化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering
2008,Vol. 25No. 3
5
生物工程酶在化工中的应用进展
方尚玲, 李世杰
(湖北工业大学工业微生物湖北省重点实验室, 湖北武汉430068)
摘 要:阐述了酶应用的历史起源及酶在化工中应用的发展过程, 介绍了酶在化学工业中的覆盖面、地位和现状以及生物工程酶与化工融合发展的潜力和趋势。
关键词:酶; 生物化工; 应用和发展
中图分类号:TQ 033 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2008) 03-0005-05
1 酶应用的历史起源
酶是活细胞所产生的一种生物催化剂。自古以来酶就被用于日常生活, 如古人用动物的胃液来凝固牛奶, 制造奶酪; 用麦芽制饴糖; 用胰脏软化皮革; 用动物排泄物供兽皮脱毛; 用鸡内金治消化不良等。直到19世纪前后, 人们通过对胃肠的消化作用、麦芽的淀粉糖化作用和酵母酒精发酵的研究, 1783年胃液的作用, 。年, Payer (Dia 2stase ) , 可使2000倍的淀粉分解, 随后用于棉布退浆。1874年,B üchner 发现酵母的无细胞抽提液同样可以引起蔗糖的酒精发酵, 从而知道酶不仅由活细胞所产生, 而且从细胞分离以后仍可继续发生作用。这些发现导致了酶的商品生产。1894年, 高峰让吉首先用曲霉固体培养法生产淀粉酶, 且开设工厂。1908年, R hm 利用胰酶制皮革, 并用于洗涤剂中。这是酶在化学工业中的早期应用。
1949年, 随着抗生素的大规模生产和深层通风发酵技术的发展, 日本开始采用深层培养法生产细菌α2淀粉酶, 从此用生物工程的方法生产酶制剂进入大规模工业化阶段。同时由于酶的提纯技术的进步, 酶制剂在食品、化工、医药等领域得到了广泛的应用。
到目前为止, 已经在自然界发现的酶有2500多种, 申请专利的酶制剂有100多种, 其中有经济价值的有60余种, 工业化生产的酶制剂仅20种左右。从世界范围而言, 酶制剂总量的55%是水解酶, 主要用于焙烤食品、酿酒、淀粉加工、酒精和纺织等工业;35%是
收稿日期:2007-05-11
蛋白酶, 主要用于洗涤剂、制革和乳品工业; 其余是药
用酶制剂、试剂级酶制剂和工具酶[1～3]。
2 酶在化工中的应用
211 , 加酶、, hm and Haas 公司的Dr 1Otto 就已发现胰蛋白酶可以分解油脂和蛋白质, 在
洗衣剂中加入胰蛋白酶, 就可在较低的洗涤温度下, 很快将衣物洗净, 并在当年申请专利。第二次世界大战后, 瑞士和丹麦的几家公司分别对含酶洗涤剂进行改良,NOVO 公司用发酵的方法采用地衣芽孢杆菌产出了命名为Alcalase 的微生物碱性蛋白酶, 这种酶在p H 值8～10之间具有较好的活性和稳定性, 经过几年的改良, Gebr üder Schnyder 与其它公司合作推出性能很好的Biotex 预浸洗剂。由此, 西欧和美国开始普及含酶洗涤剂。但1969年前, 洗涤剂中仅添加碱性蛋白酶单一品种, 酶的剂型为细粉状, 加入方式为混拌, 在生产和使用过程中, 由于酶的粉尘飞扬, 引起工人和消费者表皮和粘膜出现了不同程度的过敏和溃疡, 使人们对酶产生了误解。
20世纪70年代初期,NOVO 公司将酶、惰性填料
和蜡制成酶颗粒, 后又经反复研究, 采用胶囊技术, 成功制成了现在使用的粒状酶。这种方法解决了粉状酶的缺陷, 同时由于复合加酶洗涤剂的开发, 含酶洗涤剂得到快速发展。
20世纪80年代以后的洗涤剂用酶, 从质量来看,
单位活力愈来愈高; 从剂型来看, 从细粒到外包裹小球
作者简介:方尚玲(1967-) , 女, 江西九江人, 在读博士, 副教授, 研究方向:工业微生物; 通讯联系人:李世杰, 教授。E 2mail :lsj_wh
@126. com 。
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状, 再发展到双色包裹小球状颗粒, 在生产和使用过程中克服了酶粉飞扬现象; 从酶品种来看, 除对原有的碱性蛋白酶不断优化外, 还相继开发出碱性脂肪酶、碱性淀粉酶和碱性纤维素酶等多种洗涤剂用酶, 从而使加酶洗涤剂的品种不断更新, 质量不断提升。20世纪80年代中期, 洗涤剂酶在世界工业酶总销售额中占25%左右, 至90年代中期上升到5亿美元, 占工业酶总销售额的40%[4,5]。212 酶在酒精工业和有机酸工业中的应用酒精和有机酸都是采用微生物发酵生产的重要化工产品, 其原料都是淀粉, 淀粉必须经淀粉酶处理分解成糖才能很快被微生物利用转化成酒精或有机酸。
酒精生产过程中, 淀粉质原料的糖化经历了从大麦芽到曲霉菌, 从固体培养曲霉菌到液体培养曲霉菌的过程。在一百多年的历程中, 酒精企业最棘手的问题是将淀粉转化成糖。1966年, 日本完成双酶法淀粉工业制糖后, 酶制剂生产从酒精企业独立出来。商品酶制剂不断进步, 简捷的糖化工艺使酒精企业可以稳定地扩大生产规模, 发酵罐的容积增大到m 3同时, 和工艺, 、强制回流和室外蒸馏等, 行业。
用生物工程方法生产的有机酸主要有:柠檬酸、乳酸、衣康酸和苹果酸等, 其生产一般用淀粉为原料, 与酒精工业相似, 不断引进新的酶水解工艺, 如加入中温和高温α2淀粉酶、采用连续喷射液化和清液发酵工艺, 取得了明显的经济效益[5,6]。
213 酶在纺织、皮革、造纸工业及日化用品中的应用
方尚玲等:生物工程酶在化工中的应用进展/2008年第3期
酶用于牙膏中可增强洁齿效果、预防龉齿; 用于护
肤品中则有抗辐射、抗皮肤衰老、杀菌消炎的功效。214 酶在精细化工中的应用
酶几乎可以催化所有类型的有机化学反应, 归纳起来大致有以下各种类型:氧化、还原、脱羧、脱氨、水解、脱水、甲基化、脱甲基化、卤化、酰胺化、乙酰化、脱甲氧基化、糖苷化、核苷化、磷酸化、酯化、基团转移、缩合、异构化、环氧化等。
最早应用生物催化实现产业化的是甾体类药物, 利用天然甾体化合物经过微生物酶催化羧基化、氧化、芳环化、环氧化可生产多种避孕药及可的松类药物; 利用链霉菌的羟基化酶可使活性很低的降胆固醇物质羟基化而得到活性提高上百倍的普伐他丁, 该药物的年销量达十多亿美元; 利用青霉素酰化酶催化分解青霉素生产62A PA , 为多种半合成青霉素提供了优质廉价的原料。
2050, 反应的转化率和选择性都超过了9919%, 产品纯度和成本都优于化学合成的丙烯酰胺。我国在2000年实现了万吨级生物法丙烯酰胺的工业化, 目前已有10万t 的生产能力, 达国际领先水平, 这是酶用于精细化工原料产业化的成功例子[7～9]。
1995年, 日本天野制药公司申请了第一个双酶法
生产乙醛酸的专利。其工艺采用乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶, 首先乙醇酸氧化酶将乙醇酸转化为乙醛酸过氧化物, 过氧化氢酶则将乙醇酸氧化产生的过氧化氢分解, 从而大大提高乙醛酸的转化率, 简化了分离纯化工艺。1995年底, 美国杜邦公司申请了基因工程菌方法生产乙醛酸的专利, 乙醛酸的转化率和选择性都接近100%, 且投资少, 成本低, 利于解决环保问题[10,11]。
从20世纪80年代开始已经利用脂肪酶合成了许多具有不同特性的脂肪酸酯, U nichem International 公司利用固定化的毛霉脂肪酶来替代传统的酸法生产十四酸异丙酯、棕榈酸异丙酯和棕榈酸22乙基己基酯, 生产采用填充床反应器, 经济有效, 产品质量高; 日本及德国在20世纪90年代开始开发酶法生产单甘酯新工艺, 产率达80%, 目前, 固定酶化反应器已达生产规模[2,11]。
手性化合物在精细化工产品中占有重要地位, 是医药、农药、香料功能性化学品的前体、中间体或产品。利用生物催化剂进行不对称合成、对映体拆分制备手性化合物发展极为迅速。应用于手性技术的主要是选
酶在纺织工业中的应用主要有:淀粉酶取代烧碱、硫酸、双氧水等用于织物在织造过程中的退浆处理; 纤维素酶用于纤维素纤维及其混纺织物的减量整理, 如牛仔服的酶洗整理等。
酶制剂用于皮革生产始于20世纪70年代酶法皮革脱毛软化, 经蛋白酶和脂肪酶处理的皮革质量提高, 大大降低了废水的污染。
酶制剂用于造纸工业主要有:木聚糖酶用于促进纸浆漂白, 可节约漂剂和提高浆料漂后白度; 淀粉酶和纤维素酶用于纤维改性和脱墨, 可促进油墨脱除、提高脱墨浆白度, 改善滤水性及提高卫生纸的柔软度; 漆酶用于木素改性和废水处理, 可提高含机械浆料的湿强度、降低废水色度及BOD/COD 值; 过氧化氢酶可降解漂白后残余过氧化氢。
方尚玲等:生物工程酶在化工中的应用进展/2008年第3期
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生物催化剂具有极高的催化效率和反应速度, 比
化学催化剂的催化效率高出107～1013倍; 酶催化的转化率更高, 如传统化学法合成丙烯酰胺, 转化率97%～98%, 采用丙烯腈水合酶催化合成的转化率可达99199%; 化学法生产天门冬氨酸转化率仅80%～85%, 酶法生产天门冬氨酸转化率可达99%以上。生
择性生物催化, 它不需要手性分离介质、手性试剂、手性溶剂、手性配基、手性催化剂等, 可直接将化学合成的外消旋衍生物、前体或手性化合物转化成单一对映异构体的光学活性产物。
微生物或酶手性拆分的典型例子是采用酰基转移酶I (Acylase I ) 拆分化学合成的消旋体N 2酰基2氨基酸来制取对映体纯D 或L 构型氨基酸, 在氨基酸工业生产上已经成为非常重要的方法。1955年这种方法就已用于工业生产,1969年日本开始采用固定化酶装置连续生产。采用这种方法可生产L 2丙氨酸、L 2蛋氨酸、L 2色氨酸、L 2缬氨酸等[11]。
酶生物催化不对称合成可将非手性或手性前体100%转化成手性目标产物。例如早期微生物氧化可
αβ的松、氢化可的松生产1122醇和1122醇, 近年62A PA 、72ACA 、L 2天门冬氨酸、L 2丙氨酸、L 2苹果酸、L 2
物催化具有高度的底物专一性和立体专一性, 只对特
定底物引起特定反应, 对产物立体构型、结构及催化反应的类型均有严格的选择性, 能有效催化一般化学反应较难进行的手性化合物合成[10～12]。31113 覆盖面越来越广
酶在洗涤剂行业、日用化学品行业、精细化学品制造、溶剂和有机酸生产、纺织、皮革、造纸等行业已经广泛应用。传统的化学剂和化学催化越来越多地被酶制剂和酶催化所取代。国际上许多著名的化学工业公司, 如美国孟山都公司, 70%以8%～9%[8]。312 酶应用于化工的不足
天然酶蛋白遇热不稳定、易降解; 与一些表面活性剂不相容; 虽然酶制剂可以通过微生物发酵生产, 但大规模生产的品种不多, 许多酶的价格相对较高; 对一些特定的催化反应要寻找可用的酶并非易事, 因此酶在化工生产特别是催化合成方面的应用仍然受到限制。生物酶合成技术在化学品产业中的应用首先是从高产值产品开始, 目前, 每公斤价格在万元水平以上的产品应用生物酶技术较多, 每公斤价值在百元以下的产品则很少。要使每公斤价值十元以下的化工基础原料采用酶技术产业化还有很多问题要解决[13,14]。
酒石酸、D 2对羟苯甘氨酸等的工业化都是很典型的例子。酶法生产L 2赖氨酸也是大规模生物催化不对称合成的生产实例[12,13]。
, 、溶剂和助剂用量, 。
以生物催化生产D 2泛酸内酯为例,DL 2泛酸内酯在D 2D 泛酸内酯水解酶的存在下, 发生不对称水解反应制备D 2泛酸内酯, 所得产品的立体定向性D 型光学纯度达9711%ee。1999年, 日本富士药业用生物催化法生产D 2泛酸内酯, 生产规模达3000t ・a -1。与化学拆分法相比较, 生物催化法能耗下降30%, 有机溶剂用量减少49%, 盐类用量减少61%, 耗水量减少40%, 废水中BOD 下降62%[10]。
3 酶应用于化工的优势和不足
311 酶应用于化工的优势31111 绿色化工的平台
4 酶在化工中的应用研究进展
411 酶制剂品种、质量的改进
酶催化反应一般在常温、常压和近于中性条件下进行, 投资少, 能耗低且操作安全性高; 生物催化剂本身是可生物降解的蛋白质, 是理想的绿色催化剂。酶在皮革、纺织、造纸及精细化工催化合成中的应用大幅减少了化学污染物的排放。应用生物催化技术可以在未来的20年中使传统化学工业的原材料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%, 污染物的排放和污染扩散减少30%, 从而使整个化学工业生产的面貌得到彻底改观[9,10]。31112 高效专一的特点
从最初的单一水解酶类, 逐渐开发出各种类别的
酶, 酶制剂的品种不断增多, 除了新发现的天然酶, 还有用分子生物学技术创造出的新的非天然酶。如脂肪族有机磷酸盐化合物农药不能被天然酶降解, 用定向进化和半推测法设计的一种磷酸三酯酶是人工改造的非天然酶, 可以降解这种有机磷农药。从酶品质上看, 其稳定性和酶活不断改良, 酶反应的适宜温度大幅提高, 而工程酶酶活可提高几十倍到近千倍。412 应用领域的拓展
辣根酶和葡萄糖氧化酶已用于生物传感器, 新的
8
酶膜传感器还在不断开发, 有些酶还用于生物燃料电池的研究[15,16]。
酶用于污水处理, 如水解酶用于分解废水中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机物质, 降低废水的BOD 值; 含硝酸盐和亚硝酸盐的废水可用硝酸还原酶处理; 漆酶被用来直接分解各种酚类染料, 如取代酚、氯酚、硫酚、双酚A 、芳香胺等, 在漆酶介体(HB T 、AB TS 等) 存在下, 漆酶还可降解与木质素有关的二苯基甲烷、N 2对苯基二胺、有机磷化合物和二口恶口英等, 有望用于治理含酚废水、印染废水和造纸废水; 酶也可用于检测污水的BOD 、有机磷农药、金属污染等指标。酶在污水处理方面的应用在不断拓展[17,18]。
酶不断被开发用于催化合成新的化工产品, 如腈水合酶催化生产烟酰胺、腈水合酶催化生产丙烯酰胺进而合成聚丙烯酰胺在石油工业中已经推广应用; 羟
β基丁酸内酯水解酶催化生产D 2泛酸、2酪氨酸酶催化
生产L 2多巴, 脱水酶/羟化酶催化生产L 2肉碱, 脂肪酶催化生产(S ) 氯丙酸, 酶催化生产L 2天门冬氨酸及其它手性化学品; 化学品; 酶催化聚乳酸的合成、合成、。
, 使其在手性药物的拆分、手性高分子的制备、酚树脂的合成、导电有机聚合物的合成、发光有机聚合物的合成、生物柴油的转化、甾体的转化等方面得到愈来愈广泛的应用[2]。
酶化工和其它生物技术及化工技术的交叉和渗透也日益深化。化学修饰和分子生物学的手段直接用于酶的改造或产生新的化工用酶; 酶制剂的推广应用促进了发酵工业发展; 酶的固定化材料和固定化技术与化工密不可分; 多酶反应器应用新的化工材料和化工设备; 酶生物传感器应用纳米材料和纳米技术; 化学方法手性拆分和不对称合成这一典型的精细化工逐渐为酶催化所取代; 膜技术用于酶反应产品的分离精制等。酶化工促进了分子生物学、化学、材料科学、生物工程学的交叉融合, 酶催化和酶制剂的应用覆盖了化学化工各领域。413 分子酶学工程的进展
分子酶学工程的最基本目标就是设计新的生物催化剂。如采用化学策略则有化学修饰、化学模拟、组合化学; 如采用生物学策略则有基因克隆、基因突变、定向进化、组合酶学和组合生物催化。近年来以分子生物学改造酶的技术迅猛发展, 特别是理性设计和定向进化技术的研究非常活跃。
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41311 酶的化学修饰和人工合成
酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上, 或将酶分子的某部分去除或置换, 改变酶的理化性质, 最终达到改变酶的催化性能的目的。酶的化学修饰主要有以下几种方法:(1) 修饰酶的功能基团, 如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团, 由此发展起来的方法有酰化法、烷基化法、丹磺酰氯法等。如抗白血病药物天冬酰胺酶经修饰后, 可使其在血浆中的稳定性提高数倍。(2) 酶分子内或分子间交联, 利用某些双功能试剂分子两端的功能基团(如醛基等) 可使酶分子内或分子间肽链的2个游离氨基分别发生交联, 主要有右旋糖苷溴化氰法、羰二亚胺法、戊二醛法等。例如, 交联后的α2半乳糖苷酶A , 其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显提高。(3) 酶与高分子化合物结合, 主要有聚乙烯醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与高分子化合物结合后, 可以增强酶的稳定性, 如α2淀粉酶在65215, , 半衰, , 特别是在对映体选择降解、非对映体裂解和手性化合物的合成与拆分方面, 化学修饰酶弥补了这一缺陷[19,20]。
人工合成酶是指模拟酶的催化功能, 用化学方法合成的一类有机催化剂。纤维素酶类、SOD 酶、固氮酶等的模拟都有研究报道。目前, 人工合成酶的催化活性仅有少量能达到天然酶的活性。41312 生物学方法4131211 定点突变技术(Site 2directed mutagenesis )
定点突变技术是在已知DNA 系列中取代、插入或删除特定的核苷酸, 从而改变酶结构中的个别氨基酸残基。定点突变可改变特定的核苷酸, 也可对一段最可能影响酶的功能与性质的基因序列进行随机突变, 从而产生一系列突变酶分子。定点突变是在已知酶结构与功能的基础上, 有目的地改变酶的某一活性基团或模块, 从而产生新性状的酶, 故又称理性分子设计(Rational design ) [21,22]。4131212 定向进化技术(Directed evolution ) 酶分子的定向进化技术主要有以下几种:易错PCR (Error 2p rone PCR ) 、DNA 改组技术(DNA shuff 2ling ) 、Family shuffling 、交错延伸重组(Stagger exten 2sion p rocess , STEP ) 、随机引物体外重组(Random 2p riming vit ro recombination ,RPR ) 、临时模板随机嵌合生长(Random chimeragenesis on t ransient tem 2plates ,RAC HITr ) 等。酶分子的定向进化可以不需事
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[6] 贾树标, 李盛贤, 吴国峰. 新编酒精工艺学[M ].北京:化学工业出
先了解酶的空间结构和催化机制, 而是人为地创造特
殊的进化条件, 模拟自然进化机制, 在体外对酶基因进行改造, 并定向筛选获得具有某些预期特征的进化酶。
筛选方法在酶的定向进化中至关重要, 直接关系到定向进化的成败。高通量筛选(High t hroughout screening , H TS ) 不仅可大幅减少工作量, 还加快了酶的某种特征的进化速度。
理性设计和定向进化可以改变各种酶的反应活性、稳定性、特异性和可溶性, 使其在工业条件下仍能运作。比如:同时应用同源基因突变和随机突变, 使草甘膦的N 2乙酰转移酶的活性提高了10000倍[23,24]; 来源于放射形土壤杆菌的环氧化物水解酶的对映体选择性也通过易错PCR 、DNA 重组和高效筛选提高了13倍; 人类的碳酸酐酶Ⅱ通过三轮突变、选择和重组, 对酯类底物22萘基醋酸盐的活性提高了40倍; 进化后果胶酸盐裂解酶的溶解温度提高了16℃, 细菌的肌醇六磷酸酶的溶解温度
[21～25]
提高了12℃; 木聚糖酶的溶解温度提高了35℃。
版社,2004:38239.
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5 结语
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, , 近年来, 化学及化学工程加快了与生命科学的交叉、融合, 特别是化学工程与酶工程和酶制剂的结合, 使化工行业以崭新的面貌出现。化学和生物的方法改良酶或创造出新的酶, 给化学催化合成带来质的变化。酶化工实现高效、清洁生产, 将使21世纪的化工行业成为新阳光经济的重要支柱。
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Application Development of Bioengineering Enzyme in Chemical Engineering
FANG Shang 2ling ,L I Shi 2jie
(H ubei Key L aboratory of M icrobes , H ubei Uni versit y of Technolog y , W uhan 430068, Chi na )
Abstract :The historic origin and developing course of application of enzyme were stated. The application field ,stat us and current sit uation of enzyme in chemical indust ry were introduced. And t he potential and t rend of unifying develop ment of bioengineering enzyme and chemical engineering were discussed.
K eyw ords :enzyme ;biochemical engineering ;application and develop ment
化学与生物工程
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2008,Vol. 25No. 3
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1949年, 随着抗生素的大规模生产和深层通风发酵技术的发展, 日本开始采用深层培养法生产细菌α2淀粉酶, 从此用生物工程的方法生产酶制剂进入大规模工业化阶段。同时由于酶的提纯技术的进步, 酶制剂在食品、化工、医药等领域得到了广泛的应用。
到目前为止, 已经在自然界发现的酶有2500多种, 申请专利的酶制剂有100多种, 其中有经济价值的有60余种, 工业化生产的酶制剂仅20种左右。从世界范围而言, 酶制剂总量的55%是水解酶, 主要用于焙烤食品、酿酒、淀粉加工、酒精和纺织等工业;35%是
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蛋白酶, 主要用于洗涤剂、制革和乳品工业; 其余是药
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2 酶在化工中的应用
211 , 加酶、, hm and Haas 公司的Dr 1Otto 就已发现胰蛋白酶可以分解油脂和蛋白质, 在
洗衣剂中加入胰蛋白酶, 就可在较低的洗涤温度下, 很快将衣物洗净, 并在当年申请专利。第二次世界大战后, 瑞士和丹麦的几家公司分别对含酶洗涤剂进行改良,NOVO 公司用发酵的方法采用地衣芽孢杆菌产出了命名为Alcalase 的微生物碱性蛋白酶, 这种酶在p H 值8～10之间具有较好的活性和稳定性, 经过几年的改良, Gebr üder Schnyder 与其它公司合作推出性能很好的Biotex 预浸洗剂。由此, 西欧和美国开始普及含酶洗涤剂。但1969年前, 洗涤剂中仅添加碱性蛋白酶单一品种, 酶的剂型为细粉状, 加入方式为混拌, 在生产和使用过程中, 由于酶的粉尘飞扬, 引起工人和消费者表皮和粘膜出现了不同程度的过敏和溃疡, 使人们对酶产生了误解。
20世纪70年代初期,NOVO 公司将酶、惰性填料
和蜡制成酶颗粒, 后又经反复研究, 采用胶囊技术, 成功制成了现在使用的粒状酶。这种方法解决了粉状酶的缺陷, 同时由于复合加酶洗涤剂的开发, 含酶洗涤剂得到快速发展。
20世纪80年代以后的洗涤剂用酶, 从质量来看,
单位活力愈来愈高; 从剂型来看, 从细粒到外包裹小球
作者简介:方尚玲(1967-) , 女, 江西九江人, 在读博士, 副教授, 研究方向:工业微生物; 通讯联系人:李世杰, 教授。E 2mail :lsj_wh
@126. com 。
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状, 再发展到双色包裹小球状颗粒, 在生产和使用过程中克服了酶粉飞扬现象; 从酶品种来看, 除对原有的碱性蛋白酶不断优化外, 还相继开发出碱性脂肪酶、碱性淀粉酶和碱性纤维素酶等多种洗涤剂用酶, 从而使加酶洗涤剂的品种不断更新, 质量不断提升。20世纪80年代中期, 洗涤剂酶在世界工业酶总销售额中占25%左右, 至90年代中期上升到5亿美元, 占工业酶总销售额的40%[4,5]。212 酶在酒精工业和有机酸工业中的应用酒精和有机酸都是采用微生物发酵生产的重要化工产品, 其原料都是淀粉, 淀粉必须经淀粉酶处理分解成糖才能很快被微生物利用转化成酒精或有机酸。
酒精生产过程中, 淀粉质原料的糖化经历了从大麦芽到曲霉菌, 从固体培养曲霉菌到液体培养曲霉菌的过程。在一百多年的历程中, 酒精企业最棘手的问题是将淀粉转化成糖。1966年, 日本完成双酶法淀粉工业制糖后, 酶制剂生产从酒精企业独立出来。商品酶制剂不断进步, 简捷的糖化工艺使酒精企业可以稳定地扩大生产规模, 发酵罐的容积增大到m 3同时, 和工艺, 、强制回流和室外蒸馏等, 行业。
用生物工程方法生产的有机酸主要有:柠檬酸、乳酸、衣康酸和苹果酸等, 其生产一般用淀粉为原料, 与酒精工业相似, 不断引进新的酶水解工艺, 如加入中温和高温α2淀粉酶、采用连续喷射液化和清液发酵工艺, 取得了明显的经济效益[5,6]。
213 酶在纺织、皮革、造纸工业及日化用品中的应用
方尚玲等:生物工程酶在化工中的应用进展/2008年第3期
酶用于牙膏中可增强洁齿效果、预防龉齿; 用于护
肤品中则有抗辐射、抗皮肤衰老、杀菌消炎的功效。214 酶在精细化工中的应用
酶几乎可以催化所有类型的有机化学反应, 归纳起来大致有以下各种类型:氧化、还原、脱羧、脱氨、水解、脱水、甲基化、脱甲基化、卤化、酰胺化、乙酰化、脱甲氧基化、糖苷化、核苷化、磷酸化、酯化、基团转移、缩合、异构化、环氧化等。
最早应用生物催化实现产业化的是甾体类药物, 利用天然甾体化合物经过微生物酶催化羧基化、氧化、芳环化、环氧化可生产多种避孕药及可的松类药物; 利用链霉菌的羟基化酶可使活性很低的降胆固醇物质羟基化而得到活性提高上百倍的普伐他丁, 该药物的年销量达十多亿美元; 利用青霉素酰化酶催化分解青霉素生产62A PA , 为多种半合成青霉素提供了优质廉价的原料。
2050, 反应的转化率和选择性都超过了9919%, 产品纯度和成本都优于化学合成的丙烯酰胺。我国在2000年实现了万吨级生物法丙烯酰胺的工业化, 目前已有10万t 的生产能力, 达国际领先水平, 这是酶用于精细化工原料产业化的成功例子[7～9]。
1995年, 日本天野制药公司申请了第一个双酶法
生产乙醛酸的专利。其工艺采用乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶, 首先乙醇酸氧化酶将乙醇酸转化为乙醛酸过氧化物, 过氧化氢酶则将乙醇酸氧化产生的过氧化氢分解, 从而大大提高乙醛酸的转化率, 简化了分离纯化工艺。1995年底, 美国杜邦公司申请了基因工程菌方法生产乙醛酸的专利, 乙醛酸的转化率和选择性都接近100%, 且投资少, 成本低, 利于解决环保问题[10,11]。
从20世纪80年代开始已经利用脂肪酶合成了许多具有不同特性的脂肪酸酯, U nichem International 公司利用固定化的毛霉脂肪酶来替代传统的酸法生产十四酸异丙酯、棕榈酸异丙酯和棕榈酸22乙基己基酯, 生产采用填充床反应器, 经济有效, 产品质量高; 日本及德国在20世纪90年代开始开发酶法生产单甘酯新工艺, 产率达80%, 目前, 固定酶化反应器已达生产规模[2,11]。
手性化合物在精细化工产品中占有重要地位, 是医药、农药、香料功能性化学品的前体、中间体或产品。利用生物催化剂进行不对称合成、对映体拆分制备手性化合物发展极为迅速。应用于手性技术的主要是选
酶在纺织工业中的应用主要有:淀粉酶取代烧碱、硫酸、双氧水等用于织物在织造过程中的退浆处理; 纤维素酶用于纤维素纤维及其混纺织物的减量整理, 如牛仔服的酶洗整理等。
酶制剂用于皮革生产始于20世纪70年代酶法皮革脱毛软化, 经蛋白酶和脂肪酶处理的皮革质量提高, 大大降低了废水的污染。
酶制剂用于造纸工业主要有:木聚糖酶用于促进纸浆漂白, 可节约漂剂和提高浆料漂后白度; 淀粉酶和纤维素酶用于纤维改性和脱墨, 可促进油墨脱除、提高脱墨浆白度, 改善滤水性及提高卫生纸的柔软度; 漆酶用于木素改性和废水处理, 可提高含机械浆料的湿强度、降低废水色度及BOD/COD 值; 过氧化氢酶可降解漂白后残余过氧化氢。
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生物催化剂具有极高的催化效率和反应速度, 比
化学催化剂的催化效率高出107～1013倍; 酶催化的转化率更高, 如传统化学法合成丙烯酰胺, 转化率97%～98%, 采用丙烯腈水合酶催化合成的转化率可达99199%; 化学法生产天门冬氨酸转化率仅80%～85%, 酶法生产天门冬氨酸转化率可达99%以上。生
择性生物催化, 它不需要手性分离介质、手性试剂、手性溶剂、手性配基、手性催化剂等, 可直接将化学合成的外消旋衍生物、前体或手性化合物转化成单一对映异构体的光学活性产物。
微生物或酶手性拆分的典型例子是采用酰基转移酶I (Acylase I ) 拆分化学合成的消旋体N 2酰基2氨基酸来制取对映体纯D 或L 构型氨基酸, 在氨基酸工业生产上已经成为非常重要的方法。1955年这种方法就已用于工业生产,1969年日本开始采用固定化酶装置连续生产。采用这种方法可生产L 2丙氨酸、L 2蛋氨酸、L 2色氨酸、L 2缬氨酸等[11]。
酶生物催化不对称合成可将非手性或手性前体100%转化成手性目标产物。例如早期微生物氧化可
αβ的松、氢化可的松生产1122醇和1122醇, 近年62A PA 、72ACA 、L 2天门冬氨酸、L 2丙氨酸、L 2苹果酸、L 2
物催化具有高度的底物专一性和立体专一性, 只对特
定底物引起特定反应, 对产物立体构型、结构及催化反应的类型均有严格的选择性, 能有效催化一般化学反应较难进行的手性化合物合成[10～12]。31113 覆盖面越来越广
酶在洗涤剂行业、日用化学品行业、精细化学品制造、溶剂和有机酸生产、纺织、皮革、造纸等行业已经广泛应用。传统的化学剂和化学催化越来越多地被酶制剂和酶催化所取代。国际上许多著名的化学工业公司, 如美国孟山都公司, 70%以8%～9%[8]。312 酶应用于化工的不足
天然酶蛋白遇热不稳定、易降解; 与一些表面活性剂不相容; 虽然酶制剂可以通过微生物发酵生产, 但大规模生产的品种不多, 许多酶的价格相对较高; 对一些特定的催化反应要寻找可用的酶并非易事, 因此酶在化工生产特别是催化合成方面的应用仍然受到限制。生物酶合成技术在化学品产业中的应用首先是从高产值产品开始, 目前, 每公斤价格在万元水平以上的产品应用生物酶技术较多, 每公斤价值在百元以下的产品则很少。要使每公斤价值十元以下的化工基础原料采用酶技术产业化还有很多问题要解决[13,14]。
酒石酸、D 2对羟苯甘氨酸等的工业化都是很典型的例子。酶法生产L 2赖氨酸也是大规模生物催化不对称合成的生产实例[12,13]。
, 、溶剂和助剂用量, 。
以生物催化生产D 2泛酸内酯为例,DL 2泛酸内酯在D 2D 泛酸内酯水解酶的存在下, 发生不对称水解反应制备D 2泛酸内酯, 所得产品的立体定向性D 型光学纯度达9711%ee。1999年, 日本富士药业用生物催化法生产D 2泛酸内酯, 生产规模达3000t ・a -1。与化学拆分法相比较, 生物催化法能耗下降30%, 有机溶剂用量减少49%, 盐类用量减少61%, 耗水量减少40%, 废水中BOD 下降62%[10]。
3 酶应用于化工的优势和不足
311 酶应用于化工的优势31111 绿色化工的平台
4 酶在化工中的应用研究进展
411 酶制剂品种、质量的改进
酶催化反应一般在常温、常压和近于中性条件下进行, 投资少, 能耗低且操作安全性高; 生物催化剂本身是可生物降解的蛋白质, 是理想的绿色催化剂。酶在皮革、纺织、造纸及精细化工催化合成中的应用大幅减少了化学污染物的排放。应用生物催化技术可以在未来的20年中使传统化学工业的原材料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%, 污染物的排放和污染扩散减少30%, 从而使整个化学工业生产的面貌得到彻底改观[9,10]。31112 高效专一的特点
从最初的单一水解酶类, 逐渐开发出各种类别的
酶, 酶制剂的品种不断增多, 除了新发现的天然酶, 还有用分子生物学技术创造出的新的非天然酶。如脂肪族有机磷酸盐化合物农药不能被天然酶降解, 用定向进化和半推测法设计的一种磷酸三酯酶是人工改造的非天然酶, 可以降解这种有机磷农药。从酶品质上看, 其稳定性和酶活不断改良, 酶反应的适宜温度大幅提高, 而工程酶酶活可提高几十倍到近千倍。412 应用领域的拓展
辣根酶和葡萄糖氧化酶已用于生物传感器, 新的
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酶膜传感器还在不断开发, 有些酶还用于生物燃料电池的研究[15,16]。
酶用于污水处理, 如水解酶用于分解废水中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机物质, 降低废水的BOD 值; 含硝酸盐和亚硝酸盐的废水可用硝酸还原酶处理; 漆酶被用来直接分解各种酚类染料, 如取代酚、氯酚、硫酚、双酚A 、芳香胺等, 在漆酶介体(HB T 、AB TS 等) 存在下, 漆酶还可降解与木质素有关的二苯基甲烷、N 2对苯基二胺、有机磷化合物和二口恶口英等, 有望用于治理含酚废水、印染废水和造纸废水; 酶也可用于检测污水的BOD 、有机磷农药、金属污染等指标。酶在污水处理方面的应用在不断拓展[17,18]。
酶不断被开发用于催化合成新的化工产品, 如腈水合酶催化生产烟酰胺、腈水合酶催化生产丙烯酰胺进而合成聚丙烯酰胺在石油工业中已经推广应用; 羟
β基丁酸内酯水解酶催化生产D 2泛酸、2酪氨酸酶催化
生产L 2多巴, 脱水酶/羟化酶催化生产L 2肉碱, 脂肪酶催化生产(S ) 氯丙酸, 酶催化生产L 2天门冬氨酸及其它手性化学品; 化学品; 酶催化聚乳酸的合成、合成、。
, 使其在手性药物的拆分、手性高分子的制备、酚树脂的合成、导电有机聚合物的合成、发光有机聚合物的合成、生物柴油的转化、甾体的转化等方面得到愈来愈广泛的应用[2]。
酶化工和其它生物技术及化工技术的交叉和渗透也日益深化。化学修饰和分子生物学的手段直接用于酶的改造或产生新的化工用酶; 酶制剂的推广应用促进了发酵工业发展; 酶的固定化材料和固定化技术与化工密不可分; 多酶反应器应用新的化工材料和化工设备; 酶生物传感器应用纳米材料和纳米技术; 化学方法手性拆分和不对称合成这一典型的精细化工逐渐为酶催化所取代; 膜技术用于酶反应产品的分离精制等。酶化工促进了分子生物学、化学、材料科学、生物工程学的交叉融合, 酶催化和酶制剂的应用覆盖了化学化工各领域。413 分子酶学工程的进展
分子酶学工程的最基本目标就是设计新的生物催化剂。如采用化学策略则有化学修饰、化学模拟、组合化学; 如采用生物学策略则有基因克隆、基因突变、定向进化、组合酶学和组合生物催化。近年来以分子生物学改造酶的技术迅猛发展, 特别是理性设计和定向进化技术的研究非常活跃。
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41311 酶的化学修饰和人工合成
酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上, 或将酶分子的某部分去除或置换, 改变酶的理化性质, 最终达到改变酶的催化性能的目的。酶的化学修饰主要有以下几种方法:(1) 修饰酶的功能基团, 如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团, 由此发展起来的方法有酰化法、烷基化法、丹磺酰氯法等。如抗白血病药物天冬酰胺酶经修饰后, 可使其在血浆中的稳定性提高数倍。(2) 酶分子内或分子间交联, 利用某些双功能试剂分子两端的功能基团(如醛基等) 可使酶分子内或分子间肽链的2个游离氨基分别发生交联, 主要有右旋糖苷溴化氰法、羰二亚胺法、戊二醛法等。例如, 交联后的α2半乳糖苷酶A , 其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显提高。(3) 酶与高分子化合物结合, 主要有聚乙烯醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与高分子化合物结合后, 可以增强酶的稳定性, 如α2淀粉酶在65215, , 半衰, , 特别是在对映体选择降解、非对映体裂解和手性化合物的合成与拆分方面, 化学修饰酶弥补了这一缺陷[19,20]。
人工合成酶是指模拟酶的催化功能, 用化学方法合成的一类有机催化剂。纤维素酶类、SOD 酶、固氮酶等的模拟都有研究报道。目前, 人工合成酶的催化活性仅有少量能达到天然酶的活性。41312 生物学方法4131211 定点突变技术(Site 2directed mutagenesis )
定点突变技术是在已知DNA 系列中取代、插入或删除特定的核苷酸, 从而改变酶结构中的个别氨基酸残基。定点突变可改变特定的核苷酸, 也可对一段最可能影响酶的功能与性质的基因序列进行随机突变, 从而产生一系列突变酶分子。定点突变是在已知酶结构与功能的基础上, 有目的地改变酶的某一活性基团或模块, 从而产生新性状的酶, 故又称理性分子设计(Rational design ) [21,22]。4131212 定向进化技术(Directed evolution ) 酶分子的定向进化技术主要有以下几种:易错PCR (Error 2p rone PCR ) 、DNA 改组技术(DNA shuff 2ling ) 、Family shuffling 、交错延伸重组(Stagger exten 2sion p rocess , STEP ) 、随机引物体外重组(Random 2p riming vit ro recombination ,RPR ) 、临时模板随机嵌合生长(Random chimeragenesis on t ransient tem 2plates ,RAC HITr ) 等。酶分子的定向进化可以不需事
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[6] 贾树标, 李盛贤, 吴国峰. 新编酒精工艺学[M ].北京:化学工业出
先了解酶的空间结构和催化机制, 而是人为地创造特
殊的进化条件, 模拟自然进化机制, 在体外对酶基因进行改造, 并定向筛选获得具有某些预期特征的进化酶。
筛选方法在酶的定向进化中至关重要, 直接关系到定向进化的成败。高通量筛选(High t hroughout screening , H TS ) 不仅可大幅减少工作量, 还加快了酶的某种特征的进化速度。
理性设计和定向进化可以改变各种酶的反应活性、稳定性、特异性和可溶性, 使其在工业条件下仍能运作。比如:同时应用同源基因突变和随机突变, 使草甘膦的N 2乙酰转移酶的活性提高了10000倍[23,24]; 来源于放射形土壤杆菌的环氧化物水解酶的对映体选择性也通过易错PCR 、DNA 重组和高效筛选提高了13倍; 人类的碳酸酐酶Ⅱ通过三轮突变、选择和重组, 对酯类底物22萘基醋酸盐的活性提高了40倍; 进化后果胶酸盐裂解酶的溶解温度提高了16℃, 细菌的肌醇六磷酸酶的溶解温度
[21～25]
提高了12℃; 木聚糖酶的溶解温度提高了35℃。
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Application Development of Bioengineering Enzyme in Chemical Engineering
FANG Shang 2ling ,L I Shi 2jie
(H ubei Key L aboratory of M icrobes , H ubei Uni versit y of Technolog y , W uhan 430068, Chi na )
Abstract :The historic origin and developing course of application of enzyme were stated. The application field ,stat us and current sit uation of enzyme in chemical indust ry were introduced. And t he potential and t rend of unifying develop ment of bioengineering enzyme and chemical engineering were discussed.
K eyw ords :enzyme ;biochemical engineering ;application and develop ment