结直肠癌至今依然是西方国家最主要的公共卫生问题，在男性和女性常见癌症中均排在前三位。结直肠癌的5年总生存率接近65%，根据疾病的等级略有差别（Ⅰ期生存率达90%，而Ⅳ期生存率仅为15%）。随着新筛查手段的出现，2015年有超过70%的新发患者实施预防性的切除手术。
尽管传统的临床病理分期仍用于结果的预测，但病理结果表现为同期的结直肠癌，在预后和治疗应答上有显著的异质性。这种临床异质性至少有部分是与结直肠癌发病过程中的遗传变异有关：85%的结直肠癌是由染色体改变驱动（染色体不稳定性通路），15%是由DNA错配修复系统（MMR）功能缺失驱动（微卫星不稳定性（MSI）通路）。
MSI是遗传性非息肉型结直肠癌（也称林奇综合征）的分子标记，通常与MMR基因的胚系突变相关。然而，绝大部分MSI的案例都是散发的结直肠癌，更常见的是由hMLH1的表观遗传失活导致。不同级别的结直肠癌表现出MSI的比例也是不同的：Ⅱ、Ⅲ期中有15%（更常见于Ⅱ期），Ⅳ期中有4%-5%。
该综述总结了具有MSI的结直肠癌的临床病理特征，MSI状态在早期和转移性结直肠癌中的预后和预测意义，以及对新药研发的影响。
微卫星不稳定性的定义
错配修复系统对DNA复制过程中DNA序列错配的校正至关重要。这种修复系统主要由四个蛋白（MLH1, MSH2, MSH6 和PMS2）构成，它们相互配合检测并切断错配，使DNA聚合酶和DNA连接酶能够重新合成并重新连接正确的DNA链。
微卫星是遍布于人类基因组中（编码区和非编码区）的1-6个碱基的短串联重复序列，由于它们的重复结构，微卫星特别容易发生由MMR系统负责修复的复制错误。MMR任一蛋白的功能丧失都会引起MMR系统缺陷，进而导致微卫星错误的累积，例如插入或缺失导致遗传不稳定性。当MSI发生在关键的细胞功能区或关键通路上基因的编码区时，其可能具有致癌潜能。林奇综合征患者的MSI与MMR基因的胚系突变有关（通常表现在MLH1或MSH2），而散发的结直肠癌患者的MSI通常与hMLH1基因启动子甲基化导致的表观遗传失活有关。
林奇综合征
林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌，是一种不完全但高外显的常染色体显性遗传综合征，由DNA错配修复系统的基因（MLH1, MSH2, MSH6, PMS2）失活性胚系突变导致。林奇综合征的特征是早发性结直肠和子宫内膜肿瘤，具有特定的结肠外癌症风险，包括胃肠道肿瘤（例如：胃，小肠，胆道），尿液收集系统（例如：肾盂，输尿管）和女性生殖系统（卵巢）。近期基于人群的研究结果显示，综合征患者中女性终身患结直肠癌的风险为52.2%，男性患结直肠癌的风险为68.7%，其中位确诊年龄为61.2岁。
Amsterdam和Bethesda标准被用于判定林奇综合征患者的疑似人群，可进行相关的基因检测。
现在，也有很多指南建议以下两种方法来筛选林奇综合征患者：一种通用的方法是对所有的结直肠癌患者均进行基因检测；另一种选择性的方法是对确诊年龄小于70岁的结直肠癌患者和大于70岁，但符合Bethesda标准的结直肠癌患者进行基因检测。后一种方法可能漏检超过四分之一的林奇综合征患者。
免疫组化的结果和基因检测的结果显示出良好的一致性。然而，仍有少量MSI不能通过免疫组化来检测，因为错义突变会导致产生功能失调的蛋白，进而产生抗原丢失无法识别。
第一个MSI标记物panel是由两个单核苷酸（BAT-25, BAT-26）和三个二核苷酸（D2S123, D5S346和D17S250）组成。一项新的专家共识建议使用五个准单态性单核苷酸重复序列（BAT-25,BAT-26, NR21, NR24 and NR27）进行检测，其特征是个体间具有恒定数量的核苷酸重复序列和相同的大小，而大多数微卫星是多态性的。依据微卫星不稳定性在指标中发生的比例，结直肠癌有微卫星高度不稳定（MSI-H）和微卫星低度不稳定（MSI-L）之分。其中MSI-H表型定义为在5个标记物中至少两个发生不稳定现象（或如果用大panel，有30%的标记物显示为不稳定），相反，大多数散发的结直肠癌定义为微卫星稳态（MSS），因为它们表现为染色体不稳定和缺乏MSI特征。
使用免疫组化应考虑MMR蛋白PMS2和MSH6与MLH1和MSH2相互合作的关系，它们的表达依赖于与主要配体的结合（例如，MLH1和MSH2）。因此，MSH2表达的缺失通常与MSH6表达缺失有关，这种模式高度提示是由MSH2胚系突变导致。
相同，MLH1表达的缺失与PMS2表达的缺失相关，该模式通常有MLH1胚系突变导致或MLH1基因启动子获得性体细胞甲基化导致。所以MSH6和PMS2胚系突变通常与MSH6和PMS2蛋白表达缺失是分离的。
临床病理特征
从临床观点来看，MSI-H的结直肠癌与MSS的结直肠癌相比，确诊年龄较小，高发于右结肠，通常由无蒂锯齿状腺瘤引起，且在疾病早期便能确诊，最常见于Ⅱ期。此外，与林奇综合征病例相反，散发的结直肠癌的特征在于确诊年龄较大，且通常女性疾病的发生与吸烟相关。
组织学上一些特征是与MSI状态相关的。细胞外粘蛋白的大量产生通常与MSI相关，其在不同的肿瘤区域有不同的比例。另外，通常能观察到胞质内充满粘蛋白的signet-ring细胞分化，会导致细胞核横向错位。MSI-H的结直肠癌显示分化较差，且有髓状分化模式存在，其特征是具有囊泡核和胞质嗜酸性粒细胞增多症。
重要的是淋巴细胞浸润，甚至有类Crohn反应，尤其在MSI的结直肠癌中尤为显著。MSI-H 表型肿瘤比 MSI-L 和 MSS 表型肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞都要多，而且由 MSI 产生的肿瘤特异性抗原肽可以诱导机体免疫应答参与抗肿瘤反应。肿瘤浸润淋巴细胞可分为位于肿瘤细胞基底膜外的基质浸润淋巴细胞（SIL）和肿瘤内细胞浸润淋巴细胞（ITCIL）。MSI-H的结直肠癌显示出ITCIL的严重浸润，且主要是限制性细胞毒性T淋巴细胞抗原（CD8+），且林奇综合征患者和MSI-H的散发性结直肠癌患者统计结果显示无显著差异。另外值得注意的是，新抗原由抗原递呈细胞（APC）呈递给CD4+淋巴细胞，其主要负责通过细胞因子的分泌来增强和维持CTL的细胞毒性。
从分子角度来看，MSI-H的状态也可以通过两个癌基因的不同突变状态来辨别。BRAF和KRAS是两个互斥的编码丝氨酸/苏氨酸激酶的癌基因，能激活RAS-RAF-MEK-ERK通路。BRAF V600E突变可用于排查林奇综合征，因为该突变经常发生在由MLH1启动子（尤其是C端）甲基化引起的散发性MSI结直肠癌，很少在林奇综合征相关的结直肠癌患者中检测到（除去与PMS2胚系突变相关的病例）。而KRAS突变（12或13位密码子）与MSI-H状态呈负相关。
有趣的是，在近期Stadler等的研究中表明，多基因panel检测可以根据突变情况准确的辨别缺陷型MMR（deficient-MMR, dMMR）和功能完善的MMR（proficient-MMR, pMMR），同时还能提供RAS，BRAF和其他基因的突变情况。
MSI在早期和转移性疾病中的预后作用
MSI-H与MSS的结直肠癌相比有特殊的临床特征和更好的预后。在一些报道中表明这种优势与肿瘤的级别无关，然而也有报道是仅限于在Ⅱ、Ⅲ期肿瘤中，但这些数据很可能收辅助化疗的影响。
一项荟萃分析收录了32个研究，1277例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅳ期的患者，作者发现MSI对预后的影响与患者的肿瘤等级无关（早期和晚期患者结果一致），MSI-H的患者死亡风险降低35%（HR 0.65, 95% CI 0.59–0.71）。该项分析包括了未治疗的患者以及用5-Fu化疗的患者。
之后，一项来自Guastadisegni等人的荟萃分析证实了MSI和良好预后之间的相关性。该分析了收录31个研究，共1972例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅳ期的患者，提供了总生存期（OS）的数据，在OS，疾病特异性生存率（DSS），无病生存期（DFS）上均有很好的结果表现。后续的临床试验证实，与pMMR相比，dMMR肿瘤的复发率显著降低。
在QUASAR研究的回顾性分析中，1913例结直肠癌患者随机分配为接受或不接受5-Fu/LV的辅助治疗，结果显示MMR的预后价值在两组中是相似的。另一项PETACC3试验数据支持该结论，在超过600例Ⅱ、Ⅲ期患者中，MSI的患者有更好的预后（p= 0.0077）。
此外，在521例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅲ期患者的多中心回顾性分析中，发现肠梗阻，T4期和血管拴塞是多变量分析中低无病生存期的独立预测因子，从而突出了对血管拴塞的筛查在确定是否给患者提供辅助化疗时的重要指导作用。
另一个有意思的点在BRAF突变的作用，其与早期疾病中MMR状态的关系，仍然是一个具有争议的问题。
在PETACC3试验的后续分析中，BRAF突变状态对OS的影响仅限于MSL-L和MSS的肿瘤中，而在190例MSI-H的肿瘤中并未显示预后意义。这个假说在Samowitz等人的一项大型美国数据库研究中得到证实，结果显示在900例Ⅰ-Ⅳ期患者中，BRAF V600E突变不影响MSI肿瘤的良好预后。
关于这个方向，Lochhead等人评估了一项大型的美国数据库，并建议MSI-H/BRAF野生型患者具有最好的预后，而BRAF突变型肿瘤的死亡率最高。这个假说在CALGB 89803辅助试验中得到了证实：在34例MSI-H/BRAF突变型肿瘤患者中，MSI的预后作用通过BRAF突变得到平衡，导致与MSS/BRAF野生型肿瘤具有相同的存活率；换句话说，按照存活时间长短排序为：MSI-H/BRAFWT＞MSS/ BRAF WT 或 MSI-H/BRAF MT＞MSS/BRAF MT。
因此，这些数据总体上证明了在早期疾病中，BRAF突变使MSS和MSL-L的结直肠癌中有较差的预后，而MSI-H的肿瘤预后良好。在转移性疾病中，关于MMR状态的相关研究数据有限，主要是因为在Ⅳ期肿瘤中MSI的发生率很低，所以支持了具有MSI的结直肠癌的低转移率假说。
在一系列复发性结直肠癌中，不论是从确诊到死亡（OS1）还是从复发到死亡（OS2），MSI-H的患者OS均较低。值得注意的是，这样的患者复发率也较低，更多的是局部和腹膜复发，不可能进行治愈性切除也不能从转换疗法中获益，反映了转移性结直肠癌的固有耐药。合并分析4个转移性结直肠癌一线治疗的Ⅲ期研究（CAIRO, CAIRO2, COIN, FOCUS）并证实：153例MSI-H结直肠癌患者与pMMR患者相比有更差的中位PFS和OS（PFS 6.2 vs7.6 months, HR 1.33; 95% CI 1.12–1.57,p= 0.001 and OS 13.6 vs 16.8 months, HR1.35; 95% CI 1.13–1.61,p= 0.001）。
另一项回顾性分析中，55例dMMR转移性结直肠癌患者与pMMR对照组相比，在R0/R1转移灶术后（OS 33,8 months, 95%CI 14,5– 76,5）也没有更好的结果（OS15.4 months, 95% CI 10.61–17.74）。而MSI-H/BRAF野生型的肿瘤与MSI-H/BRAF突变型相比，中生存期有所提高（17.3 vs 10.1months;p= 0.029）。
因此，基于上述转移性疾病的数据，具有MSI的患者有更差的预后，BRAF突变驱动了部分的较差预后。
MSI在辅助治疗和转移性疾病中的预测作用
关于MSI在预测化疗对早期结直肠癌的作用，越来越多的文献表示dMMR的患者不能从5-Fu的化疗中获益，但仍有些数据是矛盾的，如表3。
临床前数据显示，dMMR的状态与5-Fu的耐药相关。Ribic及其同事对5个临床试验进行了汇总分析，对Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者随机分组，分别给予5-FU加左旋咪唑或甲酰四氢叶酸，与单独手术组进行对比，结果表明dMMR结直肠癌患者仅单独手术有更好的生存率，而不能从5-Fu的化疗中获益。这些结果在后续的分析中也得到了证实，尤其是Ⅱ期dMMR肿瘤患者治疗后的总生存期降低（HR, 2.95; 95% CI 1.02–8.54,p= 0.04）。
在QUASAR试验中，与单独手术组相比，5-Fu加亚叶酸的治疗增加了Ⅱ期结直肠癌患者的生存率；有意思的是，dMMR肿瘤患者的复发率是pMMR肿瘤患者的一半（11% vs 26%; risk ratio [RR],0.53; 95% CI 0.40–0.70,p＜0.001），但化疗疗效无显著差异。
在来自ACCENT数据库的分析结果显示，在Ⅱ期dMMR和 pMMR结直肠癌单独手术治疗中，其时间-间隔（TTR）和OS是有差异的（TTR, HR 0.27; 95% CI 0.10–0.75;p= 0.01; OS HR 0.27; 95% CI0.10–0.74,p= 0.01），但这种优势在5-Fu辅助化疗中减弱（TTR, HR 0.27; 95% CI 0.10–0.75;p= 0.01; OS HR 0.27; 95% CI0.10–0.74,p= 0.01）。MSI的预后作用也仅在Ⅲ期结肠癌患者的单独手术治疗中得到证实（TTR HR 0.59; 95% CI 0.28–1.23,p= 0.16; OS HR 0.69; 95% CI0.35–1.36,p= 0.28），而与单独手术治疗相比，5-Fu单药治疗对pMMR肿瘤患者和dMMR肿瘤患者在生存率上有显著差异（pMMR: 5年生存率= 71% vs 54%; dMMR: 5年生存率= 77% vs 59%）。
另一项来自Sinicrope团队的分析共评估2141例Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者，随机分组进行5-Fu化疗：dMMR结直肠癌患者与pMMR患者相比，其复发率降低，复发时间延迟，生存率增加。且对于Ⅲ期dMMR结肠癌患者，5-Fu辅助治疗与单独手术组相比，5年复发率降低（22% vs 37%;p= 0.04）。
因此，虽然5-Fu辅助化疗不能对Ⅱ期MSI-H结直肠癌患者带来更好的预后，但是可作为Ⅲ期MSI-H结直肠癌患者的治疗选择。三项3期随机临床试验确定，奥沙利铂加氟嘧啶（5-Fu, 卡培他滨）目前已经作为Ⅲ期结直肠癌患者的标准辅助疗法。与5-Fu相反，临床前研究表明MSI肿瘤细胞对奥沙利铂敏感，这与迄今为止已经发表的，关于MMR状态与奥沙利铂功效之间关系的结果数据有冲突。
NSABP C07试验（5-FU加亚叶酸±奥沙利铂）和C08（FOLFOX±贝伐珠单抗）对Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者进行分析，显示dMMR与基于复发的预后有改善作用（HR 0.48, 95% CI 0.33–0.70,p＜0.0001），而不能预测奥沙利铂的获益情况。
相反，在近期更新的MOSAICⅢ期临床试验中，推注/输注氟尿嘧啶加亚叶酸（LV5FU2）与LV5FU2加奥沙利铂（FOLFOX4）相比，dMMR是一个独立的预后因子（HR 2.02; 95% CI 1.15–3.55,p= 0.014），在FOLFOX4组Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌患者DFS和OS的HRs分别为0.48 （95% CI,0.20–1.12）和0.41（95% CI0.16–1.07），为了更细化的研究，在NO147试验（在野生型KRAS结直肠癌Ⅲ期患者中，比较FOLFOX和FOLFOX加西妥昔单抗的一项Ⅲ期临床试验）的分析中，观察到dMMR近端肿瘤有更好的DFS，而远端和N2肿瘤无生存率获益，表明MMR状态的预测作用可参考肿瘤位置和淋巴结状态。
此外在AGEO的研究中，分析了433例Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌大数据集，这些患者均进行单独手术治疗或手术加辅助化疗（氟嘧啶加或不加奥沙利铂），与单独手术组相比，奥沙利铂辅助化疗组DFS提高，与单独的氟嘧啶相反，这些多变量分析的统计学获益仅限于Ⅲ期肿瘤和散发性肿瘤而不是林奇综合征病例。
综合这些结果，虽然存在争议但从回顾性分析中似乎得出，在dMMR结直肠癌的治疗中，奥沙利铂能克服氟尿嘧啶单药治疗的有害影响，而这些获益仅限于某些亚组中（Ⅲ期，近端位置，N1疾病，散发性病例）。
另外Dalerba的一项近期研究表明，CDX-2缺失的Ⅱ期结直肠癌预后较差，且可能从辅助化疗中获益。同时另一个关键点是在局部晚期直肠癌中，MSI的状态对基于氟吡啶酰胺的新辅助化学辐射治疗的预测作用。近期，de Rosa团队回顾性分析了62例胚系dMMR直肠癌患者，结果显示27.6%的病理完全缓解率和显著的阶段调整生存率。dMMR直肠癌的鉴别不仅触发了胚系检测的必要性，同事还影响手术的切除程度，应考虑到几个因素，例如存在同步的结肠病变，肿瘤大小，临床等级和盆腔照射的必要性。
与早期疾病相反，很少有研究分析MMR状态在转移性疾病中的预测作用，因为仅有4%的Ⅳ期结直肠癌是MSI-H。在DesGuetz团队的荟萃分析中，964例患者中91例为MSI-H肿瘤，与MSS肿瘤相比，MSI-H的患者对于化疗的应答率并没有更好。
MSI结直肠癌的免疫治疗
一项Ⅰ期临床试验评估在难治性实体肿瘤患者中，其中一例MSI结直肠癌患者对抗PD-1抗体的治疗显示出完全持久的应答。Le等发表一项Ⅱ期研究，评估在dMMR和pMMR结直肠癌患者和一组无MMR缺陷特征的结直肠肿瘤患者中Pembrolizumab的表现，结果在dMMR结直肠癌组显示出显著的免疫相关的40%RECIST客观反应率，90%的疾病控制率和20周时的免疫相关的PFS率为78%。相反，在pMMR结直肠癌组中无免疫相关的RECIST客观反应率，且在20周时的免疫相关的PFS率为11%。值得注意的是，所有6例散发性dMMR结直肠癌患者有客观反映，而11例（27%）林奇综合征相关的结直肠癌患者只有3例有客观反映。一种解释可能是，与散发性结直肠癌相比，胚系dMMR结直肠癌有较少数量的移码突变，但这种差异也可能是由于这两种类型的结直肠癌有不同的发病机理。
为了更好的阐明这种疗法的作用，一项Ⅱ期（KEYNOTE-164）和一项Ⅲ期（KEYNOTE-177）临床试验评估了Pembrolizumab在MSI或MMR缺陷的患者中的疗效，目前试验正在进行中。另一项临床试验（CHECKMATE-142）测试Nivolumab（抗PD-1）单一疗法和Nivolumab加Ipilimumab（抗CTLA-4抗体）在MSI结直肠癌中的差异，目前试验也正在进行中。
总结
尽管林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌，但我们对它的认识和确诊仍存在很多不足。在这样的情况下，广泛可用和易于操作的检测方法是至关重要的，这能更好的评估需要进行胚系检测的患者人群，并且为患者及其亲属提供适当的临床管理。
关于早期结直肠癌，MSI是一个明确的预后因子，尤其是Ⅱ期和对5-Fu耐药的预测指标，虽然关于这个话题的文献数据是有冲突的。同时在患者的临床决策上仍然存在灰色区域，仍旧有改进的空间，例如对于“高风险”MSI-H的Ⅱ期结直肠癌患者。
与Ⅱ期结直肠癌不同，Ⅲ期患者MSI的状态不太可能影响治疗的选择（FOLFOX or XELOX）。然而一个现实的问题是：选用5-Fu或者卡培他滨进行单药治疗的Ⅲ期患者难道不是奥沙利铂潜在获益者？
在转移性疾病中，MSI-H肿瘤的主动免疫微环境使得这些患者成为免疫靶向治疗（例如Nivolumab或Pembrolizumab）的临床试验候选者，而MSI-H的转移性结直肠癌患者仅仅是极少数的。
总之，MSI的结直肠癌混合了散发性和遗传性不同的类型，根据其他特征（例如BRAF突变状态）可能具有不同的表现。由于MSI的低发生率，在疾病的不同阶段均可发生，随着时间的不同有不同的标准治疗，所以其研究是困难的。在未来需要发展全球合作，以获得足够数量的患者，用以阐明更多未知的问题。
参考文献
1. Gelsomino F et al. The evolving roleof microsatellite instability in colorectal cancer: A review. Cancer Treat Rev.2016;51:19-26.
结直肠癌至今依然是西方国家最主要的公共卫生问题，在男性和女性常见癌症中均排在前三位。结直肠癌的5年总生存率接近65%，根据疾病的等级略有差别（Ⅰ期生存率达90%，而Ⅳ期生存率仅为15%）。随着新筛查手段的出现，2015年有超过70%的新发患者实施预防性的切除手术。
尽管传统的临床病理分期仍用于结果的预测，但病理结果表现为同期的结直肠癌，在预后和治疗应答上有显著的异质性。这种临床异质性至少有部分是与结直肠癌发病过程中的遗传变异有关：85%的结直肠癌是由染色体改变驱动（染色体不稳定性通路），15%是由DNA错配修复系统（MMR）功能缺失驱动（微卫星不稳定性（MSI）通路）。
MSI是遗传性非息肉型结直肠癌（也称林奇综合征）的分子标记，通常与MMR基因的胚系突变相关。然而，绝大部分MSI的案例都是散发的结直肠癌，更常见的是由hMLH1的表观遗传失活导致。不同级别的结直肠癌表现出MSI的比例也是不同的：Ⅱ、Ⅲ期中有15%（更常见于Ⅱ期），Ⅳ期中有4%-5%。
该综述总结了具有MSI的结直肠癌的临床病理特征，MSI状态在早期和转移性结直肠癌中的预后和预测意义，以及对新药研发的影响。
微卫星不稳定性的定义
错配修复系统对DNA复制过程中DNA序列错配的校正至关重要。这种修复系统主要由四个蛋白（MLH1, MSH2, MSH6 和PMS2）构成，它们相互配合检测并切断错配，使DNA聚合酶和DNA连接酶能够重新合成并重新连接正确的DNA链。
微卫星是遍布于人类基因组中（编码区和非编码区）的1-6个碱基的短串联重复序列，由于它们的重复结构，微卫星特别容易发生由MMR系统负责修复的复制错误。MMR任一蛋白的功能丧失都会引起MMR系统缺陷，进而导致微卫星错误的累积，例如插入或缺失导致遗传不稳定性。当MSI发生在关键的细胞功能区或关键通路上基因的编码区时，其可能具有致癌潜能。林奇综合征患者的MSI与MMR基因的胚系突变有关（通常表现在MLH1或MSH2），而散发的结直肠癌患者的MSI通常与hMLH1基因启动子甲基化导致的表观遗传失活有关。
林奇综合征
林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌，是一种不完全但高外显的常染色体显性遗传综合征，由DNA错配修复系统的基因（MLH1, MSH2, MSH6, PMS2）失活性胚系突变导致。林奇综合征的特征是早发性结直肠和子宫内膜肿瘤，具有特定的结肠外癌症风险，包括胃肠道肿瘤（例如：胃，小肠，胆道），尿液收集系统（例如：肾盂，输尿管）和女性生殖系统（卵巢）。近期基于人群的研究结果显示，综合征患者中女性终身患结直肠癌的风险为52.2%，男性患结直肠癌的风险为68.7%，其中位确诊年龄为61.2岁。
Amsterdam和Bethesda标准被用于判定林奇综合征患者的疑似人群，可进行相关的基因检测。
现在，也有很多指南建议以下两种方法来筛选林奇综合征患者：一种通用的方法是对所有的结直肠癌患者均进行基因检测；另一种选择性的方法是对确诊年龄小于70岁的结直肠癌患者和大于70岁，但符合Bethesda标准的结直肠癌患者进行基因检测。后一种方法可能漏检超过四分之一的林奇综合征患者。
免疫组化的结果和基因检测的结果显示出良好的一致性。然而，仍有少量MSI不能通过免疫组化来检测，因为错义突变会导致产生功能失调的蛋白，进而产生抗原丢失无法识别。
第一个MSI标记物panel是由两个单核苷酸（BAT-25, BAT-26）和三个二核苷酸（D2S123, D5S346和D17S250）组成。一项新的专家共识建议使用五个准单态性单核苷酸重复序列（BAT-25,BAT-26, NR21, NR24 and NR27）进行检测，其特征是个体间具有恒定数量的核苷酸重复序列和相同的大小，而大多数微卫星是多态性的。依据微卫星不稳定性在指标中发生的比例，结直肠癌有微卫星高度不稳定（MSI-H）和微卫星低度不稳定（MSI-L）之分。其中MSI-H表型定义为在5个标记物中至少两个发生不稳定现象（或如果用大panel，有30%的标记物显示为不稳定），相反，大多数散发的结直肠癌定义为微卫星稳态（MSS），因为它们表现为染色体不稳定和缺乏MSI特征。
使用免疫组化应考虑MMR蛋白PMS2和MSH6与MLH1和MSH2相互合作的关系，它们的表达依赖于与主要配体的结合（例如，MLH1和MSH2）。因此，MSH2表达的缺失通常与MSH6表达缺失有关，这种模式高度提示是由MSH2胚系突变导致。
相同，MLH1表达的缺失与PMS2表达的缺失相关，该模式通常有MLH1胚系突变导致或MLH1基因启动子获得性体细胞甲基化导致。所以MSH6和PMS2胚系突变通常与MSH6和PMS2蛋白表达缺失是分离的。
临床病理特征
从临床观点来看，MSI-H的结直肠癌与MSS的结直肠癌相比，确诊年龄较小，高发于右结肠，通常由无蒂锯齿状腺瘤引起，且在疾病早期便能确诊，最常见于Ⅱ期。此外，与林奇综合征病例相反，散发的结直肠癌的特征在于确诊年龄较大，且通常女性疾病的发生与吸烟相关。
组织学上一些特征是与MSI状态相关的。细胞外粘蛋白的大量产生通常与MSI相关，其在不同的肿瘤区域有不同的比例。另外，通常能观察到胞质内充满粘蛋白的signet-ring细胞分化，会导致细胞核横向错位。MSI-H的结直肠癌显示分化较差，且有髓状分化模式存在，其特征是具有囊泡核和胞质嗜酸性粒细胞增多症。
重要的是淋巴细胞浸润，甚至有类Crohn反应，尤其在MSI的结直肠癌中尤为显著。MSI-H 表型肿瘤比 MSI-L 和 MSS 表型肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞都要多，而且由 MSI 产生的肿瘤特异性抗原肽可以诱导机体免疫应答参与抗肿瘤反应。肿瘤浸润淋巴细胞可分为位于肿瘤细胞基底膜外的基质浸润淋巴细胞（SIL）和肿瘤内细胞浸润淋巴细胞（ITCIL）。MSI-H的结直肠癌显示出ITCIL的严重浸润，且主要是限制性细胞毒性T淋巴细胞抗原（CD8+），且林奇综合征患者和MSI-H的散发性结直肠癌患者统计结果显示无显著差异。另外值得注意的是，新抗原由抗原递呈细胞（APC）呈递给CD4+淋巴细胞，其主要负责通过细胞因子的分泌来增强和维持CTL的细胞毒性。
从分子角度来看，MSI-H的状态也可以通过两个癌基因的不同突变状态来辨别。BRAF和KRAS是两个互斥的编码丝氨酸/苏氨酸激酶的癌基因，能激活RAS-RAF-MEK-ERK通路。BRAF V600E突变可用于排查林奇综合征，因为该突变经常发生在由MLH1启动子（尤其是C端）甲基化引起的散发性MSI结直肠癌，很少在林奇综合征相关的结直肠癌患者中检测到（除去与PMS2胚系突变相关的病例）。而KRAS突变（12或13位密码子）与MSI-H状态呈负相关。
有趣的是，在近期Stadler等的研究中表明，多基因panel检测可以根据突变情况准确的辨别缺陷型MMR（deficient-MMR, dMMR）和功能完善的MMR（proficient-MMR, pMMR），同时还能提供RAS，BRAF和其他基因的突变情况。
MSI在早期和转移性疾病中的预后作用
MSI-H与MSS的结直肠癌相比有特殊的临床特征和更好的预后。在一些报道中表明这种优势与肿瘤的级别无关，然而也有报道是仅限于在Ⅱ、Ⅲ期肿瘤中，但这些数据很可能收辅助化疗的影响。
一项荟萃分析收录了32个研究，1277例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅳ期的患者，作者发现MSI对预后的影响与患者的肿瘤等级无关（早期和晚期患者结果一致），MSI-H的患者死亡风险降低35%（HR 0.65, 95% CI 0.59–0.71）。该项分析包括了未治疗的患者以及用5-Fu化疗的患者。
之后，一项来自Guastadisegni等人的荟萃分析证实了MSI和良好预后之间的相关性。该分析了收录31个研究，共1972例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅳ期的患者，提供了总生存期（OS）的数据，在OS，疾病特异性生存率（DSS），无病生存期（DFS）上均有很好的结果表现。后续的临床试验证实，与pMMR相比，dMMR肿瘤的复发率显著降低。
在QUASAR研究的回顾性分析中，1913例结直肠癌患者随机分配为接受或不接受5-Fu/LV的辅助治疗，结果显示MMR的预后价值在两组中是相似的。另一项PETACC3试验数据支持该结论，在超过600例Ⅱ、Ⅲ期患者中，MSI的患者有更好的预后（p= 0.0077）。
此外，在521例MSI-H结直肠癌Ⅰ-Ⅲ期患者的多中心回顾性分析中，发现肠梗阻，T4期和血管拴塞是多变量分析中低无病生存期的独立预测因子，从而突出了对血管拴塞的筛查在确定是否给患者提供辅助化疗时的重要指导作用。
另一个有意思的点在BRAF突变的作用，其与早期疾病中MMR状态的关系，仍然是一个具有争议的问题。
在PETACC3试验的后续分析中，BRAF突变状态对OS的影响仅限于MSL-L和MSS的肿瘤中，而在190例MSI-H的肿瘤中并未显示预后意义。这个假说在Samowitz等人的一项大型美国数据库研究中得到证实，结果显示在900例Ⅰ-Ⅳ期患者中，BRAF V600E突变不影响MSI肿瘤的良好预后。
关于这个方向，Lochhead等人评估了一项大型的美国数据库，并建议MSI-H/BRAF野生型患者具有最好的预后，而BRAF突变型肿瘤的死亡率最高。这个假说在CALGB 89803辅助试验中得到了证实：在34例MSI-H/BRAF突变型肿瘤患者中，MSI的预后作用通过BRAF突变得到平衡，导致与MSS/BRAF野生型肿瘤具有相同的存活率；换句话说，按照存活时间长短排序为：MSI-H/BRAFWT＞MSS/ BRAF WT 或 MSI-H/BRAF MT＞MSS/BRAF MT。
因此，这些数据总体上证明了在早期疾病中，BRAF突变使MSS和MSL-L的结直肠癌中有较差的预后，而MSI-H的肿瘤预后良好。在转移性疾病中，关于MMR状态的相关研究数据有限，主要是因为在Ⅳ期肿瘤中MSI的发生率很低，所以支持了具有MSI的结直肠癌的低转移率假说。
在一系列复发性结直肠癌中，不论是从确诊到死亡（OS1）还是从复发到死亡（OS2），MSI-H的患者OS均较低。值得注意的是，这样的患者复发率也较低，更多的是局部和腹膜复发，不可能进行治愈性切除也不能从转换疗法中获益，反映了转移性结直肠癌的固有耐药。合并分析4个转移性结直肠癌一线治疗的Ⅲ期研究（CAIRO, CAIRO2, COIN, FOCUS）并证实：153例MSI-H结直肠癌患者与pMMR患者相比有更差的中位PFS和OS（PFS 6.2 vs7.6 months, HR 1.33; 95% CI 1.12–1.57,p= 0.001 and OS 13.6 vs 16.8 months, HR1.35; 95% CI 1.13–1.61,p= 0.001）。
另一项回顾性分析中，55例dMMR转移性结直肠癌患者与pMMR对照组相比，在R0/R1转移灶术后（OS 33,8 months, 95%CI 14,5– 76,5）也没有更好的结果（OS15.4 months, 95% CI 10.61–17.74）。而MSI-H/BRAF野生型的肿瘤与MSI-H/BRAF突变型相比，中生存期有所提高（17.3 vs 10.1months;p= 0.029）。
因此，基于上述转移性疾病的数据，具有MSI的患者有更差的预后，BRAF突变驱动了部分的较差预后。
MSI在辅助治疗和转移性疾病中的预测作用
关于MSI在预测化疗对早期结直肠癌的作用，越来越多的文献表示dMMR的患者不能从5-Fu的化疗中获益，但仍有些数据是矛盾的，如表3。
临床前数据显示，dMMR的状态与5-Fu的耐药相关。Ribic及其同事对5个临床试验进行了汇总分析，对Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者随机分组，分别给予5-FU加左旋咪唑或甲酰四氢叶酸，与单独手术组进行对比，结果表明dMMR结直肠癌患者仅单独手术有更好的生存率，而不能从5-Fu的化疗中获益。这些结果在后续的分析中也得到了证实，尤其是Ⅱ期dMMR肿瘤患者治疗后的总生存期降低（HR, 2.95; 95% CI 1.02–8.54,p= 0.04）。
在QUASAR试验中，与单独手术组相比，5-Fu加亚叶酸的治疗增加了Ⅱ期结直肠癌患者的生存率；有意思的是，dMMR肿瘤患者的复发率是pMMR肿瘤患者的一半（11% vs 26%; risk ratio [RR],0.53; 95% CI 0.40–0.70,p＜0.001），但化疗疗效无显著差异。
在来自ACCENT数据库的分析结果显示，在Ⅱ期dMMR和 pMMR结直肠癌单独手术治疗中，其时间-间隔（TTR）和OS是有差异的（TTR, HR 0.27; 95% CI 0.10–0.75;p= 0.01; OS HR 0.27; 95% CI0.10–0.74,p= 0.01），但这种优势在5-Fu辅助化疗中减弱（TTR, HR 0.27; 95% CI 0.10–0.75;p= 0.01; OS HR 0.27; 95% CI0.10–0.74,p= 0.01）。MSI的预后作用也仅在Ⅲ期结肠癌患者的单独手术治疗中得到证实（TTR HR 0.59; 95% CI 0.28–1.23,p= 0.16; OS HR 0.69; 95% CI0.35–1.36,p= 0.28），而与单独手术治疗相比，5-Fu单药治疗对pMMR肿瘤患者和dMMR肿瘤患者在生存率上有显著差异（pMMR: 5年生存率= 71% vs 54%; dMMR: 5年生存率= 77% vs 59%）。
另一项来自Sinicrope团队的分析共评估2141例Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者，随机分组进行5-Fu化疗：dMMR结直肠癌患者与pMMR患者相比，其复发率降低，复发时间延迟，生存率增加。且对于Ⅲ期dMMR结肠癌患者，5-Fu辅助治疗与单独手术组相比，5年复发率降低（22% vs 37%;p= 0.04）。
因此，虽然5-Fu辅助化疗不能对Ⅱ期MSI-H结直肠癌患者带来更好的预后，但是可作为Ⅲ期MSI-H结直肠癌患者的治疗选择。三项3期随机临床试验确定，奥沙利铂加氟嘧啶（5-Fu, 卡培他滨）目前已经作为Ⅲ期结直肠癌患者的标准辅助疗法。与5-Fu相反，临床前研究表明MSI肿瘤细胞对奥沙利铂敏感，这与迄今为止已经发表的，关于MMR状态与奥沙利铂功效之间关系的结果数据有冲突。
NSABP C07试验（5-FU加亚叶酸±奥沙利铂）和C08（FOLFOX±贝伐珠单抗）对Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者进行分析，显示dMMR与基于复发的预后有改善作用（HR 0.48, 95% CI 0.33–0.70,p＜0.0001），而不能预测奥沙利铂的获益情况。
相反，在近期更新的MOSAICⅢ期临床试验中，推注/输注氟尿嘧啶加亚叶酸（LV5FU2）与LV5FU2加奥沙利铂（FOLFOX4）相比，dMMR是一个独立的预后因子（HR 2.02; 95% CI 1.15–3.55,p= 0.014），在FOLFOX4组Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌患者DFS和OS的HRs分别为0.48 （95% CI,0.20–1.12）和0.41（95% CI0.16–1.07），为了更细化的研究，在NO147试验（在野生型KRAS结直肠癌Ⅲ期患者中，比较FOLFOX和FOLFOX加西妥昔单抗的一项Ⅲ期临床试验）的分析中，观察到dMMR近端肿瘤有更好的DFS，而远端和N2肿瘤无生存率获益，表明MMR状态的预测作用可参考肿瘤位置和淋巴结状态。
此外在AGEO的研究中，分析了433例Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌大数据集，这些患者均进行单独手术治疗或手术加辅助化疗（氟嘧啶加或不加奥沙利铂），与单独手术组相比，奥沙利铂辅助化疗组DFS提高，与单独的氟嘧啶相反，这些多变量分析的统计学获益仅限于Ⅲ期肿瘤和散发性肿瘤而不是林奇综合征病例。
综合这些结果，虽然存在争议但从回顾性分析中似乎得出，在dMMR结直肠癌的治疗中，奥沙利铂能克服氟尿嘧啶单药治疗的有害影响，而这些获益仅限于某些亚组中（Ⅲ期，近端位置，N1疾病，散发性病例）。
另外Dalerba的一项近期研究表明，CDX-2缺失的Ⅱ期结直肠癌预后较差，且可能从辅助化疗中获益。同时另一个关键点是在局部晚期直肠癌中，MSI的状态对基于氟吡啶酰胺的新辅助化学辐射治疗的预测作用。近期，de Rosa团队回顾性分析了62例胚系dMMR直肠癌患者，结果显示27.6%的病理完全缓解率和显著的阶段调整生存率。dMMR直肠癌的鉴别不仅触发了胚系检测的必要性，同事还影响手术的切除程度，应考虑到几个因素，例如存在同步的结肠病变，肿瘤大小，临床等级和盆腔照射的必要性。
与早期疾病相反，很少有研究分析MMR状态在转移性疾病中的预测作用，因为仅有4%的Ⅳ期结直肠癌是MSI-H。在DesGuetz团队的荟萃分析中，964例患者中91例为MSI-H肿瘤，与MSS肿瘤相比，MSI-H的患者对于化疗的应答率并没有更好。
MSI结直肠癌的免疫治疗
一项Ⅰ期临床试验评估在难治性实体肿瘤患者中，其中一例MSI结直肠癌患者对抗PD-1抗体的治疗显示出完全持久的应答。Le等发表一项Ⅱ期研究，评估在dMMR和pMMR结直肠癌患者和一组无MMR缺陷特征的结直肠肿瘤患者中Pembrolizumab的表现，结果在dMMR结直肠癌组显示出显著的免疫相关的40%RECIST客观反应率，90%的疾病控制率和20周时的免疫相关的PFS率为78%。相反，在pMMR结直肠癌组中无免疫相关的RECIST客观反应率，且在20周时的免疫相关的PFS率为11%。值得注意的是，所有6例散发性dMMR结直肠癌患者有客观反映，而11例（27%）林奇综合征相关的结直肠癌患者只有3例有客观反映。一种解释可能是，与散发性结直肠癌相比，胚系dMMR结直肠癌有较少数量的移码突变，但这种差异也可能是由于这两种类型的结直肠癌有不同的发病机理。
为了更好的阐明这种疗法的作用，一项Ⅱ期（KEYNOTE-164）和一项Ⅲ期（KEYNOTE-177）临床试验评估了Pembrolizumab在MSI或MMR缺陷的患者中的疗效，目前试验正在进行中。另一项临床试验（CHECKMATE-142）测试Nivolumab（抗PD-1）单一疗法和Nivolumab加Ipilimumab（抗CTLA-4抗体）在MSI结直肠癌中的差异，目前试验也正在进行中。
总结
尽管林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌，但我们对它的认识和确诊仍存在很多不足。在这样的情况下，广泛可用和易于操作的检测方法是至关重要的，这能更好的评估需要进行胚系检测的患者人群，并且为患者及其亲属提供适当的临床管理。
关于早期结直肠癌，MSI是一个明确的预后因子，尤其是Ⅱ期和对5-Fu耐药的预测指标，虽然关于这个话题的文献数据是有冲突的。同时在患者的临床决策上仍然存在灰色区域，仍旧有改进的空间，例如对于“高风险”MSI-H的Ⅱ期结直肠癌患者。
与Ⅱ期结直肠癌不同，Ⅲ期患者MSI的状态不太可能影响治疗的选择（FOLFOX or XELOX）。然而一个现实的问题是：选用5-Fu或者卡培他滨进行单药治疗的Ⅲ期患者难道不是奥沙利铂潜在获益者？
在转移性疾病中，MSI-H肿瘤的主动免疫微环境使得这些患者成为免疫靶向治疗（例如Nivolumab或Pembrolizumab）的临床试验候选者，而MSI-H的转移性结直肠癌患者仅仅是极少数的。
总之，MSI的结直肠癌混合了散发性和遗传性不同的类型，根据其他特征（例如BRAF突变状态）可能具有不同的表现。由于MSI的低发生率，在疾病的不同阶段均可发生，随着时间的不同有不同的标准治疗，所以其研究是困难的。在未来需要发展全球合作，以获得足够数量的患者，用以阐明更多未知的问题。
参考文献
1. Gelsomino F et al. The evolving roleof microsatellite instability in colorectal cancer: A review. Cancer Treat Rev.2016;51:19-26.