第三章
1细胞培养：所谓细胞培养是指将有机体内的某一组织，如动物的肝、肾或肌肉等取出，分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和分裂的技术。
2细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。)
3组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长) 4器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)
5原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在培养条件下传 １ 至 １０ 代 ）。 6传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传 ４０ 至 ５０ 代的细胞 ）。
7细胞株（cell strain ）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就要出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过危机而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40-50代次。并且保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。此类细胞成为细胞株。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell strain) 。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。
8细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。当细胞株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。
9原代培养细胞的生命归宿
●原代培养期
●传代期
●衰退期
10培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长, 见于各种实体瘤细胞;
悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面, 见于各种造血系统肿瘤细胞。
11贴附生长细胞的生长过程
游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。
潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂， 机制：接触抑制、密度依赖性。
12血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。
24细胞传代方法
1. 悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l ／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2.半悬浮生长细胞传代
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3.贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
25贴壁生长细胞传代方法
1 吸光培养瓶中的培养液；
2 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10 min（显微镜下动态监测）；
3 吸去胰蛋白酶液，加入新鲜培养液；
4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；
5 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内；
6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内；
7 将后者放入培养箱中培养。
28细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 29冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
31低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO （二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
32细胞冻存方法
1预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO
2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
3 加入1ml 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
4 年后，存活率可达80％一90％。DMSO 液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。
33细胞复苏方法
（l ）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
34细胞分离方法
非酶消化法:1.直接分离法（机械法和EDTA 螯合法）2. 组织块培养法
酶消化法:1.胰酶消化（条件较难掌握）2. 胶原酶消化（两步灌流法）3. Dispase （中性蛋白酶）
1. 胰蛋白酶 (Trypsin)
●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。
●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg 组织加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
●通过无菌不锈钢丝网（100～200mm ）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶 (Collagenase)
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hanks' 平衡液（HBSS ）清洗组织碎片几次。
●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS 中）。
●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
●通过离心在HBSS 中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3.Dispase
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
●加入Dispase （0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
●在37℃孵育20分钟到几个小时。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase 。
●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
第五章 海洋动物的细胞操作
1细胞操作又叫细胞工程是指利用细胞融合和显微操作等方法对生物体的构成单位——包括体细胞和生殖细胞直接用手操作，创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。细胞操作和染色体操作以及基因操作关系密切，所以有时将它们统称为细胞操作。
2常用技术： 动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植
单克隆抗体的制备
多莉羊的培育过程
3 细胞遗传操作常用方法
一、抑制细胞分裂 二、细胞融合 三、染色体失活的方法 四、染色体的观察及倍性分析
五、体细胞及配子的制备 六、卵和早期胚胎细胞操作的前处理
4细胞遗传操作常用方法
5抑制细胞分裂
1化学方法： 化学方法主要是利用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞的分裂过程，从而达到预期的目的。
常用的化学药品有：细胞松弛素B 、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等。
细胞松弛素B （CB ）：是一类真菌的代谢产物，抑制细胞分裂的机制是特异性地破坏微丝，使最终导致细胞分离的由微丝构成的“收缩环”解体，抑制细胞分裂。有效的使用浓度是0.5～1.0 mg/dm3，一般溶解在0.1％的二甲基亚砜中使用。
二甲氨基嘌呤（6-DMAP ）：通过对磷酸化激酶的抑制，抑制一系列有磷酸激酶参与的生化反应和细胞功能，如抑制极体的形成和释放等，有效浓度为200～400 μmol/dm3。
咖啡因：其作用效果在于提高细胞内的Ca2+浓度，而构成细胞分裂过程中的纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感，在微管自装配中Ca2+起作用， Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止分裂。使用浓度为5～15mmol/dm3。
dm3:立方分米
2 物理方法：物理方法是在细胞分裂周期中施加物理处理影响和干预细胞的正常分裂，达到预期目的。
常用的方法有温度休克法和静水压等。
温度休克法：其机制是引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤丝所需的A TP 的供应途径受阻，使已完成染色体加倍的细胞不能分裂。常用温度的确定根据应用种类的不同而有所差异，一般是在该物种生存温度范围的上下限附近。
水静压：利用水静压设备（液压机等）产生的压力施加于处理对象。其机制主要是抑制纺锤体的微丝和微管的形成，阻止染色体的移动，从而抑制细胞分裂。常用的压力范围是200～500 kg/cm2。
6细胞融合
一般多用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（，PEG ）诱导两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ ），为RNA 病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG ）。PEG 用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 7染色体失活的方法
染色体失活是细胞遗传操作中常用的方法，如雌核发育就是通过精子的失活来实现的。
辐射处理：包括紫外线、γ射线、X 射线等。较为常用的是紫外线。紫外线主要作用于DNA ，经紫外线照射后，DNA 的氢键断裂，同一链上相邻的或两链上相对应的胸腺嘧啶之间形成二聚体，使DNA 局部变性，从而影响正常的复制和转录，使DNA 失活。操作过程中需要考虑的因素有：紫外线照射剂量、精子的浓度、精子铺设的厚度、照射的时间等。例如对于贝类而言，照射剂量一般在500～1000 uW/cm2,
精子铺设的厚度为1 mm，照射的时间为0～3mim ，另外需要注意DNA 的光复活作用，照射结束之后要严格避免光照。
化学处理：可用于精子灭活的化学物质有甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐、吖啶黄、噻嗪等。
29海洋动物性别控制的意义
提高群体生长率；
控制繁殖速度；
延长有效生长期；
提高水产品质量。
第三节 嵌合体动物的培育
30定义：所谓嵌合体，是将两个遗传上不同的细胞混合起来发育得到的生物体。
31嵌合体类别
按形成嵌合体的不同基因型组织的来源，嵌合体可分为同源嵌合体和异源嵌合体。
同源嵌合体 嵌合成分来自原属同一受精卵的嵌合体，大部分由染色体畸变和基因突变（自发或诱发）产生。可分为两种： 染色体嵌合体 和基因嵌合体 。
异源嵌合体 嵌合成分来自不同的受精卵所产生的嵌合体。和同源嵌合体一样，嵌合成分可以包含不同的染色体或不同的基因。
32鱼类嵌合体的培育方法
凝集法：除去卵膜后，在囊胚期用细玻璃针将胚盘的一部分刺伤，将其他胚盘的细胞块移入；
显微注射法：将一个胚盘分离出的分裂球，用毛细管注入另一胚盘的内部；
基因导入法：在二细胞期后，用毛细吸管给一部分分裂球或单细胞期的卵导入外源基因，即转基因动物。
33多倍体是指体细胞中含有三个或更多个染色体组的个体，并依所含染色体组数顺次称为三倍体（triploid ）、四倍体等。
34三倍体鱼类产生的机制：一般认为是由于卵子受精后不排出第二极体所造成的，即卵子没有经过减数分裂而称为二倍体卵，再与正常的单倍体精子受精便形成三倍体。
多倍体的经济形状：个体大、生长快、肉质好、寿命长、适应性强、高产等。
35三倍体诱导方法
一、抑制第二极体
静水压法：200～250 kg/cm3的压力，处理贝类受精卵10 min左右；
热休克法：30～38℃，处理时间10～20 min；
冷休克法：0～8℃，处理时间10～20 min；
CB 处理法：0.5～1.0 mgdm3，处理时间10～15 min；
6-DMAP 处理法：300～450 μmol/dm3，处理时间10～20 min；
咖啡因处理法：5～15 mmol/dm3，处理时间10～15 min；
咖啡因与热休克结合使用：能够提高诱导率，但胚胎孵化率较低。
1. 温度处理 冷休克、热休克
抑制第二次成熟分裂或第一次有丝分裂而产生三倍体或四倍体。温度处理的关键：确定处理开始时间、持续时间以及温度高低。
2. 静水压处理
当施加压力时，有丝分裂器中的纺锤体崩解，由蛋白质组成的微管解凝，分裂受到抑制；当压力解除后，微管蛋白质重新聚集，纺锤丝接着形成，星光及纺锤体重新再现，分裂重新启动。静水压休克还使染色体发生了不同程度的凝缩，导致染色体在后来发育过程中呈现不同的变化。
CB 法
使用最早、最广泛、诱导效果最突出
对胚胎毒害强，致癌，美国已经禁止使用
6-DMAP 法
低毒、高效（与CB 媲美，可达90％）、孵化率高（70％以上）、处理后无需洗卵
温度休克法
操作简单、成本低廉、对胚胎影响小，成活率高（90％以上）
诱导时机：在50％受精卵出现第一极体后施加处理，三倍体诱导效果最好。
多倍体产生机制
二、抑制第一极体
方法与抑制第二极体类似，只是起始处理时间不同。
三、生物方法
通过四倍体与二倍体杂交
受精后，理化因子刺激未排出二极体，与单倍体精核结合形成三倍体。
受精卵受到理化因子刺激，第一次卵裂受到抑制，产生四倍体。
36四倍体诱导方法
抑制极体释放（第一极体）；抑制第一次卵裂；细胞融合（合子－合子融合）；人工雌核发育
通过精子染色体失活，再同时阻止第一、二极体释放来实现。
37鉴定多倍体的方法
1. 核体积测量2. 染色体计数3.DNA 含量测定
37多倍体鱼类的生长与发育
1. 多倍体鱼类生活力
三倍体鱼类具良好的生活力，四倍体生活力差些。
2. 多倍体鱼类的性别
三倍体鱼类雌雄性比1：1，很少出现间性个体，不育。
四倍体鱼类（XXYY ，XXXX ）杂交产生XXXY ，显性Y 机制避免了不育间性体的产生。但大多数高等动物是不育的。
3. 多倍体鱼类性腺发育
同源多倍体中的同源染色体不只2条，多产生不完整的染色体组，造成部分不育。异源多倍体同源的染色体只有两条，产生正常染色体组配子，能育性较高。
38多倍体鱼类在养殖中的应用
1. 控制过度繁殖
2. 延长鱼类寿命 性成熟进行繁殖造成损失的鱼类。
3. 改善鱼肉品质 三倍体香鱼肉味道比二倍体好。
4. 三倍体杂种化 三倍体杂种具有杂种优势，并克服了种间杂种成活率低的难题，并有可能实现繁殖控制。
褐鳟♀×美洲红点鲑♂，鱼苗成活率平均为73.8%，二倍体杂种成活率仅为23.7%。
草鱼♀×鳙♂杂交，同时出现二倍体和三倍体杂种，二倍体杂种35.1%畸形，三倍体杂种仅5.1%畸形。
39湘云鲫鲤的优点：
1. 湘云鲫(鲤) 是通过生物方法培育的三倍体鱼, 其形成过程中没有任何外来的不安全因素加入, 在食用方面是安全的。
2. 湘云鲫(鲤) 具有生长速度快、不育、抗病力强、耐低氧、存活率高、易捕捞、口感好、在冬季温度较低的情况下仍然保持生长等优点, 适合于池塘养殖, 还适合网箱和稻田养殖。
3. 三倍体不育性保证它们在任何水域中都不会与其它鱼交配, 消除了它们对鱼类种质资源产生干扰作用的隐患。 鱼类精子入卵时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二极体。 雌、雄原核融合，形成正常二倍体。
第七章 克隆鱼
1所有有性繁殖的生物，都是从一个受精卵发育到完整的生物体。
2细胞分化:在个体发育中，细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程，称为细胞分化。
3细胞的发育潜能 由一个细胞可能分化发育出多少种细胞？这就是细胞的发育潜能。
大致有三种不同的发育潜能。
4全能性——具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞。例如：受精卵
例如，多功能造血干细胞可分化成红细胞、白细胞和血小板等
6单能性——只能分化成一种细胞的干细胞称单能干细胞 。例如，单能生血干细胞
7对于植物来说，分化成熟的植物细胞体，仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株。
对于动物来说：随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能。
全能性„„多能性„„单能性„„分化成熟的体细胞。
实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。分化成熟的动物细胞已失去全能性。不可能发育成为完整的动物个体。陆续出现一些探索动物细胞全能性丧失原因的实验。
以上实验得出的结论：囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，其细胞核仍具有全能性——可能发育成完整个体。细胞核保持着全套基因组。
8看来，关键在于细胞质。细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。后来实验证明，细胞质中的分化决定子，是 RNA 。在卵子形成过程中，卵母细胞中含有 2－5 万种 mRNA ，每种约 600个拷贝。这些 RNA 构成母体信息，决定受精卵的发育潜能。
8：在卵子中，母体信息以核糖核酸蛋白（RNP ）颗粒形式存在，其沉降系数比核糖体还大，称为信息体。
到 1980s 初，克隆实验已用小鼠取得成功。 囊胚细胞核＋去核受精卵
9那么，为什么1990s 的多利羊实验成功仍会引起这么大的震动？
从囊胚细胞核到分化成熟的体细胞核是一个大进步。 从实验小鼠到羊，也有所不同。最重要的是时机：1980s 初到1990s 末。
10实验成功的关键，血清饥饿（0.5％）
使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段。结合在基因（DNA ）上的调控蛋白脱落下来。
11重新编程 细胞重新编程指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能分化的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体。
12克隆它是指由一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞核移植两种，一般情况下，仅指细胞核移植技术， 其中又包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植技术。
13胚胎分割是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。
14胚胎切割的基本程序
1. 切割器具的准备： 体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为20~30微米。切割针目前有玻璃针和微刀两种。
2. 胚胎预处理： 胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。
3. 胚胎分割： 先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴（杜氏磷酸缓冲液）的培养皿中，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。
(1)桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放人另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。
(2)桑椹胚和囊胚的分割 对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法，操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。在进行囊胚切割时，要注意将内细胞团等分。
4. 分割胚的培养： 分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。 体内培养的中间受体一般选择绵羊、家兔等动物的输卵管，输卵管在胚胎移入后需要结扎以防胚胎丢失。琼脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影响胚胎的发育。
5. 分割胚胎的保存和移植： 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。
15胚胎细胞核移植又称胚胎克隆，它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术.
通常把提供细胞核的胚胎称核供体，接受细胞核的称受体。
由于哺乳动物的遗传性状主要由细胞核的遗传物质决定，因此由同一枚胚胎作核供体通过核移植获得的后代，基因型几乎一致，称之为克隆动物。
通过核移植得到的胚胎可作供体，再进行细胞核移植，称再克隆。
16胚胎克隆的操作程序
1. 卵母细胞的去核 细管吸除法和紫外线照射法两种. 前者是用微细玻璃管穿过透明带吸出第一极体和其下方的MII 期染色体，后者是用紫外线破坏染色体DNA 以达到去核目的。目前最常用的是吸除法。
2. 供体核的准备和移植 供体核来自早期胚胎. 把供体胚胎分散成单个卵裂球，每个卵裂球就是一个供体核。取得卵裂球的方法有两种，一种是用蛋白酶消化透明带，然后用微管把胚胎分散成单个卵裂球，此法主要用于家兔和绵羊的胚胎克隆；另一种方法是用尖锐的吸管穿过透明带吸出胚胎中的卵裂球，这种方法主要用于猪和牛的胚胎克隆。准备好卵裂球后，用移植微管吸取一个卵裂球，借助显微操作仪把卵裂球放入一个去核卵子的卵黄周隙中，即完成移植过程。
3. 卵裂球与卵子的融合 融合是运用一定方法将卵裂球与去核卵子融为一体，形成单细胞结构。融合方法目前用电融合法。电融合是将操作后的卵母细胞和卵裂球复合体放入电解质溶液中，在一定强度的电脉冲作用下，使卵裂球与卵子相互融合。
4. 卵子的激活 在正常受精过程中，精子穿过透明带触及卵黄膜时，引起卵子内钙离子浓度升高，卵子细胞周期恢复，启动胚胎发育，这一现象称激活。在胚胎克隆过程中，通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞，造成卵母细胞内外膜结构出现瞬时通道，胞质内的钙离子进入受体核区，激活细胞核，恢复细胞周期，启动胚胎发育.
5. 克隆胚胎的培养 克隆胚胎可在体外作短时间培养后，移植到受体内，也可以在中间受体或体外培养到高级阶段再进行冷冻保存或胚胎移
植。
17体细胞核移植技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建新合子的生物技术。18它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速家畜品种改良或生产转基因动物。
19体细胞克隆技术的关键环节
体细胞克隆的主要技术程序与胚胎细胞克隆基本相同，主要差别在供体细胞的选择。体细胞克隆的核供体是体外培养传代的体细胞，体细胞需经过血清饥饿，即细胞培养液中血清浓度由10%降为0.5%，继续培养5d 左右，使细胞处于休止的G0期，再移植到去核卵母细胞的卵黄周隙中，经电融合和激活后获得克隆胚胎，移植到受体后获得克隆后代。
20人体发生过程：
受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天
精子+卵子„„合子„„卵裂球„„桑椹胚 „„囊胚
滋养层 胎盘及胎儿附属结构
囊胚 内胚层 消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。
内细胞群 中胚层 结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统
外胚层 体表结构；神经系统
21干细胞即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。
因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
22干细胞的主要特征：
1. 形态特征和生化特征
形态特征—圆形或椭圆形，核质比大；
生化特征—较高的端粒酶活性。
2. 增殖特征
增殖的缓慢性
增殖的自稳性（区别与肿瘤细胞的本质特征）
23干细胞的分类
按分化潜能：：全能干细胞；多能干细胞；单能干细胞
按发育状态：：胚胎干细胞；成体干细胞
24全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ES 细胞）
25多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。
27胚胎干细胞：ES 细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES 细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES 细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。
28成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 29胚胎干细胞的性质
1衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 2永生化(immortal)； 3能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；
4有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 5能参与胎儿所有组织的发育过程；
30胚胎干细胞的形态和生化特征
形态特征：体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，无明显的界限，形似鸟巢
生化特征：具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；表达SSEA-3 (阶段特异性胚胎抗原stage specific embryonic antigen, SSEA) 、SSEA-4、TRA-1-60（肿瘤识别抗原）等；表达OCT-4蛋白；无X 染色体失活。
31胚胎干细胞的分离
酶消化后培养；免疫方法去除滋养层细胞；流式细胞仪分离法
32人类干细胞的来源
1成人细胞或脐血(骨髓和血)/胎儿组织(专能/多能) 。 2人工流产后的人类胎儿生殖组织(全能) 。3通过体外授精产生的人类胚胎 (全能) 。 33胚胎干细胞系的建立过程
分离囊胚的内细胞群
ES 细胞非分化 ------→胚胎干细胞的鉴定------→定向诱导分化-------→成体干细胞 能细胞 34胚胎干细胞的培养
培养条件：
（1）特殊的培养液：用DMEM 培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。
（2）以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞(防止干细胞分化）。
(3) 必须加入LIF （白细胞抑制因子），抑制细胞分化。
35干细胞诱导分化的常用方法
（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF 、bFGF 、DMSO 和RA 等（2）将ES 细胞与特定的细胞共培养
（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES 细胞内
36胚胎干细胞具有以下特点：
(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色
(4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81
(5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞
37成体干细胞具有很强的分化能力 横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。
38造血干细胞
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。
造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。
与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA 配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。
39造血干细胞的移植
1. 移植前处理
超大剂量的放疗、化疗尽量消灭肿瘤细胞，同时抑制患者的免疫系统，使供体者的造血干细胞可以顺利植入。
2. 采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与受体进行HLA 配型；
3. 将造血干细胞输入到受体者体内，造血干细胞会自动定居到脊髓。
40研究方案和技术路线治疗性克隆技术路线
第八章 基因工程及其在海洋生物中的应用
1基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA ），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2基因工程诞生的理论基础
1、DNA 是遗传物质2、DNA 的双螺旋结构和半保留复制3、中心法则和遗传密码子
4、不同基因具有相同的物质基础5、基因是可以切割的6、基因是可以转移和重组的
7、遗传密码是通用的 8、基因可以通过复制把遗传信息传给下一代
3基因工程诞生的技术突破
1、琼脂糖凝胶电泳：1960年发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA 分离开来
2、DNA 连接酶：1967年三个实验室几乎同时发现了DNA 连接酶。
3、限制性内切酶：1970年H.O.Smith 分离出第一种限制性内切酶.
4、载体：1972年前后使用小分子量的细菌质粒和λ噬菌体做载体，在细菌细胞里大量扩增。
5、感受态体系：1970年M.Mandel 和A.Higa 发现经氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体的DNA 。
6、DNA 测序技术：1975年F.Sanger 、A.Maxam 和W.Gibert 发明了DNA 快速测序技术
4基因工程主要操作内容
1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化和PCR 扩增等步骤，分理处带有目的基因的DNA 片段。（切）
2、重组体的制备：将目的基因的DNA 片段插入到能自我复制并带有选择性标记的（抗菌素的抗性）载体分子上，形成DNA 重组分子。（接）
3、重组体的转化：经过重组体（载体）载入适当的受体细胞中。（转）
4、扩增DNA 重组分子：短时间培养转化细胞，以扩增DNA 分子或使其整合到受体细胞的DNA 分子中。（增）
5、筛选的转化细胞：获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。（检）
5基因工程是指重组DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
6基因工程技术
上游技术：重组子的构建；工程菌的构建及高效表达
下游技术：工程菌大规模发酵最佳参数的确定；新型生物反应器的研制；高效分离介质及装置的开发；分离纯化的优化控制
7载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，能在宿主细胞中进行自我复制和表达。
（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点
（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高
目前最常用的载体包括细菌质粒、l 噬菌体、cosmid 质粒等。
8愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA 体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA 技术的三大基本元件。
9受体细胞和重组基因的导入（转化或转染）
将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：
1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；
4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。
指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。
指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA 的过程。 12转染 指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。
（transgenic animal）：就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 14转入基因（transgene ）：导入的基因称为转入基因。
（transgenic technology或transgenesis ）：整个转基因过程。
17目前转基因动物技术已日趋成熟，并广泛应用于医学和药学领域，其主要应用在以下几个方面：
（1）作为人类疾病的病理模型用于遗传病等疾病的发病机理研究；
（2）研究外源基因在整体动物中的表达调控规律；
（3）作为药理学研究的动物模型用于寻找新的药物作用靶点和新药筛选试验；
（4）利用转基因大动物如牛、羊、猪等的乳腺等组织作为“生物反应器”生产极具药用价值的稀有生物活性蛋白质。
第二节 转基因鼠的研究方法
18就转基因技术而言，要将DAN 转入鼠的基因组主要可通过三种方法来实现：
利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中；
利用显微注射法将DNA 直接注射入受精卵的精前核中；
将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎中。
一、反转录病毒法
逆转录病毒侵染法是最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA 分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。
逆转录病毒感染法特点
优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。
缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA 所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA （≦10kb ），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。
二、DNA 显微注射法
此方法是目前培养转基因鼠的首选方法，操作步骤如下：
首先，向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48小时后再注射人的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵，增加用于微注射接种DNA 的受精卵数量。经过处理的雌鼠一次可以产生大约35个卵细胞，而正常雌鼠一次只能产生5～10个卵细胞。然后，在这些雌鼠进行交配后把它们杀死，小心从输卵管中取出受精卵。随后将外源基因注射进受精卵中。
微注射的转入基因通常为删除了原核载体序列的线性DNA 。在哺乳动物中，精子进入卵细胞后的一小时内，精前核（male pronucleus）和卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完成减数分裂，成为卵前核（female pronucleus）时，核融合才进行，这又称为核配（karyogamy ）。DNA 微注射要在精前核时期注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在显微镜下找到处在精前核状态下的受精卵。并对受精卵进行取向和固定，然后进行DNA 微注射。顺利的话，一天可以注射几百个精前核。
注射完成之后，将25～40个受精卵用显微外科手术移植到假孕雌鼠的子宫内，制造雌鼠假孕可以让它与切除了输精管的不育雄鼠交配，因为雄鼠在交配时缺乏精子，所以雌鼠的卵细胞无法受精。将受精卵移入代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注射的受精卵生长发育为幼鼠，由代孕母鼠产下。
19显微注射法建立转基因鼠的一级实验程序
克隆DNA 供体母鼠
酶解、分离、纯化、定量 注射激素（PMS ，HCG ）与雄鼠交配
目的基因DNA 片段 鼠受精卵
显微注射（卵原核中）
注射DNA 的受精卵
输卵管移卵
假孕母鼠
表型分析 胎鼠组织或幼鼠尾巴 取出鼠胚胎或待娩幼鼠
制备DNA 传代转基因鼠
外源基因的整合检测
确定转基因鼠
20显微注射法的优缺点：
优点：a 、转移率较高、整合效率达20%；b 、外源基因长度可达数百Kb ；c 、可得纯系动物；d 、周期相对较短。
缺点：a 、设备昂贵、操作复杂；b 、随机整合、首尾相连的多拷贝；c 、转基因效率较低，约0.5%-3%;
d 、常造成插入位点附近宿主DNA 大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。
21 提高整合效率的手段：
a 、注射位置：核内注射、多为雄前核内注射；
b 、DNA 浓度：1-2ng/ul，DNA 拷贝数200-600分子/nl；
c 、缓冲液选择：MgCl2 1mmol/L EDTA0.1-0.3mmol/L
22胚胎干细胞法
ES 是从囊胚开始发育的二倍体细胞，ES 法是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA 定向整合到内源基因组中表达。将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。一般程序如下：
23胚胎干细胞法建立转基因鼠的一级实验程序
获得功能基因„„构建基因打靶载体„„转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系„„制备嵌合体„„筛选进入生殖系小鼠„„转基因小鼠（F1）表型分析„„选择单系同胞交配产生（F2）代„„筛选纯合子的转基因小鼠
1、胚胎干细胞的获得
首先，分离胚泡的内层细胞团(inner cell mass)进行培养。ES 细胞在无饲养层的平板中培养时会持续分化为肌细胞、神经细胞等多种功能细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF ）的饲养层上生长时，才能保持其未分化状态，保持ES 细胞的潜在分化能力。
2、外源基因导入
通常利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导入ES 细胞。这样，将有功能的转入基因整合到ES 细胞基因组内的某一非
必需基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物。这种方法避免了在DNA 微注射法中存在的基因随机整合的问题。
3、正确整合细胞的筛选
人们把胚胎干细胞方法中使用的DNA 载体设计成能够整合到染色体上特定位置的结构。用这种DNA 载体转染培养的干细胞后，得到的细胞中有的是DNA 整合到了错误位置上，有的是整合到正确位置上，还有大部分ES 细胞则根本不发生整合。于是人们通常采用一种叫做正—负选择的策略来富集整合正确的ES 细胞。简单地说，就是先用正选择方法挑选所有整合了DNA 的ES 细胞，然后再用负选择方法淘汰整合错误的ES 细胞。
4、转基因鼠的产生和培养
正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，这样产生的子代其部分生殖系细胞就是由转基因的ES 细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠，即转入基因可以和正常基因一样分离。
在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES 细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES 细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。
只是建立ES 细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES 细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES 细胞株。 胚胎干细胞法必需先获得嵌合体后代才能得到转基因动物，历经至少两代，杂交选育工作繁重，这对大动物如羊、牛等尤其不便，而且后代过度纯合可能导致胚胎早期死亡、畸形或者后代不育等。
如果结合核移植技术，将携带有外源基因的ES 细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中，就能直接获得转基因动物，既节约了时间还能避开近交不育等纯种劣势。
第三节 转基因鱼
24海洋动物一般为体外受精，对发育条件要求不高，而且易于培养和观察，再加上一次可获得大量具有相同遗传背景的卵子，卵子相对较大，十分有利于转基因动物研究工作的开展。
目前已在开展的转基因鱼金鱼、鲤鱼、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、青鳉、斑马鱼、鲇鱼、鲂鱼、泥鳅和大马哈鱼等。
用于转移的外源基因有：人生长激素基因、红鳟生长激素基因、小鼠生长激素基因、抗冻蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、抗潮霉素基因、抗新霉素基因、氯霉素转乙酰基酶基因、鸡-δ晶体蛋白基因、卵黄蛋白酶原基因、荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因等；
使用的启动子有：小鼠金属硫蛋白基因启动子、红鳟金属硫蛋白基因启动子、猿猴病毒40（SV40）基因启动子、劳氏肉瘤病毒（RSV ）基因启动子、抗冻蛋白基因启动子和人细胞肥大病毒（CMV ）启动子等。 全基因鱼：将鱼的启动子和鱼类本身的基因，例如鱼的生长激素基因拼接起来，构成重组体。用全鱼基因进行基因转移，可望减少由于异源序列间的不能识别和不可逆修饰导致的外源基因“沉默”与插入失活的现象的发生，从而提高外源基因的表达水平。
25转基因技术在水产育苗中的作用
转基因技术现已广泛应用于鱼类育种上。以往为了向鱼类导入和固定有用的外源基因，一直采用杂交技术，但这种技术用来固定目的基因需要较长的时间，且时常发生有害基因的积累，给表现型带来不良影响；还有的杂交亲本具有不亲和性，其遗传性状难以预测。与此相比，在目的基因的蛋白质被确定的情况下，如果把目的基因单个分离，改变后转入到个体中去，就可能使其遗传特征在短期内转给个体或表达增强。为了进一步使外源基因传给下一代，通过把这些个体有计划的进行交配的方法，可在短期内确定具有目的基因的体系。
27鱼类转基因研究的目的
培育生长快的“超级鱼”；增强鱼抗逆行，包括抗冻、抗病、耐低溶氧等；
基础生物学研究，主要研究基因表达调控以及转基因和生态平衡的关系等。
28鱼类基因转移的方法
1. 显微注射法
显微注射方法是目前广泛使用、效果较好的一种方法。鱼卵受精后，用胰蛋白酶消化或机械方法去除卵壳，得到裸卵。在解剖镜下，将玻璃微针中的外源DNA 溶液直接注入受精卵动物极中，每卵注射1×10-12m3～2×10-12m3，约含1×106外源基因拷贝。裸卵的显微注射和以后的胚胎发育在无菌赫氏液中进行。显微注射方法一般需要在裸卵中操作，注射过程对鱼卵产生一定的机械创伤，因此，该方法适用于卵壳较软、易于去除，并对机械创伤具一定承受能力的鱼类。
其主要程序如下：
(1)人工催情，分别收集鱼的卵子和精液，体外人工受精；
(2)受精后3～5min ，用0．25％的胰蛋白酶消耗以去除卵壳，将裸卵移入盛有Holtfreter 氏培养液的平面皿中；
(3)将溶于ST(88mMNaCl、10mMTris —HCl ，pH7.5) 溶液中的外源基因装人玻璃微针，在第一次卵裂前实施外源基因的显微注射手术。每卵注射1—2nL 的DNA 溶液，约含1×106拷贝的外源基因；
(4)显微注射后，受体卵在Holffreter 氏溶液中培养发育。胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释；发育至心跳期后，将
胚胎转移到暴气的冷开水中直至形成鱼苗。在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去除死胚胎。
2. 电脉冲法
电脉冲进行鱼类受精卵基因转移的前两步与显微注射法相同。不同的是将胰酶消化后的裸卵与外源DNA 溶液一同放入一特制的电脉冲处理槽中，然后施加一定强度的电脉冲。外源DN 在电脉冲处理下进入受精卵。这一方法的优点是操作比较简单，可同时处理大量的受精卵。缺点是导入无定向、效率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件等。
外源基因在电脉冲处理条件下进入受精卵的机制尚不十分清楚。在已成功的鱼类电脉冲基因转移报道中，使用的电压都较低(几百伏) 。有人认为，在这样的电压下，不足以使受精卵膜发生变态或产生小孔。因此，外源基因的进入机制也就不同于培养细胞，推测是在鱼类受精膜上天然存在一些小孔，在低电压下，外源基因就通过这些小孔进入受精卵。
3. 精子携带法
精子携带方法是一种相对温和的基因转移方法，转移过程对卵子不产生机械创伤。
精子在等渗液中先与外源基因保温，可将外源DNA 片段带入精子细胞内，再与卵子受精，可将外源DNA 片段带入受精卵内。该方法简单、方便，依靠生理作用受精，对原核损害较小。此法已在鲤鱼、泥鳅中试验成功，目前已有6种鱼的成功报道。其外源基因的处理方法虽各有不同，但都得到分子杂交或PCR 检测的阳性结果，阳性率在5％～38％。从总的实验结果来看，精子携带基因转移尚存在转基因阳性率低、转移率不稳定现象。此外，精子携带外源基因的机制尚未明确，推测与精子表面吸附或精子细胞摄取有关。
4. 基因枪注射法
基因枪注射法是通过把吸附DNA 的金属微粒高速打入细胞内，使基因导入细胞内的方法。有人在泥鳅、斑马鱼、鲑鱼的3日胚上应用此法，结果70％的个体生存，一部分个体导入了外源基因。此法不容易进行，但有短期可处理多个个体的优点，只是现在的报道太少，有待今后进一步的研究。
5. 逆转录病毒感染法
此类病毒是RNA 病毒的一种，进入宿主后从RNA 逆转录成DNA ，并结合到宿主细胞的染色体上，这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。如果把目的基因组合到病毒染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导人外源基因。但转基因因病毒有严格的宿主特异性，而且鱼类转基因病毒的分析非常落后，对于鱼类此法暂不太适用。
6. 组织注射法
有报道外源基因向体组织直接注射时，周围细胞把外源基因纳入，并且发现了那种外源基因。有人把CA T(链霉素转移酶基因) 注射到一些鱼的体侧肌肉上，从肌肉匀浆中检测出CAT 活性”。另一方面，把含有合成黑色素的互补DAN 质粒注射到一些鱼的体侧肌肉上，使周围体表合成黑色素，体表黑化。这种方法能非常容易地把外源基因导入细胞内，所以对检测外源基因启动子非常有效。
7. 卵母细胞的基因转移
选取、收集、准备发育到一定时期的卵母细胞，显微镜下检查胚泡，若卵可供注射，操纵注射管，扎进胚泡进行显微注射，即将外源基因准确地注入卵母细胞核中，离体培养卵细胞至成熟卵，然后与正常精于受精，使受精卵整合外源基因，发育成转基因鱼。
8. 基因打靶法
20世纪90年代出现了新的外源基因导入技术，即基因剔除(gene knock out)和基因楔入(gene knock in)技术。基因剔除是基因打靶的(genetargeting)一种方法，类似于同源重组技术，指外源DNA 与受体细胞基因组合，这是一种先进的传染技术，克服了其它传染技术无法消除的盲目性和偶然性，具有整合位点确定、精确、转移基因频率较高等优势。基因楔入又称基因置转技术(gene replace•menttechnique) ，使双链的断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列之外，转基因的结果是外源DNA 取代内源靶序列。
29转基因鱼存在的问题
1. 外源基因的分离、定点整合和表达
在现有的转基因鱼中，供体基因基本上都是来自哺乳类。根据生物本身的特性，大分子尤其是蛋白质分子在种属上均具有特异性。因此，在转基因研究中应尽量考虑供体和受体鱼之间的亲缘关系。加强主要养殖鱼类抗逆、抗病基因的分离工作。外源基因导入受精卵后，其整合率与基因操作技术有关，而整合率高低决定外源基因能否稳定遗传。此外，外源基因能否在受体细胞中高效表达，启动子和增强子起很大的作用，特定基因的启动子其功能具有组织特异性，增强子具有种的特异性。如果能从鱼类的基因组中分离出合适的启动子，则可能会获得更有效的表达。
2. 显微注射法
在鱼类基因转移中比其它方法导入的外源基因整合率要高，但工作量非常大，对于季节性产卵的鱼类，注射鱼卵数有限，且很多胚胎夭折，在存活的鱼苗中，相当一部分不能发生整合，为后续的筛选带来诸多不便。电脉冲法、精子携带法等高效转基因方法，整合率又非常低，更待进一步完善。检测外源摹因整合率一般均使用斑点杂交和Southern 印迹法。这种方法需要很贵重的生物药品和酶类，且使用放射性同位素标记，代价高，耗时长，且有碍人体健康。如能凭借鱼苗早期 阶段的形态、花色等标记分出转基因鱼，及早淘汰非转基因鱼，将是转基因鱼研究的得力方法。
3. 环境问题
转基因鱼进人大自然，对生态平衡将会造成不同程度的影响。许多科学家认为，转基因鱼的表型可能有3个方面改变，即生理节律性、对环境忍受力和行为。这些表型的改变必定破坏现有的良性生态平衡。此外，转基因鱼使用的启动子多为mMT ，该启动子在许多运动组织中均诱发重金属离子的积累，人若长期食用这种转基因鱼，便会造成重金属中毒，这也必须予以重视。
4. 转基因鱼筛选及品系建立
转基因鱼研究的目的是要获得经济价值高的转基因鱼品系供生产应用。转基因鱼经过DNA 水平、蛋白质水平以及宏观生长对比和生物学试验观察确定后，需要有一个快速建立优良品系的方法，通常所用的是单性发育方法。理论上，经过二代单性发育，优良的遗传性状即能固定下来，形成新品系。但实际工作并非如此简单，因为外源基因在受体鱼生殖细胞传递中，受到化学修饰，封闭基因的表达，及外源基因进入受体细胞后的甲基化问题等，都将影响转基因鱼品系的建立。
30转基因鱼应用潜力
1. 快速育种
2. 改良养殖性能
新加坡国立大学生物系，Gong Zhiyuan副教授研究转基因斑马鱼, 作为污染测试常规测试的替代物。
3. 生产医药生物制品
第三章
1细胞培养：所谓细胞培养是指将有机体内的某一组织，如动物的肝、肾或肌肉等取出，分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和分裂的技术。
2细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。)
3组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长) 4器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)
5原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在培养条件下传 １ 至 １０ 代 ）。 6传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传 ４０ 至 ５０ 代的细胞 ）。
7细胞株（cell strain ）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就要出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过危机而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40-50代次。并且保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。此类细胞成为细胞株。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell strain) 。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。
8细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。当细胞株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。
9原代培养细胞的生命归宿
●原代培养期
●传代期
●衰退期
10培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长, 见于各种实体瘤细胞;
悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面, 见于各种造血系统肿瘤细胞。
11贴附生长细胞的生长过程
游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。
潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂， 机制：接触抑制、密度依赖性。
12血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。
24细胞传代方法
1. 悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l ／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2.半悬浮生长细胞传代
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3.贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
25贴壁生长细胞传代方法
1 吸光培养瓶中的培养液；
2 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10 min（显微镜下动态监测）；
3 吸去胰蛋白酶液，加入新鲜培养液；
4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；
5 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内；
6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内；
7 将后者放入培养箱中培养。
28细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 29冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
31低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO （二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
32细胞冻存方法
1预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO
2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
3 加入1ml 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
4 年后，存活率可达80％一90％。DMSO 液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。
33细胞复苏方法
（l ）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
34细胞分离方法
非酶消化法:1.直接分离法（机械法和EDTA 螯合法）2. 组织块培养法
酶消化法:1.胰酶消化（条件较难掌握）2. 胶原酶消化（两步灌流法）3. Dispase （中性蛋白酶）
1. 胰蛋白酶 (Trypsin)
●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。
●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg 组织加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
●通过无菌不锈钢丝网（100～200mm ）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶 (Collagenase)
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hanks' 平衡液（HBSS ）清洗组织碎片几次。
●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS 中）。
●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
●通过离心在HBSS 中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3.Dispase
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
●加入Dispase （0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
●在37℃孵育20分钟到几个小时。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase 。
●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
第五章 海洋动物的细胞操作
1细胞操作又叫细胞工程是指利用细胞融合和显微操作等方法对生物体的构成单位——包括体细胞和生殖细胞直接用手操作，创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。细胞操作和染色体操作以及基因操作关系密切，所以有时将它们统称为细胞操作。
2常用技术： 动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植
单克隆抗体的制备
多莉羊的培育过程
3 细胞遗传操作常用方法
一、抑制细胞分裂 二、细胞融合 三、染色体失活的方法 四、染色体的观察及倍性分析
五、体细胞及配子的制备 六、卵和早期胚胎细胞操作的前处理
4细胞遗传操作常用方法
5抑制细胞分裂
1化学方法： 化学方法主要是利用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞的分裂过程，从而达到预期的目的。
常用的化学药品有：细胞松弛素B 、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等。
细胞松弛素B （CB ）：是一类真菌的代谢产物，抑制细胞分裂的机制是特异性地破坏微丝，使最终导致细胞分离的由微丝构成的“收缩环”解体，抑制细胞分裂。有效的使用浓度是0.5～1.0 mg/dm3，一般溶解在0.1％的二甲基亚砜中使用。
二甲氨基嘌呤（6-DMAP ）：通过对磷酸化激酶的抑制，抑制一系列有磷酸激酶参与的生化反应和细胞功能，如抑制极体的形成和释放等，有效浓度为200～400 μmol/dm3。
咖啡因：其作用效果在于提高细胞内的Ca2+浓度，而构成细胞分裂过程中的纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感，在微管自装配中Ca2+起作用， Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止分裂。使用浓度为5～15mmol/dm3。
dm3:立方分米
2 物理方法：物理方法是在细胞分裂周期中施加物理处理影响和干预细胞的正常分裂，达到预期目的。
常用的方法有温度休克法和静水压等。
温度休克法：其机制是引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤丝所需的A TP 的供应途径受阻，使已完成染色体加倍的细胞不能分裂。常用温度的确定根据应用种类的不同而有所差异，一般是在该物种生存温度范围的上下限附近。
水静压：利用水静压设备（液压机等）产生的压力施加于处理对象。其机制主要是抑制纺锤体的微丝和微管的形成，阻止染色体的移动，从而抑制细胞分裂。常用的压力范围是200～500 kg/cm2。
6细胞融合
一般多用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（，PEG ）诱导两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ ），为RNA 病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG ）。PEG 用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 7染色体失活的方法
染色体失活是细胞遗传操作中常用的方法，如雌核发育就是通过精子的失活来实现的。
辐射处理：包括紫外线、γ射线、X 射线等。较为常用的是紫外线。紫外线主要作用于DNA ，经紫外线照射后，DNA 的氢键断裂，同一链上相邻的或两链上相对应的胸腺嘧啶之间形成二聚体，使DNA 局部变性，从而影响正常的复制和转录，使DNA 失活。操作过程中需要考虑的因素有：紫外线照射剂量、精子的浓度、精子铺设的厚度、照射的时间等。例如对于贝类而言，照射剂量一般在500～1000 uW/cm2,
精子铺设的厚度为1 mm，照射的时间为0～3mim ，另外需要注意DNA 的光复活作用，照射结束之后要严格避免光照。
化学处理：可用于精子灭活的化学物质有甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐、吖啶黄、噻嗪等。
29海洋动物性别控制的意义
提高群体生长率；
控制繁殖速度；
延长有效生长期；
提高水产品质量。
第三节 嵌合体动物的培育
30定义：所谓嵌合体，是将两个遗传上不同的细胞混合起来发育得到的生物体。
31嵌合体类别
按形成嵌合体的不同基因型组织的来源，嵌合体可分为同源嵌合体和异源嵌合体。
同源嵌合体 嵌合成分来自原属同一受精卵的嵌合体，大部分由染色体畸变和基因突变（自发或诱发）产生。可分为两种： 染色体嵌合体 和基因嵌合体 。
异源嵌合体 嵌合成分来自不同的受精卵所产生的嵌合体。和同源嵌合体一样，嵌合成分可以包含不同的染色体或不同的基因。
32鱼类嵌合体的培育方法
凝集法：除去卵膜后，在囊胚期用细玻璃针将胚盘的一部分刺伤，将其他胚盘的细胞块移入；
显微注射法：将一个胚盘分离出的分裂球，用毛细管注入另一胚盘的内部；
基因导入法：在二细胞期后，用毛细吸管给一部分分裂球或单细胞期的卵导入外源基因，即转基因动物。
33多倍体是指体细胞中含有三个或更多个染色体组的个体，并依所含染色体组数顺次称为三倍体（triploid ）、四倍体等。
34三倍体鱼类产生的机制：一般认为是由于卵子受精后不排出第二极体所造成的，即卵子没有经过减数分裂而称为二倍体卵，再与正常的单倍体精子受精便形成三倍体。
多倍体的经济形状：个体大、生长快、肉质好、寿命长、适应性强、高产等。
35三倍体诱导方法
一、抑制第二极体
静水压法：200～250 kg/cm3的压力，处理贝类受精卵10 min左右；
热休克法：30～38℃，处理时间10～20 min；
冷休克法：0～8℃，处理时间10～20 min；
CB 处理法：0.5～1.0 mgdm3，处理时间10～15 min；
6-DMAP 处理法：300～450 μmol/dm3，处理时间10～20 min；
咖啡因处理法：5～15 mmol/dm3，处理时间10～15 min；
咖啡因与热休克结合使用：能够提高诱导率，但胚胎孵化率较低。
1. 温度处理 冷休克、热休克
抑制第二次成熟分裂或第一次有丝分裂而产生三倍体或四倍体。温度处理的关键：确定处理开始时间、持续时间以及温度高低。
2. 静水压处理
当施加压力时，有丝分裂器中的纺锤体崩解，由蛋白质组成的微管解凝，分裂受到抑制；当压力解除后，微管蛋白质重新聚集，纺锤丝接着形成，星光及纺锤体重新再现，分裂重新启动。静水压休克还使染色体发生了不同程度的凝缩，导致染色体在后来发育过程中呈现不同的变化。
CB 法
使用最早、最广泛、诱导效果最突出
对胚胎毒害强，致癌，美国已经禁止使用
6-DMAP 法
低毒、高效（与CB 媲美，可达90％）、孵化率高（70％以上）、处理后无需洗卵
温度休克法
操作简单、成本低廉、对胚胎影响小，成活率高（90％以上）
诱导时机：在50％受精卵出现第一极体后施加处理，三倍体诱导效果最好。
多倍体产生机制
二、抑制第一极体
方法与抑制第二极体类似，只是起始处理时间不同。
三、生物方法
通过四倍体与二倍体杂交
受精后，理化因子刺激未排出二极体，与单倍体精核结合形成三倍体。
受精卵受到理化因子刺激，第一次卵裂受到抑制，产生四倍体。
36四倍体诱导方法
抑制极体释放（第一极体）；抑制第一次卵裂；细胞融合（合子－合子融合）；人工雌核发育
通过精子染色体失活，再同时阻止第一、二极体释放来实现。
37鉴定多倍体的方法
1. 核体积测量2. 染色体计数3.DNA 含量测定
37多倍体鱼类的生长与发育
1. 多倍体鱼类生活力
三倍体鱼类具良好的生活力，四倍体生活力差些。
2. 多倍体鱼类的性别
三倍体鱼类雌雄性比1：1，很少出现间性个体，不育。
四倍体鱼类（XXYY ，XXXX ）杂交产生XXXY ，显性Y 机制避免了不育间性体的产生。但大多数高等动物是不育的。
3. 多倍体鱼类性腺发育
同源多倍体中的同源染色体不只2条，多产生不完整的染色体组，造成部分不育。异源多倍体同源的染色体只有两条，产生正常染色体组配子，能育性较高。
38多倍体鱼类在养殖中的应用
1. 控制过度繁殖
2. 延长鱼类寿命 性成熟进行繁殖造成损失的鱼类。
3. 改善鱼肉品质 三倍体香鱼肉味道比二倍体好。
4. 三倍体杂种化 三倍体杂种具有杂种优势，并克服了种间杂种成活率低的难题，并有可能实现繁殖控制。
褐鳟♀×美洲红点鲑♂，鱼苗成活率平均为73.8%，二倍体杂种成活率仅为23.7%。
草鱼♀×鳙♂杂交，同时出现二倍体和三倍体杂种，二倍体杂种35.1%畸形，三倍体杂种仅5.1%畸形。
39湘云鲫鲤的优点：
1. 湘云鲫(鲤) 是通过生物方法培育的三倍体鱼, 其形成过程中没有任何外来的不安全因素加入, 在食用方面是安全的。
2. 湘云鲫(鲤) 具有生长速度快、不育、抗病力强、耐低氧、存活率高、易捕捞、口感好、在冬季温度较低的情况下仍然保持生长等优点, 适合于池塘养殖, 还适合网箱和稻田养殖。
3. 三倍体不育性保证它们在任何水域中都不会与其它鱼交配, 消除了它们对鱼类种质资源产生干扰作用的隐患。 鱼类精子入卵时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二极体。 雌、雄原核融合，形成正常二倍体。
第七章 克隆鱼
1所有有性繁殖的生物，都是从一个受精卵发育到完整的生物体。
2细胞分化:在个体发育中，细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程，称为细胞分化。
3细胞的发育潜能 由一个细胞可能分化发育出多少种细胞？这就是细胞的发育潜能。
大致有三种不同的发育潜能。
4全能性——具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞。例如：受精卵
例如，多功能造血干细胞可分化成红细胞、白细胞和血小板等
6单能性——只能分化成一种细胞的干细胞称单能干细胞 。例如，单能生血干细胞
7对于植物来说，分化成熟的植物细胞体，仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株。
对于动物来说：随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能。
全能性„„多能性„„单能性„„分化成熟的体细胞。
实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。分化成熟的动物细胞已失去全能性。不可能发育成为完整的动物个体。陆续出现一些探索动物细胞全能性丧失原因的实验。
以上实验得出的结论：囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，其细胞核仍具有全能性——可能发育成完整个体。细胞核保持着全套基因组。
8看来，关键在于细胞质。细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。后来实验证明，细胞质中的分化决定子，是 RNA 。在卵子形成过程中，卵母细胞中含有 2－5 万种 mRNA ，每种约 600个拷贝。这些 RNA 构成母体信息，决定受精卵的发育潜能。
8：在卵子中，母体信息以核糖核酸蛋白（RNP ）颗粒形式存在，其沉降系数比核糖体还大，称为信息体。
到 1980s 初，克隆实验已用小鼠取得成功。 囊胚细胞核＋去核受精卵
9那么，为什么1990s 的多利羊实验成功仍会引起这么大的震动？
从囊胚细胞核到分化成熟的体细胞核是一个大进步。 从实验小鼠到羊，也有所不同。最重要的是时机：1980s 初到1990s 末。
10实验成功的关键，血清饥饿（0.5％）
使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段。结合在基因（DNA ）上的调控蛋白脱落下来。
11重新编程 细胞重新编程指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能分化的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体。
12克隆它是指由一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞核移植两种，一般情况下，仅指细胞核移植技术， 其中又包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植技术。
13胚胎分割是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。
14胚胎切割的基本程序
1. 切割器具的准备： 体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为20~30微米。切割针目前有玻璃针和微刀两种。
2. 胚胎预处理： 胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。
3. 胚胎分割： 先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴（杜氏磷酸缓冲液）的培养皿中，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。
(1)桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放人另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。
(2)桑椹胚和囊胚的分割 对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法，操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。在进行囊胚切割时，要注意将内细胞团等分。
4. 分割胚的培养： 分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。 体内培养的中间受体一般选择绵羊、家兔等动物的输卵管，输卵管在胚胎移入后需要结扎以防胚胎丢失。琼脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影响胚胎的发育。
5. 分割胚胎的保存和移植： 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。
15胚胎细胞核移植又称胚胎克隆，它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术.
通常把提供细胞核的胚胎称核供体，接受细胞核的称受体。
由于哺乳动物的遗传性状主要由细胞核的遗传物质决定，因此由同一枚胚胎作核供体通过核移植获得的后代，基因型几乎一致，称之为克隆动物。
通过核移植得到的胚胎可作供体，再进行细胞核移植，称再克隆。
16胚胎克隆的操作程序
1. 卵母细胞的去核 细管吸除法和紫外线照射法两种. 前者是用微细玻璃管穿过透明带吸出第一极体和其下方的MII 期染色体，后者是用紫外线破坏染色体DNA 以达到去核目的。目前最常用的是吸除法。
2. 供体核的准备和移植 供体核来自早期胚胎. 把供体胚胎分散成单个卵裂球，每个卵裂球就是一个供体核。取得卵裂球的方法有两种，一种是用蛋白酶消化透明带，然后用微管把胚胎分散成单个卵裂球，此法主要用于家兔和绵羊的胚胎克隆；另一种方法是用尖锐的吸管穿过透明带吸出胚胎中的卵裂球，这种方法主要用于猪和牛的胚胎克隆。准备好卵裂球后，用移植微管吸取一个卵裂球，借助显微操作仪把卵裂球放入一个去核卵子的卵黄周隙中，即完成移植过程。
3. 卵裂球与卵子的融合 融合是运用一定方法将卵裂球与去核卵子融为一体，形成单细胞结构。融合方法目前用电融合法。电融合是将操作后的卵母细胞和卵裂球复合体放入电解质溶液中，在一定强度的电脉冲作用下，使卵裂球与卵子相互融合。
4. 卵子的激活 在正常受精过程中，精子穿过透明带触及卵黄膜时，引起卵子内钙离子浓度升高，卵子细胞周期恢复，启动胚胎发育，这一现象称激活。在胚胎克隆过程中，通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞，造成卵母细胞内外膜结构出现瞬时通道，胞质内的钙离子进入受体核区，激活细胞核，恢复细胞周期，启动胚胎发育.
5. 克隆胚胎的培养 克隆胚胎可在体外作短时间培养后，移植到受体内，也可以在中间受体或体外培养到高级阶段再进行冷冻保存或胚胎移
植。
17体细胞核移植技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建新合子的生物技术。18它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速家畜品种改良或生产转基因动物。
19体细胞克隆技术的关键环节
体细胞克隆的主要技术程序与胚胎细胞克隆基本相同，主要差别在供体细胞的选择。体细胞克隆的核供体是体外培养传代的体细胞，体细胞需经过血清饥饿，即细胞培养液中血清浓度由10%降为0.5%，继续培养5d 左右，使细胞处于休止的G0期，再移植到去核卵母细胞的卵黄周隙中，经电融合和激活后获得克隆胚胎，移植到受体后获得克隆后代。
20人体发生过程：
受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天
精子+卵子„„合子„„卵裂球„„桑椹胚 „„囊胚
滋养层 胎盘及胎儿附属结构
囊胚 内胚层 消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。
内细胞群 中胚层 结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统
外胚层 体表结构；神经系统
21干细胞即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。
因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
22干细胞的主要特征：
1. 形态特征和生化特征
形态特征—圆形或椭圆形，核质比大；
生化特征—较高的端粒酶活性。
2. 增殖特征
增殖的缓慢性
增殖的自稳性（区别与肿瘤细胞的本质特征）
23干细胞的分类
按分化潜能：：全能干细胞；多能干细胞；单能干细胞
按发育状态：：胚胎干细胞；成体干细胞
24全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ES 细胞）
25多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。
27胚胎干细胞：ES 细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES 细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES 细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。
28成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 29胚胎干细胞的性质
1衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 2永生化(immortal)； 3能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；
4有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 5能参与胎儿所有组织的发育过程；
30胚胎干细胞的形态和生化特征
形态特征：体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，无明显的界限，形似鸟巢
生化特征：具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；表达SSEA-3 (阶段特异性胚胎抗原stage specific embryonic antigen, SSEA) 、SSEA-4、TRA-1-60（肿瘤识别抗原）等；表达OCT-4蛋白；无X 染色体失活。
31胚胎干细胞的分离
酶消化后培养；免疫方法去除滋养层细胞；流式细胞仪分离法
32人类干细胞的来源
1成人细胞或脐血(骨髓和血)/胎儿组织(专能/多能) 。 2人工流产后的人类胎儿生殖组织(全能) 。3通过体外授精产生的人类胚胎 (全能) 。 33胚胎干细胞系的建立过程
分离囊胚的内细胞群
ES 细胞非分化 ------→胚胎干细胞的鉴定------→定向诱导分化-------→成体干细胞 能细胞 34胚胎干细胞的培养
培养条件：
（1）特殊的培养液：用DMEM 培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。
（2）以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞(防止干细胞分化）。
(3) 必须加入LIF （白细胞抑制因子），抑制细胞分化。
35干细胞诱导分化的常用方法
（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF 、bFGF 、DMSO 和RA 等（2）将ES 细胞与特定的细胞共培养
（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES 细胞内
36胚胎干细胞具有以下特点：
(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色
(4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81
(5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞
37成体干细胞具有很强的分化能力 横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。
38造血干细胞
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。
造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。
与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA 配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。
39造血干细胞的移植
1. 移植前处理
超大剂量的放疗、化疗尽量消灭肿瘤细胞，同时抑制患者的免疫系统，使供体者的造血干细胞可以顺利植入。
2. 采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与受体进行HLA 配型；
3. 将造血干细胞输入到受体者体内，造血干细胞会自动定居到脊髓。
40研究方案和技术路线治疗性克隆技术路线
第八章 基因工程及其在海洋生物中的应用
1基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA ），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2基因工程诞生的理论基础
1、DNA 是遗传物质2、DNA 的双螺旋结构和半保留复制3、中心法则和遗传密码子
4、不同基因具有相同的物质基础5、基因是可以切割的6、基因是可以转移和重组的
7、遗传密码是通用的 8、基因可以通过复制把遗传信息传给下一代
3基因工程诞生的技术突破
1、琼脂糖凝胶电泳：1960年发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA 分离开来
2、DNA 连接酶：1967年三个实验室几乎同时发现了DNA 连接酶。
3、限制性内切酶：1970年H.O.Smith 分离出第一种限制性内切酶.
4、载体：1972年前后使用小分子量的细菌质粒和λ噬菌体做载体，在细菌细胞里大量扩增。
5、感受态体系：1970年M.Mandel 和A.Higa 发现经氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体的DNA 。
6、DNA 测序技术：1975年F.Sanger 、A.Maxam 和W.Gibert 发明了DNA 快速测序技术
4基因工程主要操作内容
1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化和PCR 扩增等步骤，分理处带有目的基因的DNA 片段。（切）
2、重组体的制备：将目的基因的DNA 片段插入到能自我复制并带有选择性标记的（抗菌素的抗性）载体分子上，形成DNA 重组分子。（接）
3、重组体的转化：经过重组体（载体）载入适当的受体细胞中。（转）
4、扩增DNA 重组分子：短时间培养转化细胞，以扩增DNA 分子或使其整合到受体细胞的DNA 分子中。（增）
5、筛选的转化细胞：获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。（检）
5基因工程是指重组DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
6基因工程技术
上游技术：重组子的构建；工程菌的构建及高效表达
下游技术：工程菌大规模发酵最佳参数的确定；新型生物反应器的研制；高效分离介质及装置的开发；分离纯化的优化控制
7载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，能在宿主细胞中进行自我复制和表达。
（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点
（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高
目前最常用的载体包括细菌质粒、l 噬菌体、cosmid 质粒等。
8愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA 体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA 技术的三大基本元件。
9受体细胞和重组基因的导入（转化或转染）
将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：
1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；
4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。
指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。
指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA 的过程。 12转染 指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。
（transgenic animal）：就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 14转入基因（transgene ）：导入的基因称为转入基因。
（transgenic technology或transgenesis ）：整个转基因过程。
17目前转基因动物技术已日趋成熟，并广泛应用于医学和药学领域，其主要应用在以下几个方面：
（1）作为人类疾病的病理模型用于遗传病等疾病的发病机理研究；
（2）研究外源基因在整体动物中的表达调控规律；
（3）作为药理学研究的动物模型用于寻找新的药物作用靶点和新药筛选试验；
（4）利用转基因大动物如牛、羊、猪等的乳腺等组织作为“生物反应器”生产极具药用价值的稀有生物活性蛋白质。
第二节 转基因鼠的研究方法
18就转基因技术而言，要将DAN 转入鼠的基因组主要可通过三种方法来实现：
利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中；
利用显微注射法将DNA 直接注射入受精卵的精前核中；
将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎中。
一、反转录病毒法
逆转录病毒侵染法是最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA 分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。
逆转录病毒感染法特点
优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。
缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA 所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA （≦10kb ），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。
二、DNA 显微注射法
此方法是目前培养转基因鼠的首选方法，操作步骤如下：
首先，向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48小时后再注射人的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵，增加用于微注射接种DNA 的受精卵数量。经过处理的雌鼠一次可以产生大约35个卵细胞，而正常雌鼠一次只能产生5～10个卵细胞。然后，在这些雌鼠进行交配后把它们杀死，小心从输卵管中取出受精卵。随后将外源基因注射进受精卵中。
微注射的转入基因通常为删除了原核载体序列的线性DNA 。在哺乳动物中，精子进入卵细胞后的一小时内，精前核（male pronucleus）和卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完成减数分裂，成为卵前核（female pronucleus）时，核融合才进行，这又称为核配（karyogamy ）。DNA 微注射要在精前核时期注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在显微镜下找到处在精前核状态下的受精卵。并对受精卵进行取向和固定，然后进行DNA 微注射。顺利的话，一天可以注射几百个精前核。
注射完成之后，将25～40个受精卵用显微外科手术移植到假孕雌鼠的子宫内，制造雌鼠假孕可以让它与切除了输精管的不育雄鼠交配，因为雄鼠在交配时缺乏精子，所以雌鼠的卵细胞无法受精。将受精卵移入代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注射的受精卵生长发育为幼鼠，由代孕母鼠产下。
19显微注射法建立转基因鼠的一级实验程序
克隆DNA 供体母鼠
酶解、分离、纯化、定量 注射激素（PMS ，HCG ）与雄鼠交配
目的基因DNA 片段 鼠受精卵
显微注射（卵原核中）
注射DNA 的受精卵
输卵管移卵
假孕母鼠
表型分析 胎鼠组织或幼鼠尾巴 取出鼠胚胎或待娩幼鼠
制备DNA 传代转基因鼠
外源基因的整合检测
确定转基因鼠
20显微注射法的优缺点：
优点：a 、转移率较高、整合效率达20%；b 、外源基因长度可达数百Kb ；c 、可得纯系动物；d 、周期相对较短。
缺点：a 、设备昂贵、操作复杂；b 、随机整合、首尾相连的多拷贝；c 、转基因效率较低，约0.5%-3%;
d 、常造成插入位点附近宿主DNA 大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。
21 提高整合效率的手段：
a 、注射位置：核内注射、多为雄前核内注射；
b 、DNA 浓度：1-2ng/ul，DNA 拷贝数200-600分子/nl；
c 、缓冲液选择：MgCl2 1mmol/L EDTA0.1-0.3mmol/L
22胚胎干细胞法
ES 是从囊胚开始发育的二倍体细胞，ES 法是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA 定向整合到内源基因组中表达。将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。一般程序如下：
23胚胎干细胞法建立转基因鼠的一级实验程序
获得功能基因„„构建基因打靶载体„„转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系„„制备嵌合体„„筛选进入生殖系小鼠„„转基因小鼠（F1）表型分析„„选择单系同胞交配产生（F2）代„„筛选纯合子的转基因小鼠
1、胚胎干细胞的获得
首先，分离胚泡的内层细胞团(inner cell mass)进行培养。ES 细胞在无饲养层的平板中培养时会持续分化为肌细胞、神经细胞等多种功能细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF ）的饲养层上生长时，才能保持其未分化状态，保持ES 细胞的潜在分化能力。
2、外源基因导入
通常利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导入ES 细胞。这样，将有功能的转入基因整合到ES 细胞基因组内的某一非
必需基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物。这种方法避免了在DNA 微注射法中存在的基因随机整合的问题。
3、正确整合细胞的筛选
人们把胚胎干细胞方法中使用的DNA 载体设计成能够整合到染色体上特定位置的结构。用这种DNA 载体转染培养的干细胞后，得到的细胞中有的是DNA 整合到了错误位置上，有的是整合到正确位置上，还有大部分ES 细胞则根本不发生整合。于是人们通常采用一种叫做正—负选择的策略来富集整合正确的ES 细胞。简单地说，就是先用正选择方法挑选所有整合了DNA 的ES 细胞，然后再用负选择方法淘汰整合错误的ES 细胞。
4、转基因鼠的产生和培养
正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，这样产生的子代其部分生殖系细胞就是由转基因的ES 细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠，即转入基因可以和正常基因一样分离。
在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES 细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES 细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。
只是建立ES 细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES 细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES 细胞株。 胚胎干细胞法必需先获得嵌合体后代才能得到转基因动物，历经至少两代，杂交选育工作繁重，这对大动物如羊、牛等尤其不便，而且后代过度纯合可能导致胚胎早期死亡、畸形或者后代不育等。
如果结合核移植技术，将携带有外源基因的ES 细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中，就能直接获得转基因动物，既节约了时间还能避开近交不育等纯种劣势。
第三节 转基因鱼
24海洋动物一般为体外受精，对发育条件要求不高，而且易于培养和观察，再加上一次可获得大量具有相同遗传背景的卵子，卵子相对较大，十分有利于转基因动物研究工作的开展。
目前已在开展的转基因鱼金鱼、鲤鱼、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、青鳉、斑马鱼、鲇鱼、鲂鱼、泥鳅和大马哈鱼等。
用于转移的外源基因有：人生长激素基因、红鳟生长激素基因、小鼠生长激素基因、抗冻蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、抗潮霉素基因、抗新霉素基因、氯霉素转乙酰基酶基因、鸡-δ晶体蛋白基因、卵黄蛋白酶原基因、荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因等；
使用的启动子有：小鼠金属硫蛋白基因启动子、红鳟金属硫蛋白基因启动子、猿猴病毒40（SV40）基因启动子、劳氏肉瘤病毒（RSV ）基因启动子、抗冻蛋白基因启动子和人细胞肥大病毒（CMV ）启动子等。 全基因鱼：将鱼的启动子和鱼类本身的基因，例如鱼的生长激素基因拼接起来，构成重组体。用全鱼基因进行基因转移，可望减少由于异源序列间的不能识别和不可逆修饰导致的外源基因“沉默”与插入失活的现象的发生，从而提高外源基因的表达水平。
25转基因技术在水产育苗中的作用
转基因技术现已广泛应用于鱼类育种上。以往为了向鱼类导入和固定有用的外源基因，一直采用杂交技术，但这种技术用来固定目的基因需要较长的时间，且时常发生有害基因的积累，给表现型带来不良影响；还有的杂交亲本具有不亲和性，其遗传性状难以预测。与此相比，在目的基因的蛋白质被确定的情况下，如果把目的基因单个分离，改变后转入到个体中去，就可能使其遗传特征在短期内转给个体或表达增强。为了进一步使外源基因传给下一代，通过把这些个体有计划的进行交配的方法，可在短期内确定具有目的基因的体系。
27鱼类转基因研究的目的
培育生长快的“超级鱼”；增强鱼抗逆行，包括抗冻、抗病、耐低溶氧等；
基础生物学研究，主要研究基因表达调控以及转基因和生态平衡的关系等。
28鱼类基因转移的方法
1. 显微注射法
显微注射方法是目前广泛使用、效果较好的一种方法。鱼卵受精后，用胰蛋白酶消化或机械方法去除卵壳，得到裸卵。在解剖镜下，将玻璃微针中的外源DNA 溶液直接注入受精卵动物极中，每卵注射1×10-12m3～2×10-12m3，约含1×106外源基因拷贝。裸卵的显微注射和以后的胚胎发育在无菌赫氏液中进行。显微注射方法一般需要在裸卵中操作，注射过程对鱼卵产生一定的机械创伤，因此，该方法适用于卵壳较软、易于去除，并对机械创伤具一定承受能力的鱼类。
其主要程序如下：
(1)人工催情，分别收集鱼的卵子和精液，体外人工受精；
(2)受精后3～5min ，用0．25％的胰蛋白酶消耗以去除卵壳，将裸卵移入盛有Holtfreter 氏培养液的平面皿中；
(3)将溶于ST(88mMNaCl、10mMTris —HCl ，pH7.5) 溶液中的外源基因装人玻璃微针，在第一次卵裂前实施外源基因的显微注射手术。每卵注射1—2nL 的DNA 溶液，约含1×106拷贝的外源基因；
(4)显微注射后，受体卵在Holffreter 氏溶液中培养发育。胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释；发育至心跳期后，将
胚胎转移到暴气的冷开水中直至形成鱼苗。在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去除死胚胎。
2. 电脉冲法
电脉冲进行鱼类受精卵基因转移的前两步与显微注射法相同。不同的是将胰酶消化后的裸卵与外源DNA 溶液一同放入一特制的电脉冲处理槽中，然后施加一定强度的电脉冲。外源DN 在电脉冲处理下进入受精卵。这一方法的优点是操作比较简单，可同时处理大量的受精卵。缺点是导入无定向、效率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件等。
外源基因在电脉冲处理条件下进入受精卵的机制尚不十分清楚。在已成功的鱼类电脉冲基因转移报道中，使用的电压都较低(几百伏) 。有人认为，在这样的电压下，不足以使受精卵膜发生变态或产生小孔。因此，外源基因的进入机制也就不同于培养细胞，推测是在鱼类受精膜上天然存在一些小孔，在低电压下，外源基因就通过这些小孔进入受精卵。
3. 精子携带法
精子携带方法是一种相对温和的基因转移方法，转移过程对卵子不产生机械创伤。
精子在等渗液中先与外源基因保温，可将外源DNA 片段带入精子细胞内，再与卵子受精，可将外源DNA 片段带入受精卵内。该方法简单、方便，依靠生理作用受精，对原核损害较小。此法已在鲤鱼、泥鳅中试验成功，目前已有6种鱼的成功报道。其外源基因的处理方法虽各有不同，但都得到分子杂交或PCR 检测的阳性结果，阳性率在5％～38％。从总的实验结果来看，精子携带基因转移尚存在转基因阳性率低、转移率不稳定现象。此外，精子携带外源基因的机制尚未明确，推测与精子表面吸附或精子细胞摄取有关。
4. 基因枪注射法
基因枪注射法是通过把吸附DNA 的金属微粒高速打入细胞内，使基因导入细胞内的方法。有人在泥鳅、斑马鱼、鲑鱼的3日胚上应用此法，结果70％的个体生存，一部分个体导入了外源基因。此法不容易进行，但有短期可处理多个个体的优点，只是现在的报道太少，有待今后进一步的研究。
5. 逆转录病毒感染法
此类病毒是RNA 病毒的一种，进入宿主后从RNA 逆转录成DNA ，并结合到宿主细胞的染色体上，这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。如果把目的基因组合到病毒染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导人外源基因。但转基因因病毒有严格的宿主特异性，而且鱼类转基因病毒的分析非常落后，对于鱼类此法暂不太适用。
6. 组织注射法
有报道外源基因向体组织直接注射时，周围细胞把外源基因纳入，并且发现了那种外源基因。有人把CA T(链霉素转移酶基因) 注射到一些鱼的体侧肌肉上，从肌肉匀浆中检测出CAT 活性”。另一方面，把含有合成黑色素的互补DAN 质粒注射到一些鱼的体侧肌肉上，使周围体表合成黑色素，体表黑化。这种方法能非常容易地把外源基因导入细胞内，所以对检测外源基因启动子非常有效。
7. 卵母细胞的基因转移
选取、收集、准备发育到一定时期的卵母细胞，显微镜下检查胚泡，若卵可供注射，操纵注射管，扎进胚泡进行显微注射，即将外源基因准确地注入卵母细胞核中，离体培养卵细胞至成熟卵，然后与正常精于受精，使受精卵整合外源基因，发育成转基因鱼。
8. 基因打靶法
20世纪90年代出现了新的外源基因导入技术，即基因剔除(gene knock out)和基因楔入(gene knock in)技术。基因剔除是基因打靶的(genetargeting)一种方法，类似于同源重组技术，指外源DNA 与受体细胞基因组合，这是一种先进的传染技术，克服了其它传染技术无法消除的盲目性和偶然性，具有整合位点确定、精确、转移基因频率较高等优势。基因楔入又称基因置转技术(gene replace•menttechnique) ，使双链的断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列之外，转基因的结果是外源DNA 取代内源靶序列。
29转基因鱼存在的问题
1. 外源基因的分离、定点整合和表达
在现有的转基因鱼中，供体基因基本上都是来自哺乳类。根据生物本身的特性，大分子尤其是蛋白质分子在种属上均具有特异性。因此，在转基因研究中应尽量考虑供体和受体鱼之间的亲缘关系。加强主要养殖鱼类抗逆、抗病基因的分离工作。外源基因导入受精卵后，其整合率与基因操作技术有关，而整合率高低决定外源基因能否稳定遗传。此外，外源基因能否在受体细胞中高效表达，启动子和增强子起很大的作用，特定基因的启动子其功能具有组织特异性，增强子具有种的特异性。如果能从鱼类的基因组中分离出合适的启动子，则可能会获得更有效的表达。
2. 显微注射法
在鱼类基因转移中比其它方法导入的外源基因整合率要高，但工作量非常大，对于季节性产卵的鱼类，注射鱼卵数有限，且很多胚胎夭折，在存活的鱼苗中，相当一部分不能发生整合，为后续的筛选带来诸多不便。电脉冲法、精子携带法等高效转基因方法，整合率又非常低，更待进一步完善。检测外源摹因整合率一般均使用斑点杂交和Southern 印迹法。这种方法需要很贵重的生物药品和酶类，且使用放射性同位素标记，代价高，耗时长，且有碍人体健康。如能凭借鱼苗早期 阶段的形态、花色等标记分出转基因鱼，及早淘汰非转基因鱼，将是转基因鱼研究的得力方法。
3. 环境问题
转基因鱼进人大自然，对生态平衡将会造成不同程度的影响。许多科学家认为，转基因鱼的表型可能有3个方面改变，即生理节律性、对环境忍受力和行为。这些表型的改变必定破坏现有的良性生态平衡。此外，转基因鱼使用的启动子多为mMT ，该启动子在许多运动组织中均诱发重金属离子的积累，人若长期食用这种转基因鱼，便会造成重金属中毒，这也必须予以重视。
4. 转基因鱼筛选及品系建立
转基因鱼研究的目的是要获得经济价值高的转基因鱼品系供生产应用。转基因鱼经过DNA 水平、蛋白质水平以及宏观生长对比和生物学试验观察确定后，需要有一个快速建立优良品系的方法，通常所用的是单性发育方法。理论上，经过二代单性发育，优良的遗传性状即能固定下来，形成新品系。但实际工作并非如此简单，因为外源基因在受体鱼生殖细胞传递中，受到化学修饰，封闭基因的表达，及外源基因进入受体细胞后的甲基化问题等，都将影响转基因鱼品系的建立。
30转基因鱼应用潜力
1. 快速育种
2. 改良养殖性能
新加坡国立大学生物系，Gong Zhiyuan副教授研究转基因斑马鱼, 作为污染测试常规测试的替代物。
3. 生产医药生物制品