 刺激肠上皮细胞生长, 保证肠上

[24]

皮组织屏障的完整性。本研究室从牛蛙皮肤中分离得到2种具有抗菌活性的多肽, 同时检测到其具有对细菌感染创面促进创伤愈合的作用。2. 7 抗菌肽的中和、阻断内毒素的作用来自人的抗菌肽hC AP18具有通过结合并中和、阻断内毒素的作用, 10m g 和100m g hCAP18均能够显著抑制由LPS 诱导增加的炎性细胞数, 降低NO, TNF-[25-26]

A , PGE 2, MCP-1和M I P-2水平。2. 8 抗菌肽的白细胞趋化与免疫激活作用感染或损伤处所分泌的cathe licidi n s 和defensi n s 对效应[23]

[21-22]

肥大细胞的组胺释放, 这些反应一起则能促进先天的及获得性免疫细胞的补充。LL-37是只存在于人肠道的属于cat h e lic i d i n 家族的抗菌肽, 具有直接的杀菌活性。LL -37作用宿主To ll 样受体, 加强TLR4mRNA 的转录和增加TLR4, 引发宿主主细胞(m ast cell) 释放I L-4, I L -5, I L-1B , 激活宿主的

[27]

先天性免疫。

2. 9 抗菌肽的炎性及免疫抑制作用 LL -37通过多种作用协同炎症因子I L-1B 等细胞因子的释[27-28]放。哺乳动物抗菌肽除了具有促炎性反应外, 也能阻止有害的炎症应答。C athe li c i d i n 家族的抗菌肽能够抑制致炎细胞因子如TNF -A , I FN -r 和I L-6的相关基因转录、促炎症反应物质的释放及避免细菌感染后啮齿类的脓毒症, 还能防止引起阻止损伤和炎症的毒性组分的产生

[29-31]

, 研究表

明cathe lici d i n 家族抗菌肽还可通过调节TLR4来调

[32]

节炎症反应。

2. 10 免疫调节作用抗菌肽可以通过对靶细胞的凋亡、基因转录调节、调节巨噬细胞、树突状细胞和其它抗原递呈细胞趋化性的调节作用, 调节宿主细胞因子的产生和B 细胞和T 细胞的抗原特异性

[17, 33]

免疫应答而作用于先天及获得性免疫。3 抗菌肽筛选策略3. 1 基于分离技术的筛选策略以各种蛋白质分离纯化技术从组织中直接分离纯化是将宿主经诱导后取特定组织制成组织匀浆, 经超速离心、Sepha -dex-G50层析、反相高效液相色谱或电泳分离等各种蛋白质分离纯化技术可以得到不同样品, 用MALDI-TOF 质谱对样品进行分析和活性测定。从组织中直接分离纯化不足之处在于天然含量极微, 提取步骤烦琐、得率低。3. 2 利用差异显示技术筛选抗菌肽编码基因利用差异显示技术对进行诱导和未进行诱导基因的差异表达进行研究, 可得到一些新的抗菌肽类相关基因, 这是关于基因分离、表达研究的较新的方法。K i m 等就利用差异显示技术分离到了一种新抗菌肽Enbocin 。3. 3 基于同源序列筛选抗菌肽编码基因以细菌诱导动物体产生抗菌肽或直接取特定组织提取mRNA, 构建c DNA 文库, 根据已知抗菌肽的DNA 序列设计保守的PCR 引物或制备寡核苷酸探针, 可以在文库中筛选具有序列同源性的编码基因, 这[34]

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现对库进行测序筛选, 用该法可以得到分离纯化方

[35]

法得不到的抗菌活性的多肽。本研究室以上述方法从牛蛙皮肤中获得了牛蛙皮肤组织抗菌肽粗提物对枯草杆菌、李氏杆菌、绿脓杆菌、李斯特菌、金葡菌有较好的抑菌活性, 并结合c DNA 文库筛选策略获得多个具有抗菌活性的多肽。3. 4 用生物信息学方法设计和鉴别抗菌肽生物信息学研究已经在拟南芥、人、鼠、鸡等多种模式生物中成功地筛选到了新的抗菌肽或B -防御素基因。生物信息学方法可以用来设计具有特定功能的氨基酸序列, 也可以进行抗菌肽的设计。抗菌肽数据库APD (h ttp ://aps. unm c . edu /AP/main . php) 的建立为用生物信息学研究抗菌肽提供了支持, 目前在该数据库中有约2000余种抗菌肽, 该数据库具有根据抗菌肽家族(如细菌素、防御素等), 多肽来源(如鱼类、蛙类), 翻译后修饰(如酰胺化, 氧化, 糖基化等), 多肽靶向位点(如膜靶向, 蛋白靶向, 脂多糖靶向等) 检索功能, 不同来源抗菌肽的氨基酸残基特性分析和数据库辅助的多肽设计。W ang 等通过该数据库设计出了抗大肠杆菌活性高

[36]

于人源抗菌肽LL-37的抗菌肽GLK-19。3. 5 其他高通量筛选鉴别抗菌肽的策略 Lo it 等将表达文库菌涂在膜支持物上, 诱导后挑出阳性克隆测抑菌活性可以快速从表达文库中高通量地筛

[37]

选抗菌肽。筛选合成肽库或噬菌体展示肽库也是较好的抗菌肽高通量筛选的策略, 通过此策略可能得到一系列序列相关的具有抗菌活性的化合物,

[38-39]

并可以研究结构与生物活性的关系。Rath-i nakum ar 等以穿透人工合成的脂膜为指标, 从16384个短肽库中筛得10个多肽, 虽然它们在基序、长度和电荷等特性方面存在较大差异, 但具有同穿透性抗菌肽一样的活性, 以该方法筛得到了抗菌活性不依赖于特定基序和三级结构的膜结活性(interfac ial activity) 的抗菌多肽, Cherkasov 等利用人工智能网络技术也引入到了抗菌肽的筛选, 并筛得到了比常规方法筛到的抗菌肽抗超级耐药菌活性更高的多肽化合物。3. 6 抗菌肽的分子设计伴随每一种新抗菌肽的发现, 都会进行氨基酸序列的修饰, 目的是寻找对抗菌活性影响的关键部位, 并进一步进行分子设计, 以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。对天然抗菌肽进行序列修饰包括以下内容, 即增加、删除、, [41]

[2, 40]

序列, 连接不同自然来源的抗菌肽片段成为杂合肽等。蛙皮肤抗菌肽ascaph i n -8和XT-7具有广谱的抗菌活性, 但因对哺乳动物细胞有毒性作用而不能用于临床, 通过将ascaph i n -8的A la (10), V al (14) 和Leu(18) 残基替换为L -Lys 或D -Lys , 将XT-7的G ly (4) 替换为L-Lys , 增加了抗菌肽分子两亲性, 减少了螺旋数和疏水性, 保持了原有抗菌活性并且降低了毒性。A h m ad 等以研究了牛抗菌肽B MAP-28的N -和C -末端锌指结构与功能的基础上, 用丙氨酸残基替换亮氨酸或异亮氨酸残基, 设计出了具有细胞选择性的七价重复序列的

[43]

B MAP-28类似物, 具有更低的毒性作用, 而Jenssen 等利用可以计算相邻氨酸残基间能量的两个数学模型可以准确地预测出测试多肽或生物活性

[44-45]

[42]

。

4 抗菌肽的应用前景4. 1 抗菌肽作为新型抗生药物, 在疾病治疗与预防中具有广阔的应用前景抗菌肽是一种很有潜力的新抗菌药物来源, 是一个方兴未艾的领域, 随着研究的不断深入, 会有一大批新型抗菌肽被发现, 可望成为新型的抗菌和抗肿瘤药物在临床上应用, 具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在克服细菌耐药性方面具明显优势。目前已有十余种抗菌肽进行临床前或临床研究, 随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化, 设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作为抗生素替代品是完全可行的。

4. 2 抗菌肽可能成为一种新型的药物载体两亲性抗菌肽的膜穿透性是其作为药物运输载体的基础, Laszlo O tvos 等将分子量小且富含精氨酸残基的昆虫抗菌肽py rrochoric i n 和其衍生物作为施药运载工具, 可将抗原性较弱的9个残基的MH C-1的抗原表位递送到小鼠体内, 产生很强的细胞毒性T 细胞反应, 证实pyrrochoric i n 同系物具有运载抗原依

[46]

赖性疫苗的潜力。M aga i n i n 与溶于50%乙醇的表面活性剂增强剂N -月桂酰肌氨酸一起可以破坏皮肤角质层中的脂质结构, 从而增加了药物的皮肤透过性, 该结果显示出抗菌肽作为透皮给药载体

[47-49]

具有很好的发展前景, 进一步探讨抗菌肽作为穿膜肽的应用具有广阔的前景。

4. 3 抗菌肽类食品防腐剂天然防腐剂的研究和

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类防腐剂所具有的安全无毒害, 甚至对人体有一定营养保健作用等优点, 其研究开发无疑是一个很有前途的重要课题。乳酸链球菌素(N i s in) 能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长, 尤其是可形成芽孢的细菌, N i s in 能阻止梭菌的生长与毒素形成, 抗菌效果更强。N isi n 的应用与其它防腐剂相比, 具有用量少、使用方便、防腐效果好、价格低廉的特点, 使用它还可降低杀菌温度, 减少热处理时间, 因此能改进食品营养价值、风味、结构、颜色等性状。4. 4 抗菌肽作为畜禽饲料添加剂在畜牧业的应用抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡, 并易在动物体内残留, 严重影响产品的品质和人类的健康。用基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂或者通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达而达到畜产品无抗生素化值得进一步研究。本研究室以中国鲎抗菌肽tachyplesins I 、po l y phe m usins 、乳酸菌素Gasseric i n T 、中国林蛙皮肤抗菌肽RC 基因酵母工程菌发酵产物制备的抗菌肽制剂肽百康在鸡每吨饲粮中的添加量达500g 时, 不但能有效地抑制饲料中细菌的繁殖, 显著增加鸡的平均日增重, 提高雏鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数作用最为明显。4. 5 抗菌肽在畜禽疾病治疗与预防中的应用柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡白痢效果明显。陈晓生等报道, 饲料中添加抗菌肽对肉鸭有促进生长的作用, 应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料, 饲喂试验结果表明可减轻断奶仔猪腹泻。W ang 等研究表明饲喂猪肠抗菌肽SGAM P 能增强SPF 鸡的粘膜免疫。本研究室研制的抗菌肽制剂肽百康作为猪饲料添加剂可提高仔猪的日增重同时具用预防腹泻的作用, 尤以每吨基础日粮中添加320g 肽百康效果最好, 应用于断奶应激期间的仔猪抗腹泻取得了与抗生素预防相同的作用效果。4. 6 抗菌肽作为饲料添加剂在水产养殖的应用

水产养殖中在饵料中大量使用抗生素作为添加剂, 不仅破坏水产养殖动物体内的正常菌群, 而且抗生素易在动物体内残留。基因工程抗菌肽替代传统抗生素或作为环保型饵料添加剂, 既可以增强水产养殖生物的抗病能力, 又可以提高养殖水产品的质量。

4. 7 转抗菌肽基因动物气管黏膜抗菌肽在小鼠, [50]

以及白色念珠菌均具有抗菌活性。近年来, 将对病

原生物有抑制作用的抗菌肽基因导入传播介体(蚊) 中, 使其在昆虫体内高效稳定的表达, 从而切断病原物的传播途径。

4. 8 转抗菌肽基因植物培育抗病新品种是防治植物病害的根本途径。业已完成培育成功的抗病转抗菌肽基因植物有抗梨火疫病转基因苹果树, 抗烟草野火病、烟草花叶病毒病的转基因烟草, 抗水稻白叶枯病转基因水稻, 抗青枯病转基因烟草[51]

等, 将抗菌肽基因转入农作物是培育作物抗病新品种的有效策略。

5 抗菌肽研究存在的问题

目前, 研发绿色、新型、高效、低毒、广谱的抗菌制剂已成为全球的热潮。新型抗菌肽不断被发现, 天然抗菌肽的人工修饰最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。

虽然抗菌肽的研究时间不长, 大量研究结果预示, 抗菌肽的应用将带来生物医药领域的一场/绿色革命0, 但m agai n i n , i n do licidin , pr o teg ri n 等体外抗菌活性较好的抗菌肽已进入临床超过10年, 还存在抗菌活性较弱, 非特异性毒性作用和对蛋白酶

[52]

敏感等问题而限制其应用。真正将抗菌肽推向市场, 应用于临床可能还要面临很多挑战, 还必须继续深入研究以下几个问题。

5. 1 抗菌肽的来源问题首先, 抗菌肽在动物体内天然含量极微, 天然资源有限; 其次, 抗菌肽分子量小, 分离纯化困难, 提取步骤烦琐、得率低; 再次, 抗菌肽化学合成成本高, 价格昂贵。如何提高抗菌肽的产量, 降低生产成本的难题成为目前抗菌肽研究与应用的瓶颈。

5. 2 抗菌肽的活性问题虽然基因工程抗菌肽在一级结构上与天然抗菌肽一致, 却无法保证空间结构上的一致而造成活性差异。另外, 天然防腐剂的抗菌谱较窄, 客观上使其应用领域受到了限制。5. 3 抗菌肽的毒性问题至今尚无资料表明抗菌肽的体内毒性问题。但抗菌肽可能会引起过敏反应, 仅用于局部治疗; 许多天然抗菌肽都有溶血性。5. 4 抗菌肽的功能与结构的关系问题目前, 天然来源的抗菌肽已不能满足进一步对其作用机理及其高级结构研究的需要。

5. 5 抗菌肽的体内稳定性问题抗菌肽一级结构中由于含有多个碱性氨基酸残基(如赖氨酸、精氨

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为抗感染药物的体内使用。开发同时具有抗菌活

性与胰蛋白酶抑制剂活性的双功能多肽, 为解决抗菌肽作为药物的体内使用遇到的蛋白酶水解问题提供了新的方法。5. 6 抗菌肽的耐药性问题由于抗菌肽或者细胞应激反应因子触发病原体产生的一种耐药性机制, 这种机制包括:微生物对抗菌肽的应激协同反应, 蛋白酶介导的耐药性, 细胞内外靶位的修饰和抗菌

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肽的外排作用等。例如:Perron 等在实验室中对E. coli 和P. fluorescens 进行持续600~700代的筛选, 22/24谱系独立进化出了可遗传的对阳离子抗菌肽ex iganan 的耐药性。金黄色葡萄球菌除可

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分泌蛋白酶降解抗菌肽产生耐药性外, 还可以通调节vra DE 和vraSR 改变膜的转运作用而产生对蛙类抗菌肽te m porin L 和der m asepti n K4-S4的耐药性。5. 7 抗菌肽在生命体防御系统中准确地位以及模式生物研究抗菌肽表达水平与各种疾病具有相关性。抗菌肽、防御素与消化系统疾病如幽门螺杆菌感染、炎症性肠病、消化道肿瘤的关系已成为研究热点, 但缺少用于研究的生物模型而制约研究的发展。5. 8 抗菌肽的基因工程表达存在的问题基因工程表达抗菌肽存在的问题主要有:抗菌肽分子小, 易被蛋白酶降解, 缺乏检测抗菌肽方法; 基因的表达产物可能对宿主有害; 目的基因在宿主基因组中的随机整合有可能造成宿主染色体突变, 同时也可能影响其他基因的表达; 转抗菌肽基因动植物阳性率偏低及其最终应用时的安全性还有待研究等。

寻找有效的抗生素的道路困难重重, 开发出一种新的抗生素需要耗时日久。在抗生素耐药性日益严重、病毒病和肿瘤仍未攻克的今天, 抗菌肽的出现无疑为人们寻找理想的抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物提供了新的领域, 抗菌肽的应用将给解决细菌抗药性、药物残留等关键问题带来希望。新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽将会在农业、食品、卫生用品、医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等领域发挥重要的作用, 为人类创造巨大的价值。

(本文由作者根据第二届中国兽药大会/学术论坛0PPT 演讲稿整理而成)

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第二届中国兽药大会在南京隆重召开

2009年9月14-16日, 由中国兽医药品监察所、中国动物保健品协会联合主办的第二届中国兽药大会, 在南京隆重召开。本届兽药大会以/引领行业发展、保障食品安全0为主题, 通过举办主题报告会、国际论坛、学术论坛、成果转化签约、行业成果展览等系列活动, 充分展现建国60年来兽药行业取得的辉煌成就。大会会议内容丰富、会场气氛热烈。

大会由中监所冯忠武所长主持, 江苏省省委常委黄莉新副省长到会致辞, 高鸿宾副部长宣布大会开幕, 农业部兽医局李金祥局长出席大会并讲话。

60年来, 我国兽药行业不断壮大, 产业素质不断提高, 政府监管力度进一步加强, 法律法规体系日趋规范, 技术支撑体系逐步完善。兽药行业由小到大、从弱变强, 逐步形成门类相对齐全、品种相对多样、技术较为先进、产业链较为完整、具有一定国际竞争力的产业, 为促进我国畜牧业的健康发展, 保障食品安全和公共卫生安全做出了突出贡献, 为新农村建设、增加农民收入发挥了积极作用。当前我国兽药行业正处于一个新的发展时期, 机遇与挑战并存。要把握当前的有利形势, 进一步完善管理体制, 加大市场监管力度, 倡导行业自律, 促进行业健康、有序发展。要整合资源, 加强产学研联合开发, 加快科研成果转化, 加强国际交流, 促进共同发展。要共同努力把兽药行业做大做强, 为促进农业农村经济健康可持续发展做出更大贡献。

本届大会行业成果展览共有212家兽药企业、16家大型养殖企业和32家制药设备等企业参展, 达成兽药销售意向7000余万元。共有11家单位签订了科技成果转化协议, 签约金额11000万元。主题报告和学术论坛内容丰富, 夏咸柱院士等专家、领导分别作了5动物疫病的防控策略和行业发展战略6和5加强动物流感防控严防流感疫病大流行6等四个主题报告。61位兽药行业专家学者分别在8个专题论坛上作了43场学术报告, 畅谈行业发展规划, 交流行业科技成果, 探讨行业诚信和谐发展机制。国际动保联盟、美国食品和药品管理局(FDA ) 和澳大利亚农业部等国外行业专家也应邀出席大会并作专题报告, 促进对外交流合作, 扩大我国兽药行业的国际影响力。

中国畜牧兽医学会动物药品学分会、生物制品学分会、中国微生物学会兽医微生物学专业委员会、江苏省兽药业协会协办本届大会, 农业部兽医局和江苏省农业委员会也给予大力支持。农业部有关司局和事业单位, 各省(区) 市畜牧兽医行政管理、兽药监察检测、动物疫病控制、动物卫生监督等单位, 畜牧兽医大专院校与科研机构, 兽药生产经营与养殖企业等各界代表共3000多人参会。

兽药大会的成功举办, 将对我国兽药行业发展产生积极而深远的影响!

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