尿激酶的制备与研究进展
摘要：尿激酶是纤溶酶原的主要激活物之一。近年来的研究工作发现, 尿激酶在临床上发挥了重要作用，现在已经大量应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。本文对尿激酶的结构、作用机制及其制备等做了简要介绍。
关键词：尿激酶 纤溶酶原 分子组成 制备
Preparation, Rsearch and Delopment of Urokinase
Abstract: Urokinase is one of the major activitor of plasminogen . Recent research found t- hat urokinase plays a very important role in a variety of other physiological and pathological proc- ess in recent research,including wound healing,tissue regeneration,cell migration,and especially i- ncluding cancer metastasis , angiogenesis and other physical and pathological process. The struct- ure of urokinase and its preparation are introducted in detail in this article. Keywords: urokinase plasminogen molecule structure preparation
1. 前言
尿激酶型纤溶酶原激活物（简称尿激酶：urokinase 简写UK ，) 最初是从新鲜男性尿中提取[1]，以后又在血浆、脑水、精液以及肾细胞、血管内皮细胞、单核细胞、纤维母细胞、某些肿瘤细胞的培养液中发现[2-3]。它是一种溶血栓药物，是纤溶系统的重要一员, 对防止血栓形成和保持血流通畅具有重要意义, 它可将不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原激活为具丝氨酸蛋白酶活性、能溶解纤维蛋白的纤溶酶。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。 2 尿激酶的临床意义
传统上，尿激酶的主要作用被认为是激活纤溶酶酶原，最终导致血栓的溶解。缺乏尿激酶的小鼠有自发形成血管栓塞的倾向，该小鼠在缺氧或内毒素刺激时也易于形成血栓。下调正常小鼠中尿激酶的表达量也导致了内毒素刺激的纤维沉积
4]
。这些与尿激酶的溶栓作用相符合。尿激酶在临床药理中被广泛地应用于急性在临床上，人体内的UK 水平与许多疾病有关。因此可以通过测定患者的UK
心肌梗死、肺栓塞和周边血管阻塞导管治疗中。
含量来判断患者的症状。测定血液中的UK ，因肝脏是UK 的主要清除场所，故严重肝病患者血液中UK 含量明显升高。例如，王力生等[5]测定13例失代偿性肝硬化、16例肝癌，14例慢活肝和15例急肝患者，血清UK 含量均明显高于正常对照组。Kircheimer 等测定28例肝肿瘤患者血浆中UK 也明显升高，但51例肝硬化患者血浆中UK 与正常对照组无明显差别。UK 可从一些肿瘤细胞产生，所以某些肿瘤患者血浆中UK 也可升高。除此之外，测定尿液中的UK ，因正常人尿UK 的分泌量相对稳定在一定程度上与性别、年龄、尿量等关系不大，24小时内波动不明显，其排泌与肾功能关系密切，可作为反映肾功能的一个指标[6]。Takada 等测定31例原发性肾炎和8例继发性肾炎患者，其中UK 含量均明显高于正常。 3 尿激酶的分子组成 3.1 尿激酶的分子量形式
尿激酶有多种分子量形式，主要有3.3×104和5.4×104两种，即低分子尿激酶(简写L-UK) 和高分子尿激酶(简写H-UK) 。据Nobuhara 等人报道，H-UK 和L-UK 的比活分别为157，400和246，700IU/mg蛋白。用对硝基苯一对肌基苯甲酸盐鉴定，它们的活性部分各占97%和88%。已有不少国家从尿中分离出高纯度的H-UK 和L-UK ，并对其分子组成、酶学性质等作了研究[7]。 3.2 H-UK和L-UK 的分子组成
现在人们己经搞清了H-UK 是由分子量约为34000和17600的两条链通过二硫键连接而成的，在重链上有一个活性部位，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸，它的N 末端氨基酸是赖氨酸和异亮氨酸。至于L-UK 的分子组成问题，目前看法尚不一致。Seberauo 等人认为L-UK 是N 末端为异亮氨酸的单链蛋白质。
但Nobuhara 等认为L-UK 与H-UK 一样，也有两条链。他们把H-UK 和L-UK 用1.5%二硫苏糖醇(dithiothrei-tol)在20℃处理18小时后，再进行SDS 凝胶电泳，发现降解的H-UK 出现了分子量为34000和27600的两个蛋白带; 降解的L-UK 也出现了H-UK 重链相同的34000带和一条分子量为1200-3400的带，所以L-UK 也是由两条链组成的[7]。 4 尿激酶的作用机制
尿激酶是特异性很强的蛋白水解酶，纤溶酶原是其唯一的天然蛋白质底物。在循环血中，主要形式的纤溶酶原的N 末端氨基酸是谷氨酸。
Viocand 等[8]人认为纤溶酶原被激活时，首先是在纤溶酶pm 的作用下，使X-Lys 肽键断裂，释放出一个N 末端为谷氨酸的小肽P ，同时形成中间产物Lys-Pg(N末端为赖氨酸的纤溶酶原) ，然后尿激酶再直接作用于Lys-Pg ，把Lys-Pg 转化为具有活性的Lys-Pm(N末端为赖氨酸的纤溶酶) 。另一途径是尿激酶使Glu-Pg(N末端为谷氨酸的纤溶酶原) 分子中的Arg-Val 肽键断裂，转化成Glu-Pm(N末端为谷氨酸的纤溶酶) ，后者在Pm 作用下，使分子中的X 一Lys 肽键断裂，释放出小分子肽P ，最后也转变为Lys-Pm 。
虽然H-UK 和L-UK 对纤溶酶原的作用机制相同，并且对合成底物N-乙酰甘氨酰-L-赖氨酸甲酯（AGLME ）有相同的动力学常数，但是它们对纤溶酶原的激活能力则不相同。由于H-UK 对纤溶酶原有较高的亲和力，在血液里的半衰期又较长，因而有效地激活纤溶酶原，所以在临床上，H-UK 比L-UK 更有效。 5 尿激酶粗品的制备[9]
5.1 收集男性尿。(PH小于7，必要时-加0.8%苯酚防腐，天热时应在4小时内制备完，纱布过滤。)
5.2 每100份尿中加入硅藻土1份，搅拌1小时，温度应低于10℃，防止变质和霉变。
5.3 装柱，用0.02%氨水洗涤，直到流出液变清。
5.4 用0.02%氨水和0.1M NaCl混合液洗脱，当流出液变浑时即收集尿激酶。 5.5 将第四步中的收集液经QAE-Sephadex 层析柱，用磷酸缓冲液洗脱。 5.6 收集第5步的洗脱液用乙酸调PH4.2，调整电导为16-17。
5.7 经过CM-C 柱，用IM 醋酸及醋酸钠缓冲液(PH4.2)洗涤，后改用0.1%氨水0.1M NaCl (PHll.6士2) 的混合液洗脱尿激酶。 5.8 用第7步洗脱液对蒸馏水透析24小时。
5.9 透析液离心沉淀，冻干产品为尿激酶粗品，活性在2万国际单位/mg以上。 以上只是制备方法中的一种，另外尚有树脂吸附法及硅胶吸附法制备粗品。精制方法与此类似。个体户制备的粗品每亿单位收购价在4000元左右，制备粗品的关键在于尿要新鲜。
6 尿激酶纯化方法实验研究[10] 6.1 主要材料
尿激酶粗品，甘氨酸(C·P) 、硫酸(A·R) 、氢氧化钠(A·R) 、盐酸(A·R) 、磷酸二氢钠(C·P) 、磷酸氢二钠，叠氮化钠(A·R) ，714树脂，CM-S 。 6.2 试验过程与技术条件 6.2.1 解析
（1）取尿激酶粗品200克(经测定，比活为325iu/mgP)，悬浮于8倍量的0.5M 甘氨酸缓冲液中，尿激酶浓度在4500iu/ml，维持低温，搅拌75分钟，静置45分钟，上清液经虹吸与底部沉淀分开。
（2）虹吸上清液后的沉淀加入1倍量的甘氨酸缓冲液，处理同上，取上清液。 （3）合并两次上清液，在低温下缓慢加入5NH 2SO 4调PH10.0士0.1(取样测定效价) 。
6.2.2 714树脂脱色
（1）按解析液效价每亿单位用1.4kg 树脂上柱，树脂用蒸馏水洗几个床体积后备用。
（2）将PH10.0的解析液上柱，流速控制在1.8~2.0ml/cm2分，收集流出液，上柱完毕后，柱用一个床体积的低温蒸馏水洗涤。 （3）合并柱流出液用H 2SO 4调PH 为10.0士0.1。 6.2.3 超滤处理
（1）将PH 为10.0的脱色液用超滤器超滤脱盐，超滤浓缩至原体积的六分之一左右。
（2）浓缩液中加入低温蒸馏水，稀释至电导4.8mV(10℃) 。 （3）再次浓缩至六分之一体积。
（4）二次浓缩液中加人低温0.18M 、PH6.8磷酸缓冲液及蒸馏水稀释至原体积，二者加入比例应使稀释液电导为4.8士0.lmV(10℃时) 。 （5）再用5NH 2SO 4调PH 为6.8士0.1。 （6）再次校正电导为4.8士0.lmV (10℃) 。 6.2.4 CM-S交换凝胶纯化(在低温下进行)
（1）CM-S 预处理：CM-S 用燕馏水浸泡后，分别用Na0H 和HCL 处理，然后用0.18M 、pH6.8磷酸缓冲液平衡，过滤; 平衡过的CM-S 悬浮于含0.08%NaN3，0.18M 、PH6.8磷缓冲液中，低温冷藏。 （2）CM-S 吸附
①经超滤PH6.8电导4.8mV 的尿激酸溶液，按5kg/亿单位加入经平衡的CM-S ，搅两小时，止起泡，静置一小时，虹吸去除上清液。
②吸附尿激酶的CM-S 上有机玻璃柱，防止柱内起泡，柱面平整.
（3）洗涤去除杂蛋白
①CM-S 上柱后用含0.3%NaN3，PH6.8、0.18M 磷酸缓冲液洗涤，流速为1.8~2.0而/cm2分左右，流至流出液效价低于100iu/ml，280nm 光吸收峰低于0.04E/ml。 ②改用1.8 M PH6.8磷酸缓冲液洗涤一个半床体积，流速不变，流出液280nm 吸收峰降至0.03以下。 （4）尿激酸洗脱
①洗涤完毕后用0.08M PH8.8磷酸氢二钠、0.95M 氛化钠缓冲液洗脱，流速0.4ml/ cm 2分，测定流出液效价及280nm 吸收峰，将有活力流出液合并，使混合液浓度在5000in/ml以上。
②混合液调PH6.0~7.0.抽取试样化验后，装于二升的塑料瓶内，干冰速冻，-22℃以下低温保存。
6.2.5 尿激酸(UK)效价和比活的测定 （1）测试原理 ①主要试剂与器材
恒温水浴锅、刻度闹钟、荧光灯、UK 效价坐标纸、牛凝血酶(T)、牛纤维蛋白溶酶原(PG)、牛纤维蛋白(FG)、UK 标准品、Barbiton-Na ，Tris ，Na 2EDTA ，NaCl ②试剂配制
T:牛凝血酶40BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加6.6mlBarbiton-Na 缓冲液。 PG:牛纤维蛋白溶酶原22BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加24mlTris 缓冲液。
PG 一T:取PG6.6nil 与配好的6.mlT 等体积混匀，放入50血三角烧瓶中，扎口备用。 FG:片纤维蛋白原，125BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加18mlBarbiton-Na 冲液。 ③标准UK 稀释
将标准品(l000iu/支) 用巴比妥溶液稀释成60in/ml。 ④绘制标准曲线
取5时试管4支，作记号并分别加入FGO.3ml →分别加入稀释标准UK 溶液0.4、0.3、0.2、0.lml →分别加巴比妥溶液0.6、0.7、0.3、0.9ml →分别加入0.4mlPG 一T ，摇匀，立即放入37℃恒温水溶锅，记时→观察气泡上升情况，体积一半时记终止时间→以单位效价为横坐标，时间为纵坐标，绘制标准曲线，要求至少有三点在一条直线上。 ⑤样品检测
Ⅰ. 继标准曲线后，在同一条件下，同一试剂情况下，进行样品检测； Ⅱ. 分别加FG 0.3ml，巴比妥缓冲液0.9ml ，PG-T 0.4ml；
Ⅲ. 其余步骤同前。 ⑥测O.D 值
将加酸后的样品稀释10倍，然后测其O ·D 值。 ⑦计算效价与比活
Ⅰ. 根据测试样品的气泡上升时间，在标准曲线上找出相应的点的效价，乘以20得出样品 实际效价。
Ⅱ. 总效价=单位效价(iu/ml)×总体积(ml) Ⅲ. 比活=平均效价×l.75/O·D （2）对产品收率和比活的测定
①对解析液进行总效价和比活测定，结果如下: 总效价:2489万单位，比活:325iu/mgp ②精制后总效价和比活
总效价:1082万单位; 比活:15660iu/mgp ③精制收率:41% 6.3 讨论
6.3.1 尿激酶通常以两种分子形式存在，即分子量36000和54000，大分子量的尿激酶活性较小分子量尿激酶活性强得多，提高比活，一是要去除杂蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。分离出的小分子量尿激酶可以另作回收纯化处理。 6.3.2 尿激酶作为一种活性物质，在纯化过程中要注意防止失活。我们在研究过程中，先是熟练地掌握尿激酶效价和比活的测定步骤，然后不断改变操作条件，通过对每一道工序中影响尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技术条件。
6.3.3 对CM 一S 吸附后的母液及CM 一S 洗脱液中效价大于200iu/ml的部分要进行超滤盐析回收，可用作粗品投料。
6.3.4 尿激酶精品中不能含有热原物质，若检验出热原物质，要作除热原处理。 7 展望
近年来，虽然尿激酶的发展速度很快，特别是用在治疗肿瘤上。但是由于它不稳定，剂量大，半衰期短，制备和检验方法都比较复杂，所以在临床上广泛应用还有一定的困难，现在国内外均有人在研究“长效尿激酶”，即用医学上无毒的可溶性的高分子化合物如右旋糖醉、肝素等来修饰尿激酶的氨基侧链。这样可在一定程度上既保持了尿激醒原有的活力，又提高了它抗抑制剂、抗酶解和耐高温的能力，这就为尿激酶的临床应用开辟了新的途径。
口服尿激酶在消化道易被胰蛋白酶、糜蛋白酶分解，但是如采用一个合适的稳定剂，抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，就可能使口服达到静脉注射同样的效果，
并消除了静注引起的致热原反应。尿激酶与现有的主要溶血栓药物“链激酶”比较，无抗原性，无变态反应，副作用小，是一种较有前途的溶血栓药物，有可能取代链激酶。
参考文献：
[1] Stump DC et al: J Biol Chem, 261(3):1267~1273，1986 [2] Wun T-C et al: J Biol Chem, 257(6):3276,1982 [3] Wun T-C et al: J Biol Chem,257(12):7262,1982
[4]Yamamoto K,loskutoff D J. Fibrin deposition in tissues from endotoxin-treated mice correlates with decreases in the expression of urokinase-type but not tissue -type plasminogen activator. J Clin lnvest, 97(11):2440-2451,1996
[5] 王力生等：上海医科大学学报，16(4)：287，1989 [6] 范亚平：医药工业，17(9)：32，1986
[7] 李惠雄. 尿激酶的研究进展. 国外医学分子生物学分册，1983，5(3)：113~118 [8] Violand BN et al: J Biol Chem ,251(13):3906,1976 [9] 朱洪忠. 尿激酶制备法. 星火技术，1999 2(2):11
[10] 肖厚荣, 金闻博, 查正根. 尿激酶纯化方法与技术的研究. 安庆师院学报(自然科学版)1995，1(4)：3~5
尿激酶的制备与研究进展
摘要：尿激酶是纤溶酶原的主要激活物之一。近年来的研究工作发现, 尿激酶在临床上发挥了重要作用，现在已经大量应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。本文对尿激酶的结构、作用机制及其制备等做了简要介绍。
关键词：尿激酶 纤溶酶原 分子组成 制备
Preparation, Rsearch and Delopment of Urokinase
Abstract: Urokinase is one of the major activitor of plasminogen . Recent research found t- hat urokinase plays a very important role in a variety of other physiological and pathological proc- ess in recent research,including wound healing,tissue regeneration,cell migration,and especially i- ncluding cancer metastasis , angiogenesis and other physical and pathological process. The struct- ure of urokinase and its preparation are introducted in detail in this article. Keywords: urokinase plasminogen molecule structure preparation
1. 前言
尿激酶型纤溶酶原激活物（简称尿激酶：urokinase 简写UK ，) 最初是从新鲜男性尿中提取[1]，以后又在血浆、脑水、精液以及肾细胞、血管内皮细胞、单核细胞、纤维母细胞、某些肿瘤细胞的培养液中发现[2-3]。它是一种溶血栓药物，是纤溶系统的重要一员, 对防止血栓形成和保持血流通畅具有重要意义, 它可将不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原激活为具丝氨酸蛋白酶活性、能溶解纤维蛋白的纤溶酶。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。 2 尿激酶的临床意义
传统上，尿激酶的主要作用被认为是激活纤溶酶酶原，最终导致血栓的溶解。缺乏尿激酶的小鼠有自发形成血管栓塞的倾向，该小鼠在缺氧或内毒素刺激时也易于形成血栓。下调正常小鼠中尿激酶的表达量也导致了内毒素刺激的纤维沉积
4]
。这些与尿激酶的溶栓作用相符合。尿激酶在临床药理中被广泛地应用于急性在临床上，人体内的UK 水平与许多疾病有关。因此可以通过测定患者的UK
心肌梗死、肺栓塞和周边血管阻塞导管治疗中。
含量来判断患者的症状。测定血液中的UK ，因肝脏是UK 的主要清除场所，故严重肝病患者血液中UK 含量明显升高。例如，王力生等[5]测定13例失代偿性肝硬化、16例肝癌，14例慢活肝和15例急肝患者，血清UK 含量均明显高于正常对照组。Kircheimer 等测定28例肝肿瘤患者血浆中UK 也明显升高，但51例肝硬化患者血浆中UK 与正常对照组无明显差别。UK 可从一些肿瘤细胞产生，所以某些肿瘤患者血浆中UK 也可升高。除此之外，测定尿液中的UK ，因正常人尿UK 的分泌量相对稳定在一定程度上与性别、年龄、尿量等关系不大，24小时内波动不明显，其排泌与肾功能关系密切，可作为反映肾功能的一个指标[6]。Takada 等测定31例原发性肾炎和8例继发性肾炎患者，其中UK 含量均明显高于正常。 3 尿激酶的分子组成 3.1 尿激酶的分子量形式
尿激酶有多种分子量形式，主要有3.3×104和5.4×104两种，即低分子尿激酶(简写L-UK) 和高分子尿激酶(简写H-UK) 。据Nobuhara 等人报道，H-UK 和L-UK 的比活分别为157，400和246，700IU/mg蛋白。用对硝基苯一对肌基苯甲酸盐鉴定，它们的活性部分各占97%和88%。已有不少国家从尿中分离出高纯度的H-UK 和L-UK ，并对其分子组成、酶学性质等作了研究[7]。 3.2 H-UK和L-UK 的分子组成
现在人们己经搞清了H-UK 是由分子量约为34000和17600的两条链通过二硫键连接而成的，在重链上有一个活性部位，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸，它的N 末端氨基酸是赖氨酸和异亮氨酸。至于L-UK 的分子组成问题，目前看法尚不一致。Seberauo 等人认为L-UK 是N 末端为异亮氨酸的单链蛋白质。
但Nobuhara 等认为L-UK 与H-UK 一样，也有两条链。他们把H-UK 和L-UK 用1.5%二硫苏糖醇(dithiothrei-tol)在20℃处理18小时后，再进行SDS 凝胶电泳，发现降解的H-UK 出现了分子量为34000和27600的两个蛋白带; 降解的L-UK 也出现了H-UK 重链相同的34000带和一条分子量为1200-3400的带，所以L-UK 也是由两条链组成的[7]。 4 尿激酶的作用机制
尿激酶是特异性很强的蛋白水解酶，纤溶酶原是其唯一的天然蛋白质底物。在循环血中，主要形式的纤溶酶原的N 末端氨基酸是谷氨酸。
Viocand 等[8]人认为纤溶酶原被激活时，首先是在纤溶酶pm 的作用下，使X-Lys 肽键断裂，释放出一个N 末端为谷氨酸的小肽P ，同时形成中间产物Lys-Pg(N末端为赖氨酸的纤溶酶原) ，然后尿激酶再直接作用于Lys-Pg ，把Lys-Pg 转化为具有活性的Lys-Pm(N末端为赖氨酸的纤溶酶) 。另一途径是尿激酶使Glu-Pg(N末端为谷氨酸的纤溶酶原) 分子中的Arg-Val 肽键断裂，转化成Glu-Pm(N末端为谷氨酸的纤溶酶) ，后者在Pm 作用下，使分子中的X 一Lys 肽键断裂，释放出小分子肽P ，最后也转变为Lys-Pm 。
虽然H-UK 和L-UK 对纤溶酶原的作用机制相同，并且对合成底物N-乙酰甘氨酰-L-赖氨酸甲酯（AGLME ）有相同的动力学常数，但是它们对纤溶酶原的激活能力则不相同。由于H-UK 对纤溶酶原有较高的亲和力，在血液里的半衰期又较长，因而有效地激活纤溶酶原，所以在临床上，H-UK 比L-UK 更有效。 5 尿激酶粗品的制备[9]
5.1 收集男性尿。(PH小于7，必要时-加0.8%苯酚防腐，天热时应在4小时内制备完，纱布过滤。)
5.2 每100份尿中加入硅藻土1份，搅拌1小时，温度应低于10℃，防止变质和霉变。
5.3 装柱，用0.02%氨水洗涤，直到流出液变清。
5.4 用0.02%氨水和0.1M NaCl混合液洗脱，当流出液变浑时即收集尿激酶。 5.5 将第四步中的收集液经QAE-Sephadex 层析柱，用磷酸缓冲液洗脱。 5.6 收集第5步的洗脱液用乙酸调PH4.2，调整电导为16-17。
5.7 经过CM-C 柱，用IM 醋酸及醋酸钠缓冲液(PH4.2)洗涤，后改用0.1%氨水0.1M NaCl (PHll.6士2) 的混合液洗脱尿激酶。 5.8 用第7步洗脱液对蒸馏水透析24小时。
5.9 透析液离心沉淀，冻干产品为尿激酶粗品，活性在2万国际单位/mg以上。 以上只是制备方法中的一种，另外尚有树脂吸附法及硅胶吸附法制备粗品。精制方法与此类似。个体户制备的粗品每亿单位收购价在4000元左右，制备粗品的关键在于尿要新鲜。
6 尿激酶纯化方法实验研究[10] 6.1 主要材料
尿激酶粗品，甘氨酸(C·P) 、硫酸(A·R) 、氢氧化钠(A·R) 、盐酸(A·R) 、磷酸二氢钠(C·P) 、磷酸氢二钠，叠氮化钠(A·R) ，714树脂，CM-S 。 6.2 试验过程与技术条件 6.2.1 解析
（1）取尿激酶粗品200克(经测定，比活为325iu/mgP)，悬浮于8倍量的0.5M 甘氨酸缓冲液中，尿激酶浓度在4500iu/ml，维持低温，搅拌75分钟，静置45分钟，上清液经虹吸与底部沉淀分开。
（2）虹吸上清液后的沉淀加入1倍量的甘氨酸缓冲液，处理同上，取上清液。 （3）合并两次上清液，在低温下缓慢加入5NH 2SO 4调PH10.0士0.1(取样测定效价) 。
6.2.2 714树脂脱色
（1）按解析液效价每亿单位用1.4kg 树脂上柱，树脂用蒸馏水洗几个床体积后备用。
（2）将PH10.0的解析液上柱，流速控制在1.8~2.0ml/cm2分，收集流出液，上柱完毕后，柱用一个床体积的低温蒸馏水洗涤。 （3）合并柱流出液用H 2SO 4调PH 为10.0士0.1。 6.2.3 超滤处理
（1）将PH 为10.0的脱色液用超滤器超滤脱盐，超滤浓缩至原体积的六分之一左右。
（2）浓缩液中加入低温蒸馏水，稀释至电导4.8mV(10℃) 。 （3）再次浓缩至六分之一体积。
（4）二次浓缩液中加人低温0.18M 、PH6.8磷酸缓冲液及蒸馏水稀释至原体积，二者加入比例应使稀释液电导为4.8士0.lmV(10℃时) 。 （5）再用5NH 2SO 4调PH 为6.8士0.1。 （6）再次校正电导为4.8士0.lmV (10℃) 。 6.2.4 CM-S交换凝胶纯化(在低温下进行)
（1）CM-S 预处理：CM-S 用燕馏水浸泡后，分别用Na0H 和HCL 处理，然后用0.18M 、pH6.8磷酸缓冲液平衡，过滤; 平衡过的CM-S 悬浮于含0.08%NaN3，0.18M 、PH6.8磷缓冲液中，低温冷藏。 （2）CM-S 吸附
①经超滤PH6.8电导4.8mV 的尿激酸溶液，按5kg/亿单位加入经平衡的CM-S ，搅两小时，止起泡，静置一小时，虹吸去除上清液。
②吸附尿激酶的CM-S 上有机玻璃柱，防止柱内起泡，柱面平整.
（3）洗涤去除杂蛋白
①CM-S 上柱后用含0.3%NaN3，PH6.8、0.18M 磷酸缓冲液洗涤，流速为1.8~2.0而/cm2分左右，流至流出液效价低于100iu/ml，280nm 光吸收峰低于0.04E/ml。 ②改用1.8 M PH6.8磷酸缓冲液洗涤一个半床体积，流速不变，流出液280nm 吸收峰降至0.03以下。 （4）尿激酸洗脱
①洗涤完毕后用0.08M PH8.8磷酸氢二钠、0.95M 氛化钠缓冲液洗脱，流速0.4ml/ cm 2分，测定流出液效价及280nm 吸收峰，将有活力流出液合并，使混合液浓度在5000in/ml以上。
②混合液调PH6.0~7.0.抽取试样化验后，装于二升的塑料瓶内，干冰速冻，-22℃以下低温保存。
6.2.5 尿激酸(UK)效价和比活的测定 （1）测试原理 ①主要试剂与器材
恒温水浴锅、刻度闹钟、荧光灯、UK 效价坐标纸、牛凝血酶(T)、牛纤维蛋白溶酶原(PG)、牛纤维蛋白(FG)、UK 标准品、Barbiton-Na ，Tris ，Na 2EDTA ，NaCl ②试剂配制
T:牛凝血酶40BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加6.6mlBarbiton-Na 缓冲液。 PG:牛纤维蛋白溶酶原22BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加24mlTris 缓冲液。
PG 一T:取PG6.6nil 与配好的6.mlT 等体积混匀，放入50血三角烧瓶中，扎口备用。 FG:片纤维蛋白原，125BP(卫生部药品生物制品检验所) ，每支加18mlBarbiton-Na 冲液。 ③标准UK 稀释
将标准品(l000iu/支) 用巴比妥溶液稀释成60in/ml。 ④绘制标准曲线
取5时试管4支，作记号并分别加入FGO.3ml →分别加入稀释标准UK 溶液0.4、0.3、0.2、0.lml →分别加巴比妥溶液0.6、0.7、0.3、0.9ml →分别加入0.4mlPG 一T ，摇匀，立即放入37℃恒温水溶锅，记时→观察气泡上升情况，体积一半时记终止时间→以单位效价为横坐标，时间为纵坐标，绘制标准曲线，要求至少有三点在一条直线上。 ⑤样品检测
Ⅰ. 继标准曲线后，在同一条件下，同一试剂情况下，进行样品检测； Ⅱ. 分别加FG 0.3ml，巴比妥缓冲液0.9ml ，PG-T 0.4ml；
Ⅲ. 其余步骤同前。 ⑥测O.D 值
将加酸后的样品稀释10倍，然后测其O ·D 值。 ⑦计算效价与比活
Ⅰ. 根据测试样品的气泡上升时间，在标准曲线上找出相应的点的效价，乘以20得出样品 实际效价。
Ⅱ. 总效价=单位效价(iu/ml)×总体积(ml) Ⅲ. 比活=平均效价×l.75/O·D （2）对产品收率和比活的测定
①对解析液进行总效价和比活测定，结果如下: 总效价:2489万单位，比活:325iu/mgp ②精制后总效价和比活
总效价:1082万单位; 比活:15660iu/mgp ③精制收率:41% 6.3 讨论
6.3.1 尿激酶通常以两种分子形式存在，即分子量36000和54000，大分子量的尿激酶活性较小分子量尿激酶活性强得多，提高比活，一是要去除杂蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。分离出的小分子量尿激酶可以另作回收纯化处理。 6.3.2 尿激酶作为一种活性物质，在纯化过程中要注意防止失活。我们在研究过程中，先是熟练地掌握尿激酶效价和比活的测定步骤，然后不断改变操作条件，通过对每一道工序中影响尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技术条件。
6.3.3 对CM 一S 吸附后的母液及CM 一S 洗脱液中效价大于200iu/ml的部分要进行超滤盐析回收，可用作粗品投料。
6.3.4 尿激酶精品中不能含有热原物质，若检验出热原物质，要作除热原处理。 7 展望
近年来，虽然尿激酶的发展速度很快，特别是用在治疗肿瘤上。但是由于它不稳定，剂量大，半衰期短，制备和检验方法都比较复杂，所以在临床上广泛应用还有一定的困难，现在国内外均有人在研究“长效尿激酶”，即用医学上无毒的可溶性的高分子化合物如右旋糖醉、肝素等来修饰尿激酶的氨基侧链。这样可在一定程度上既保持了尿激醒原有的活力，又提高了它抗抑制剂、抗酶解和耐高温的能力，这就为尿激酶的临床应用开辟了新的途径。
口服尿激酶在消化道易被胰蛋白酶、糜蛋白酶分解，但是如采用一个合适的稳定剂，抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，就可能使口服达到静脉注射同样的效果，
并消除了静注引起的致热原反应。尿激酶与现有的主要溶血栓药物“链激酶”比较，无抗原性，无变态反应，副作用小，是一种较有前途的溶血栓药物，有可能取代链激酶。
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