三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析法研究*
王强1，黄启欣1，孙远明1，刘英菊2，徐振林1，雷红涛1
（1.广东省食品质量安全重点实验室/农业部农产品贮藏质量安全风险评价重点实验室，广州 510642；
2.华南农业大学理学院生物材料研究所，广州 510642）
摘要 将三聚氰胺半抗原（MEL）与异硫氰酸荧光素乙二胺（EDF）反应合成荧光示踪物MEL-EDF，示踪物与三聚氰胺抗体反应制备出稳定的单试剂免疫复合物，随后考查了其结合动力学和置换动力学过程，首次建立了一种三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析方法（SR-FPIA）。该法检出限（LOD）为3.2 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为157.1 ng/mL，检测范围为（IC20~IC80）在12.2~1012.4 ng/mL，可以满足国标和国际食品法典委员会（CAC）对于食品中三聚氰胺最高残留限量的检测要求。整个检测过程可以在15 min内完成，并且单试剂免疫复合物在4 °C下至少可稳定保存1个月以上。本研究对开发三聚氰胺新型免疫检测方法具有重要意义。 关键词 单试剂荧光偏振免疫分析；示踪物；三聚氰胺 中图分类号 O652
三聚氰胺（melamine）是一种常用的工业化工原料[1]，由于其分子中含有大量氮元素，近年来被非法添加于食品、饲料当中以提高蛋白质的检测含量[2]，尤其用于乳制品中的蛋白造假。摄入三聚氰胺可能导致生殖损害和肾结石，甚至进一步导致膀胱癌[3]。为保障食品安全和消费者身体健康，2011年农业部、卫生部等5部门联合发布《关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告》，禁止人为添加三聚氰胺到食品中，规定婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值限定为1 mg/kg，其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg[4,5]，高于上述限量的食品一律不得销售。
目前对三聚氰胺的检测方法主要是气相或液相色谱为基础的仪器分析法[6, 7]。尽管仪器分析法准确可靠，但前处理繁琐，成本高，且需要专业人员来操作复杂的仪器设备。近年来，快速、简便、高通量的免疫分析法越来越多的用于食品污染物分析，表现出重要的应用价值
[ 8-10]
。荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）作为一种均相免
疫分析方法，其反应过程无需分离洗涤步骤，相比于传统非均相的酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunsorbent assay，ELISA），FPIA在高通量和自动化免疫分析中展示了良好的应用前景[11-13]。单试剂荧光偏振免疫分析（single reagent FPIA，SR-FPIA），也称置换FPIA，是预先将抗体和荧光标记物混合，使用时作为一种混合试剂与竞争抗原反应，较常规非置换型FPIA减少了操作步骤，使用更加简单方便[14]。但在食品非法添加物、环境污染物分析领域，国内外SR-FPIA研究应用甚少。
本文将三聚氰胺半抗原（MEL）与异硫氰酸荧光素乙二胺（1-(2-aminoethyl)-3-(3',6'- dihydroxy-3-oxo-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)thiourea，EDF）反应，合成了一种高活性的三聚氰胺荧光示踪物（MEL-EDF），进而制备出抗体和示踪物的单试剂免疫复合物，考察了结合与置换动力学过程，首次建立了一种三聚氰胺SR-FPIA分析方法，为检测三聚氰胺提供了一种新的方法选择。
收稿日期：
基金项目：农业部行业公益项目（201003008-08），高等学校博士点基金优先发展领域项目([1**********]002)、广州市科技计划项目（12C12101663）、国家自然科学基金项目(21105030)。 联系人简介：雷红涛（1973年生），男，博士，副教授，主要从事生物分析化学研究。E-mail：
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
三聚氰胺、异硫氰酸荧光素异构体 І（FITC isomer І）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、乙二胺，Sigma 公司；三聚氰胺半抗原 MEL（图1）和三聚氰胺多克隆抗体由本实验室前期制备[3]；其它试剂均为市售分析纯；硼酸缓冲液（BB溶液，50 mmol/L，pH 8.0）作为稀释液用于所有样品稀释。
Wallac VICTOR3 1420多标记分析仪（美国Perkin Elmer公司）；U-3010 紫外可见光谱扫描仪（日本Hitachi公司）；荧光微孔板（深圳金灿华实业有限公司）。 1.2 实验过程 1.2.1 示踪物合成
（1）中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（EDF）的合成
用甲醇配制1%（体积分数）的三乙胺溶液，分别将20 mg (0.3 mmol) 乙二胺和34.8 mg (0.3 mmol)己二胺溶于5 mL甲醇三乙胺溶液中；再将11.7 mg (0.03 mmol) FITC溶于1 mL甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺或己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1 h，浓缩，硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯+甲醇（3:1, v/v），收集流出的黄色物质即得EDF（图1）。 （2）荧光标记示踪物MEL-EDF合成
将10.0 mg (40 μmol) MEL，16.0 mg (80 μmol) DCC 和9.7 mg (80 μmol) NHS 溶于0.4 mL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下搅拌反应过夜。离心去除沉淀得上清，加入4.5 mg (10 μmol) EDF到上清中，室温避光反应3 h，薄层层析硅胶板分离产物，展开剂为三氯甲烷+甲醇（4:1, v/v)。刮取Rf = 0.1、0.8和0.9的黄色条带，分别用1 mL甲醇提取，得到黄绿色液体置于4°C下保存，留待下一步活性鉴定。
Fig. 1 Synthesis of tracer MEL-EDF
1.2.2示踪物的活性鉴定
分别测定不同Rf值处的游离示踪物（1 nmol/L），与100倍稀释的三聚氰胺多克隆抗体结合后的荧光偏振（FP）值（mP），通过比较游离示踪物与特异性抗体结合后偏振值的变化来鉴定示踪物活性，偏振值通过Wallac VICTOR3 1420多标记分析仪进行测定，示踪物浓度通过测定其在492 nm下的吸光值（A）估算得出，其中摩尔消光系数ε ＝ 8.78×104 M-1•cm-1 [15]。
1.2.3 单试剂免疫复合物的制备
将10 mL浓度为1 nmol/L的示踪物MEL-EDF与等体积100倍稀释的三聚氰胺多克隆抗体混合反应，通过连续测读偏振值来监控反应的状态，得到结合动力学曲线，根据曲线确定单试剂反应平衡时间。 1.2.4 标准溶液的配制
三聚氰胺标准品用甲醇+水溶液（1:1, v/v）配置成初始浓度为1 mg/mL，然后用硼酸缓冲溶液分别稀释至1，10，50，100，500，1000，5000，10000 ng/mL，8个梯度浓度的标准
品工作液。
1.2.5 SR-FPIA竞争反应动力学曲线
将20 µL不同浓度的三聚氰胺标准品加入到180 µL单试剂免疫复合物中，同时以硼酸缓冲溶液作为空白对照（0 ng/mL），然后连续测读偏振值，获取竞争反应动力学曲线，综合对比dFP和IC50的动力学曲线变化，确定竞争反应平衡时间。其中dFP= FPmax-FPmin，即曲线最高偏振值（FPmax）与曲线最低偏振值（FPmin）之间的差值，dFP值越高表明有效信号区间越大，单位浓度变化带来的信号变化越大，即灵敏度越高[16]。 1.2.6 标准曲线的绘制
将20 µL不同浓度的三聚氰胺标准品加入到180 µL单试剂免疫复合物中，待反应平衡后测读不同药物浓度下的偏振值。以偏振值为纵坐标，标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro7.5 软件四参数对数函数进行曲线拟合[17]。半抑制浓度IC50定义为50%抑制浓度，以10%抑制浓度IC10为检测限（LOD），以20%~80%抑制浓度（IC20~IC80）为检测范围[18]。 1.2.7 单试剂免疫复合物稳定性的研究
将单试剂免疫复合物置于4°C度下保存1个月，通过比较一个月内标准曲线的变化，以偏振值FPmax和拟合获取的IC50两个指标评价单试剂复合物稳定性。
2 结果与讨论
2.1 示踪物的活性鉴定
荧光示踪物是影响FPIA方法灵敏度和特异性的关键因素之一[18]。本文合成出FITC衍生物EDF，然后标记三聚氰胺半抗原，标记后在半抗原和FITC间形成一个二碳长度的间隔臂，从而避免了半抗原过于接近荧光基团而可能对荧光基团量子产率的影响。但是，标记反应副反应较多，产物在薄层层析（TLC）板上呈现多条荧光带，因此，需要对每条带进行活
[19]性鉴定，筛选出具有结合活性的目标标记产物（MEL-EDF）。结果表明，TLC板上Rf = 0.1、
0.8和0.9的荧光产物在游离状态下的偏振值都在130~140 mP。而Rf= 0.1和 0.9处的荧光产物与抗体混合后，其偏振值与游离示踪物的偏振值相差不大，没有明显变化，表明这两种荧光产物未与抗体发生结合，推测其可能为未反应完全的EDF或FITC。而Rf= 0.8处的荧光产物，与抗体混合后的偏振值相对其游离状态的偏振值显著上升，达到245 mP，几乎达到游离状态偏振值的2倍，说明该荧光产物与抗体发生了特异性结合。因此，Rf= 0.8处的荧光产物应为具有活性的目标荧光示踪物MEL-EDF。 2.2 单试剂免疫复合物的制备
单试剂免疫复合物是建立SR-FPIA方法的关键试剂，需要预先制备[16]。本文将三聚氰胺荧光示踪物MEL-EDF与三聚氰胺抗体混合后，连续测读偏振值，监控示踪物和抗体结合过程（图2），发现12 min后偏振值基本保持稳定，表明结合反应达到平衡状态，单试剂复合物在12 min即可制备完成。 2.3 SR-FPIA竞争反应动力学曲线
通过监测置换反应动力学曲线（图3a），同时连续绘制出IC50和dFP的动力学变化曲线（图3b），观察其竞争反应过程。从图3a可见，反应1 min时，不同药物浓度之间已产生明显的信号差异。从图3b可见，随着反应时间的延长，dFP曲线在0-5 min内迅速升高，在5-10 min内变化逐渐趋于减慢，10 min后基本达到相对平衡。这表明对于三聚氰胺SR-FPIA，反应平衡时较反应初期的有效检测信号区间大，检测性能更好。而IC50曲线在1-3 min时处于较高水平，在3 min后剧烈下降，5-15 min间持续缓慢下降，在15 min时基本达到平衡。说明置换型的SR-FPIA反应初期和后期的动力学规律并不不同，较长的反应时间有利于三聚氰胺SR-FPIA灵敏度的改善。
）
FP (mP，毫偏振单
Time (min)
Fig. 2 Kinetic binding of tracer and antibody
）
）dFP(mP，毫偏振单
FP (mP，毫偏振单
Time (min)
Time (min)
Fig. 3 Displacement kinetics of SR-FPIA for melamine.
a. displacement kinetic curves. b. kinetic curves of IC50 and dFP, dFP= FPmax-FPmin
本研究中，为得到较好的灵敏度，同时控制好检测结果的稳定性，选择信号基本稳定时的15 min作为SR-FPIA置换反应检测信号采集时间。在此条件绘制SR-FPIA标准曲线（图4），经过四参数拟合计算，该方法的IC50为157.1 ng/mL，检测限LOD（IC10）为3.2 ng/mL，检测范围（LOQ，IC20~IC80）在12.2~1012.4 ng/mL；而相应的ELISA方法检测限为8.9 ng/mL，检测范围14.9~108.5 ng/mL [20]，这说明SR-FPIA具有更宽的检测范围和更低的检测限。而且，相对于ELISA检测通常60 min左右的反应时间[3, 20]，三聚氰胺SR-FPIA一步反应，无需洗涤，明显快捷几倍，使用更加方便。相对于国标GB/T22388-2008和国际食品法典委员会（CAC）对于食品中三聚氰胺1 mg/kg的最大残留限量（MRL）要求[5]，三聚氰胺SR-FPIA方法的检测限、定量检测范围都远远低于该MRL，完全可以满足检测要求。
IC50(ng/mL
）
FP (mP，毫偏振单
Log Melamine (ng/mL)
Fig. 4 Calibration curve of SR-FPIA for melamine
2.4 单试剂免疫复合物稳定性研究
在一个月内使用该单试剂免疫复合物绘制的三聚氰胺SR-FPIA标准曲线拟合度较好（图5），并且曲线FPmax值和IC50值稳定保持在同一水平，表明没有明显变化。这表明单试剂免疫复合物可以在4 °C存放至少可以稳定一个月。
FP (mP，毫偏振单
FPmax (mP，毫偏振单
IC50(ng/mL0
Log Melamine (ng/mL)
Time (day)
）
)
Fig. 5 Stability of single reagent immunocomplex of melamine SR-FPIA.
Note: A. calibration curves during one month. B. FPmax and IC50 of
calibration curves during one month
3 结论
本研究成功制备出三聚氰胺荧光示踪物，研究了示踪物与抗体的结合动力学以及与分析物的置换动力学过程，获得稳定的三聚氰胺单试剂免疫复合物，首次建立了一种三聚氰胺SR-FPIA方法。该方法IC50为157.1 ng/mL，检测限（LOD）为3.2 ng/mL，检测范围为12.2 ~ 1012.4 ng/mL，灵敏度能够满足国内外相关检测限量标准；检测过程15 min内即可完成，且该单试剂免疫复合物稳定性良好。本研究对于进一步开发新型三聚氰胺SR-FPIA快速检测试剂盒具有重要意义。
参考文献
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Development of a single-reagent fluorescence polarization
immunoassay for melamine
WANG Qiang 1, Huang Qi-Xin 1, SUN Yuan-Ming 1, Liu Ying-Ju 2, XU Zhen-Lin1, LEI
Hong-Tao2
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety / Key Risk Assessment
Laboratory of Agricultural Product Preservation, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510642, China; 2.
Institute of Biomaterials, College of Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou，
510642)
Abstract The fluorescence-labeled melamine tracer (MEL-EDF) were synthesized by the reaction of melamine hapten (MEL) with 1-(2-aminoethyl)-3-(3',6'-dihydroxy-3-oxo-3H- spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)thiourea (EDF). The tracer was then incubated with the antibody to prepare the single reagent immunocomplex, and both the binding and displacement kinetics were evaluated to obtain the equilibration time. Finally, a single reagent fluorescence polarization immunoassay (SR-FPIA) was developed for the first time to measure melamine. The developed SR-FPIA demonstrated a detection limit (LOD) of 3.2 ng/mL, a 50% inhibition value (IC50) of 157.1 ng/mL and a working range (IC20~IC80) of 12.2~1012.4 ng/mL. The results indicated the proposed method can meet the detection requirement for the maximum residue level of melamine set by China government and CAC. The detection could be finished within 15 min, and the obtained single reagent immunocomplex was stable for more than one month at 4 °C. This work will benefit to the further development of SR-FPIA kit for melamine.
Keywords Single reagent fluorescence polarization immunoassay; tracer; melamine
三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析法研究*
王强1，黄启欣1，孙远明1，刘英菊2，徐振林1，雷红涛1
（1.广东省食品质量安全重点实验室/农业部农产品贮藏质量安全风险评价重点实验室，广州 510642；
2.华南农业大学理学院生物材料研究所，广州 510642）
摘要 将三聚氰胺半抗原（MEL）与异硫氰酸荧光素乙二胺（EDF）反应合成荧光示踪物MEL-EDF，示踪物与三聚氰胺抗体反应制备出稳定的单试剂免疫复合物，随后考查了其结合动力学和置换动力学过程，首次建立了一种三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析方法（SR-FPIA）。该法检出限（LOD）为3.2 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为157.1 ng/mL，检测范围为（IC20~IC80）在12.2~1012.4 ng/mL，可以满足国标和国际食品法典委员会（CAC）对于食品中三聚氰胺最高残留限量的检测要求。整个检测过程可以在15 min内完成，并且单试剂免疫复合物在4 °C下至少可稳定保存1个月以上。本研究对开发三聚氰胺新型免疫检测方法具有重要意义。 关键词 单试剂荧光偏振免疫分析；示踪物；三聚氰胺 中图分类号 O652
三聚氰胺（melamine）是一种常用的工业化工原料[1]，由于其分子中含有大量氮元素，近年来被非法添加于食品、饲料当中以提高蛋白质的检测含量[2]，尤其用于乳制品中的蛋白造假。摄入三聚氰胺可能导致生殖损害和肾结石，甚至进一步导致膀胱癌[3]。为保障食品安全和消费者身体健康，2011年农业部、卫生部等5部门联合发布《关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告》，禁止人为添加三聚氰胺到食品中，规定婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值限定为1 mg/kg，其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg[4,5]，高于上述限量的食品一律不得销售。
目前对三聚氰胺的检测方法主要是气相或液相色谱为基础的仪器分析法[6, 7]。尽管仪器分析法准确可靠，但前处理繁琐，成本高，且需要专业人员来操作复杂的仪器设备。近年来，快速、简便、高通量的免疫分析法越来越多的用于食品污染物分析，表现出重要的应用价值
[ 8-10]
。荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）作为一种均相免
疫分析方法，其反应过程无需分离洗涤步骤，相比于传统非均相的酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunsorbent assay，ELISA），FPIA在高通量和自动化免疫分析中展示了良好的应用前景[11-13]。单试剂荧光偏振免疫分析（single reagent FPIA，SR-FPIA），也称置换FPIA，是预先将抗体和荧光标记物混合，使用时作为一种混合试剂与竞争抗原反应，较常规非置换型FPIA减少了操作步骤，使用更加简单方便[14]。但在食品非法添加物、环境污染物分析领域，国内外SR-FPIA研究应用甚少。
本文将三聚氰胺半抗原（MEL）与异硫氰酸荧光素乙二胺（1-(2-aminoethyl)-3-(3',6'- dihydroxy-3-oxo-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)thiourea，EDF）反应，合成了一种高活性的三聚氰胺荧光示踪物（MEL-EDF），进而制备出抗体和示踪物的单试剂免疫复合物，考察了结合与置换动力学过程，首次建立了一种三聚氰胺SR-FPIA分析方法，为检测三聚氰胺提供了一种新的方法选择。
收稿日期：
基金项目：农业部行业公益项目（201003008-08），高等学校博士点基金优先发展领域项目([1**********]002)、广州市科技计划项目（12C12101663）、国家自然科学基金项目(21105030)。 联系人简介：雷红涛（1973年生），男，博士，副教授，主要从事生物分析化学研究。E-mail：
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
三聚氰胺、异硫氰酸荧光素异构体 І（FITC isomer І）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、乙二胺，Sigma 公司；三聚氰胺半抗原 MEL（图1）和三聚氰胺多克隆抗体由本实验室前期制备[3]；其它试剂均为市售分析纯；硼酸缓冲液（BB溶液，50 mmol/L，pH 8.0）作为稀释液用于所有样品稀释。
Wallac VICTOR3 1420多标记分析仪（美国Perkin Elmer公司）；U-3010 紫外可见光谱扫描仪（日本Hitachi公司）；荧光微孔板（深圳金灿华实业有限公司）。 1.2 实验过程 1.2.1 示踪物合成
（1）中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（EDF）的合成
用甲醇配制1%（体积分数）的三乙胺溶液，分别将20 mg (0.3 mmol) 乙二胺和34.8 mg (0.3 mmol)己二胺溶于5 mL甲醇三乙胺溶液中；再将11.7 mg (0.03 mmol) FITC溶于1 mL甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺或己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1 h，浓缩，硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯+甲醇（3:1, v/v），收集流出的黄色物质即得EDF（图1）。 （2）荧光标记示踪物MEL-EDF合成
将10.0 mg (40 μmol) MEL，16.0 mg (80 μmol) DCC 和9.7 mg (80 μmol) NHS 溶于0.4 mL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下搅拌反应过夜。离心去除沉淀得上清，加入4.5 mg (10 μmol) EDF到上清中，室温避光反应3 h，薄层层析硅胶板分离产物，展开剂为三氯甲烷+甲醇（4:1, v/v)。刮取Rf = 0.1、0.8和0.9的黄色条带，分别用1 mL甲醇提取，得到黄绿色液体置于4°C下保存，留待下一步活性鉴定。
Fig. 1 Synthesis of tracer MEL-EDF
1.2.2示踪物的活性鉴定
分别测定不同Rf值处的游离示踪物（1 nmol/L），与100倍稀释的三聚氰胺多克隆抗体结合后的荧光偏振（FP）值（mP），通过比较游离示踪物与特异性抗体结合后偏振值的变化来鉴定示踪物活性，偏振值通过Wallac VICTOR3 1420多标记分析仪进行测定，示踪物浓度通过测定其在492 nm下的吸光值（A）估算得出，其中摩尔消光系数ε ＝ 8.78×104 M-1•cm-1 [15]。
1.2.3 单试剂免疫复合物的制备
将10 mL浓度为1 nmol/L的示踪物MEL-EDF与等体积100倍稀释的三聚氰胺多克隆抗体混合反应，通过连续测读偏振值来监控反应的状态，得到结合动力学曲线，根据曲线确定单试剂反应平衡时间。 1.2.4 标准溶液的配制
三聚氰胺标准品用甲醇+水溶液（1:1, v/v）配置成初始浓度为1 mg/mL，然后用硼酸缓冲溶液分别稀释至1，10，50，100，500，1000，5000，10000 ng/mL，8个梯度浓度的标准
品工作液。
1.2.5 SR-FPIA竞争反应动力学曲线
将20 µL不同浓度的三聚氰胺标准品加入到180 µL单试剂免疫复合物中，同时以硼酸缓冲溶液作为空白对照（0 ng/mL），然后连续测读偏振值，获取竞争反应动力学曲线，综合对比dFP和IC50的动力学曲线变化，确定竞争反应平衡时间。其中dFP= FPmax-FPmin，即曲线最高偏振值（FPmax）与曲线最低偏振值（FPmin）之间的差值，dFP值越高表明有效信号区间越大，单位浓度变化带来的信号变化越大，即灵敏度越高[16]。 1.2.6 标准曲线的绘制
将20 µL不同浓度的三聚氰胺标准品加入到180 µL单试剂免疫复合物中，待反应平衡后测读不同药物浓度下的偏振值。以偏振值为纵坐标，标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro7.5 软件四参数对数函数进行曲线拟合[17]。半抑制浓度IC50定义为50%抑制浓度，以10%抑制浓度IC10为检测限（LOD），以20%~80%抑制浓度（IC20~IC80）为检测范围[18]。 1.2.7 单试剂免疫复合物稳定性的研究
将单试剂免疫复合物置于4°C度下保存1个月，通过比较一个月内标准曲线的变化，以偏振值FPmax和拟合获取的IC50两个指标评价单试剂复合物稳定性。
2 结果与讨论
2.1 示踪物的活性鉴定
荧光示踪物是影响FPIA方法灵敏度和特异性的关键因素之一[18]。本文合成出FITC衍生物EDF，然后标记三聚氰胺半抗原，标记后在半抗原和FITC间形成一个二碳长度的间隔臂，从而避免了半抗原过于接近荧光基团而可能对荧光基团量子产率的影响。但是，标记反应副反应较多，产物在薄层层析（TLC）板上呈现多条荧光带，因此，需要对每条带进行活
[19]性鉴定，筛选出具有结合活性的目标标记产物（MEL-EDF）。结果表明，TLC板上Rf = 0.1、
0.8和0.9的荧光产物在游离状态下的偏振值都在130~140 mP。而Rf= 0.1和 0.9处的荧光产物与抗体混合后，其偏振值与游离示踪物的偏振值相差不大，没有明显变化，表明这两种荧光产物未与抗体发生结合，推测其可能为未反应完全的EDF或FITC。而Rf= 0.8处的荧光产物，与抗体混合后的偏振值相对其游离状态的偏振值显著上升，达到245 mP，几乎达到游离状态偏振值的2倍，说明该荧光产物与抗体发生了特异性结合。因此，Rf= 0.8处的荧光产物应为具有活性的目标荧光示踪物MEL-EDF。 2.2 单试剂免疫复合物的制备
单试剂免疫复合物是建立SR-FPIA方法的关键试剂，需要预先制备[16]。本文将三聚氰胺荧光示踪物MEL-EDF与三聚氰胺抗体混合后，连续测读偏振值，监控示踪物和抗体结合过程（图2），发现12 min后偏振值基本保持稳定，表明结合反应达到平衡状态，单试剂复合物在12 min即可制备完成。 2.3 SR-FPIA竞争反应动力学曲线
通过监测置换反应动力学曲线（图3a），同时连续绘制出IC50和dFP的动力学变化曲线（图3b），观察其竞争反应过程。从图3a可见，反应1 min时，不同药物浓度之间已产生明显的信号差异。从图3b可见，随着反应时间的延长，dFP曲线在0-5 min内迅速升高，在5-10 min内变化逐渐趋于减慢，10 min后基本达到相对平衡。这表明对于三聚氰胺SR-FPIA，反应平衡时较反应初期的有效检测信号区间大，检测性能更好。而IC50曲线在1-3 min时处于较高水平，在3 min后剧烈下降，5-15 min间持续缓慢下降，在15 min时基本达到平衡。说明置换型的SR-FPIA反应初期和后期的动力学规律并不不同，较长的反应时间有利于三聚氰胺SR-FPIA灵敏度的改善。
）
FP (mP，毫偏振单
Time (min)
Fig. 2 Kinetic binding of tracer and antibody
）
）dFP(mP，毫偏振单
FP (mP，毫偏振单
Time (min)
Time (min)
Fig. 3 Displacement kinetics of SR-FPIA for melamine.
a. displacement kinetic curves. b. kinetic curves of IC50 and dFP, dFP= FPmax-FPmin
本研究中，为得到较好的灵敏度，同时控制好检测结果的稳定性，选择信号基本稳定时的15 min作为SR-FPIA置换反应检测信号采集时间。在此条件绘制SR-FPIA标准曲线（图4），经过四参数拟合计算，该方法的IC50为157.1 ng/mL，检测限LOD（IC10）为3.2 ng/mL，检测范围（LOQ，IC20~IC80）在12.2~1012.4 ng/mL；而相应的ELISA方法检测限为8.9 ng/mL，检测范围14.9~108.5 ng/mL [20]，这说明SR-FPIA具有更宽的检测范围和更低的检测限。而且，相对于ELISA检测通常60 min左右的反应时间[3, 20]，三聚氰胺SR-FPIA一步反应，无需洗涤，明显快捷几倍，使用更加方便。相对于国标GB/T22388-2008和国际食品法典委员会（CAC）对于食品中三聚氰胺1 mg/kg的最大残留限量（MRL）要求[5]，三聚氰胺SR-FPIA方法的检测限、定量检测范围都远远低于该MRL，完全可以满足检测要求。
IC50(ng/mL
）
FP (mP，毫偏振单
Log Melamine (ng/mL)
Fig. 4 Calibration curve of SR-FPIA for melamine
2.4 单试剂免疫复合物稳定性研究
在一个月内使用该单试剂免疫复合物绘制的三聚氰胺SR-FPIA标准曲线拟合度较好（图5），并且曲线FPmax值和IC50值稳定保持在同一水平，表明没有明显变化。这表明单试剂免疫复合物可以在4 °C存放至少可以稳定一个月。
FP (mP，毫偏振单
FPmax (mP，毫偏振单
IC50(ng/mL0
Log Melamine (ng/mL)
Time (day)
）
)
Fig. 5 Stability of single reagent immunocomplex of melamine SR-FPIA.
Note: A. calibration curves during one month. B. FPmax and IC50 of
calibration curves during one month
3 结论
本研究成功制备出三聚氰胺荧光示踪物，研究了示踪物与抗体的结合动力学以及与分析物的置换动力学过程，获得稳定的三聚氰胺单试剂免疫复合物，首次建立了一种三聚氰胺SR-FPIA方法。该方法IC50为157.1 ng/mL，检测限（LOD）为3.2 ng/mL，检测范围为12.2 ~ 1012.4 ng/mL，灵敏度能够满足国内外相关检测限量标准；检测过程15 min内即可完成，且该单试剂免疫复合物稳定性良好。本研究对于进一步开发新型三聚氰胺SR-FPIA快速检测试剂盒具有重要意义。
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Development of a single-reagent fluorescence polarization
immunoassay for melamine
WANG Qiang 1, Huang Qi-Xin 1, SUN Yuan-Ming 1, Liu Ying-Ju 2, XU Zhen-Lin1, LEI
Hong-Tao2
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety / Key Risk Assessment
Laboratory of Agricultural Product Preservation, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510642, China; 2.
Institute of Biomaterials, College of Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou，
510642)
Abstract The fluorescence-labeled melamine tracer (MEL-EDF) were synthesized by the reaction of melamine hapten (MEL) with 1-(2-aminoethyl)-3-(3',6'-dihydroxy-3-oxo-3H- spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)thiourea (EDF). The tracer was then incubated with the antibody to prepare the single reagent immunocomplex, and both the binding and displacement kinetics were evaluated to obtain the equilibration time. Finally, a single reagent fluorescence polarization immunoassay (SR-FPIA) was developed for the first time to measure melamine. The developed SR-FPIA demonstrated a detection limit (LOD) of 3.2 ng/mL, a 50% inhibition value (IC50) of 157.1 ng/mL and a working range (IC20~IC80) of 12.2~1012.4 ng/mL. The results indicated the proposed method can meet the detection requirement for the maximum residue level of melamine set by China government and CAC. The detection could be finished within 15 min, and the obtained single reagent immunocomplex was stable for more than one month at 4 °C. This work will benefit to the further development of SR-FPIA kit for melamine.
Keywords Single reagent fluorescence polarization immunoassay; tracer; melamine