常用的几种典型的病原菌分离方法
1．斑点病原菌的分离 从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移臵培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离 从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。，用灭菌水冲洗几次，移臵培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离 根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离 多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5． 种子内病原菌分离 将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移臵培养基上。
6．孢子分离法 能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术
一、目的要求
了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理
单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，臵适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器
1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)
(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
(2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。
(3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。
(4) 玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularia lunata)。
2．培养基 PDA斜面培养基、水琼脂培养基。
3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70％酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝锅等。
四、实验操作
(一) 利用震落法进行单孢分离
(1) 用无菌操作将熔化后冷却到60～70℃的水琼脂培养基约10 ml倒入灭菌培养皿内，凝固成平板备用。
(2) 按无菌操作要领，将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30～45°角度，将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好，以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动，使孢子稀疏地落到平板表面，振落时宁轻勿重，以防过多孢子落于水琼脂平板表面。
提示：振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。
(3) 将水琼脂平板翻转后臵于显微镜载物台上，用低倍镜(10×
10)寻找平板表面上的单个孢子。找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上，点涂一个圆点作为标志。
提示：可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后，待多数孢子开始萌发时再进行检查，这时较易观察，且可以保证孢子具有萌发和生长能力。
(4) 将水琼脂平板从载物台上取下，按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上，用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌，再臵于25℃恒温箱培养。
(5) 数日后如果斜面培养基上生出菌丝，并形成孢子，经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的，则此菌种即是经单孢分离获得的纯菌株。
(二) 利用稀释法进行单孢分离
(1) 用灭菌水配制孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液中有20～30个左右孢子时，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25％乳酸1～2滴)。
(2) 将已熔化好并冷却到45～50℃的水琼脂培养基约10 ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。
(3) 以振落法相同步骤操作，即可获得单孢系菌种。
(三) 利用直接挑取法进行单孢分离
(1)、挑孢针的制作。把直径为3～4 mm，长约15 cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔，将一个4号昆虫针尾部插入，把针尖部2 mm左右弯折90°而成。
提示：用金属材料制作的挑孢针灭菌容易，不易碰碎，可以长期使用。
(2) 把玉米大斑病病叶臵于解剖镜下，寻找目标孢子。可以先在低放大倍率(1×10)下寻找，在高放大倍率(4×10)下，观察是否为单个孢子。
(3) 找到分生孢子后，将挑孢针在酒精灯上高温灭菌，待稍冷却，用挑孢针把孢子粘上，在酒精等火焰上方移入试管斜面培养基上。25培养3～5 d后，观察是否长出纯菌落。
提示：挑孢针在挑取孢子时如果不易黏取，可以先将挑孢针在培养基上轻轻划一下，增加黏性；如果在病叶上目标真菌孢子大量成堆，或周围有其他杂菌的孢子不易分开时，可以取一个干净的载玻片，用挑孢针挑取一些孢子，在载玻片上轻轻碰击，使孢子互相散开，然后在解剖镜下寻找单个孢子，挑取分离。如果进行专性寄生菌的单孢分离，用挑孢针把孢子放在其寄主植物上即可获得单孢菌系。
五、实验作业
上交分离得到的单孢系菌种。
六、思考题
1．如采用在水琼脂平板上用孢子悬液划线后再寻找单孢的方法能否进行；单孢分离?
2．设想还可以采用什么样的方法进行真菌的单孢分离?
3. 用组织法分离长出菌落后，如果多个菌落混杂在一起如何进行进一步的分离纯化?
4. 想一想直接挑取法除了进行单孢分离外还有其他什么用途?
5．单孢子分离技术有哪些优点?
附录3 真菌和细菌的菌种保藏
病原生物纯培养的保存和贮藏技术是比较复杂而十分重要的。在实际研究工作中，经常需要将保存的菌种与一些已知的或已鉴定过的标准菌种对比。而被研究的分离物，一旦鉴定结束，也应妥善保存和贮藏，以便今后进一步研究和对比之用。菌种纯培养的保存和贮藏中最重要的是如何保存这众多的分离物，使之不会因贮藏条件不妥而死亡，不因保存方法不当而发生变异，不被其他生物污染，能长期保存其生命力和原有性状不变。为达此目标，通常都采用部分抑制或完全抑制病原生物的生长和代谢活动的方式以延长其存活期，并减少变异。常用保藏方法有：
1．室温保存 许多真菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温(10～15℃)条件下，放在玻璃橱内即可。对于鞭毛菌亚门的真菌，只适宜用这种方法保存，但每隔2～3个月，就要移植一次。为了防止真菌在培养保存过程中致病力的退化和变异(如失去致病力，菌丝体变为黏液状，或失去产孢能力等)，常使用天然培养基，尽量减少糖的用量，有的直接放在灭菌的土壤中保存。室温保存的优点是简便易行，无需特殊设备，缺点是培养基易干燥，每1～3个月需要移植一次。
2．低温保存 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包好，移至2～8℃的冰箱中保藏，是最常用的保存菌种的方法。保藏时间依微生物的种类而有不同。真菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移植一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移植一次。此法为实验室和工厂菌种室常用，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备。缺点是容易变异。因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，致使微生物的代谢改变而影响了微生物的性状，并且需要屡次传代。若菌种经常使用，而条件不变，宜应用此
法。如能放在-20℃或-60℃冰箱中或液氮罐中，则存活期 可以更长。但是放在-20℃或-60℃冰箱中的材料，尤其是放在液氮中的培养物外面必须密封，以防冻裂或破损。
3．石蜡油保存 利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，
其油面高度应超过斜面顶部lcm，以隔绝斜面上菌种与空气接触，使之处于无氧条件下，以抑制菌种的生长与代谢活动，而培养基也不会干燥。这是许多真菌菌种的保存方法，效果好(一般可保藏2年以上不死)而成本低。无芽孢的细菌也可保存一年左右。加入石蜡油的菌种管可以放在室温下，也可放在冰箱中。当重新需要菌种时，只要用接种钩从油面下钩取小块菌体重新放在斜面或平板上即可恢复生长。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移植。缺点是保存时必须直立放臵，所占位臵较大，同时也不便携带。
4．灭菌蒸馏水悬浮保存 土壤浸液和蒸馏水，经过灭菌以后，把细菌菌苔悬浮到这些液体中，密封后保存在冰箱中，其存活期可长达10年，是很理想而简易的保存方法。
几乎所有的真菌均可采用蒸馏水保存法，即把子板上生长的菌丝切成小块，连同培养基一起放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后放在室温下即可长期保存。是目前最理想的保存方法。
5．干燥保存 许多菌种在干燥后就会死亡，但真菌的菌丝体和孢子，有芽孢的细菌等，经适当的干燥后可以长期存活。常用的干燥保存法是使用灭菌。速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。
(1) 以无菌的脱脂牛奶(作为保护剂，使蛋白质不致变性)将微生物制成细胞悬液，加入长颈球形底的小玻璃管内，此管又称安瓿。
(2) 将安瓿放在低温下冷冻。冷冻剂为干冰(固体二氧化碳)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃，将安瓿插入冷冻剂，只需冷冻4～5 min。
(3) 准备冷冻槽。槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。
(4) 安瓿放入冷冻槽中的干燥瓶内。
(5) 抽气 一般若在30min内，能达到102.67 Pa真空度时，则干燥物不致溶化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.66 Pa，保持压力6～8 h即可。
(6) 封口。抽真空干燥后，取出安瓿，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约l0min(即可达到26.66 Pa)，以在真空状态下封口。拟煤气喷灯的细火焰在安瓿颈中央进行封口。密封的安瓿管可盛放在冰箱中。
(7) 菌种的恢复生长。将安瓿管顶部用酒精消毒后，在火焰上加热，然后加一滴灭菌水使玻璃管炸裂，再向管中加入0.2 ml的灭菌水或蛋白胨水，静臵数分钟后，摇匀成悬浮液，吸出放在培养基平板上。臵温箱中适温下便可恢复生长。
此法为菌种保存方法中最有效的方法。对一般生活力强的微生物或其孢子以及无芽孢细菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。但设备和操作都比较复杂，适用于菌种长期保存。
常用的几种典型的病原菌分离方法
1．斑点病原菌的分离 从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移臵培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离 从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。，用灭菌水冲洗几次，移臵培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离 根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离 多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5． 种子内病原菌分离 将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移臵培养基上。
6．孢子分离法 能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术
一、目的要求
了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理
单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，臵适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器
1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)
(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
(2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。
(3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。
(4) 玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularia lunata)。
2．培养基 PDA斜面培养基、水琼脂培养基。
3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70％酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝锅等。
四、实验操作
(一) 利用震落法进行单孢分离
(1) 用无菌操作将熔化后冷却到60～70℃的水琼脂培养基约10 ml倒入灭菌培养皿内，凝固成平板备用。
(2) 按无菌操作要领，将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30～45°角度，将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好，以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动，使孢子稀疏地落到平板表面，振落时宁轻勿重，以防过多孢子落于水琼脂平板表面。
提示：振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。
(3) 将水琼脂平板翻转后臵于显微镜载物台上，用低倍镜(10×
10)寻找平板表面上的单个孢子。找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上，点涂一个圆点作为标志。
提示：可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后，待多数孢子开始萌发时再进行检查，这时较易观察，且可以保证孢子具有萌发和生长能力。
(4) 将水琼脂平板从载物台上取下，按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上，用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌，再臵于25℃恒温箱培养。
(5) 数日后如果斜面培养基上生出菌丝，并形成孢子，经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的，则此菌种即是经单孢分离获得的纯菌株。
(二) 利用稀释法进行单孢分离
(1) 用灭菌水配制孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液中有20～30个左右孢子时，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25％乳酸1～2滴)。
(2) 将已熔化好并冷却到45～50℃的水琼脂培养基约10 ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。
(3) 以振落法相同步骤操作，即可获得单孢系菌种。
(三) 利用直接挑取法进行单孢分离
(1)、挑孢针的制作。把直径为3～4 mm，长约15 cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔，将一个4号昆虫针尾部插入，把针尖部2 mm左右弯折90°而成。
提示：用金属材料制作的挑孢针灭菌容易，不易碰碎，可以长期使用。
(2) 把玉米大斑病病叶臵于解剖镜下，寻找目标孢子。可以先在低放大倍率(1×10)下寻找，在高放大倍率(4×10)下，观察是否为单个孢子。
(3) 找到分生孢子后，将挑孢针在酒精灯上高温灭菌，待稍冷却，用挑孢针把孢子粘上，在酒精等火焰上方移入试管斜面培养基上。25培养3～5 d后，观察是否长出纯菌落。
提示：挑孢针在挑取孢子时如果不易黏取，可以先将挑孢针在培养基上轻轻划一下，增加黏性；如果在病叶上目标真菌孢子大量成堆，或周围有其他杂菌的孢子不易分开时，可以取一个干净的载玻片，用挑孢针挑取一些孢子，在载玻片上轻轻碰击，使孢子互相散开，然后在解剖镜下寻找单个孢子，挑取分离。如果进行专性寄生菌的单孢分离，用挑孢针把孢子放在其寄主植物上即可获得单孢菌系。
五、实验作业
上交分离得到的单孢系菌种。
六、思考题
1．如采用在水琼脂平板上用孢子悬液划线后再寻找单孢的方法能否进行；单孢分离?
2．设想还可以采用什么样的方法进行真菌的单孢分离?
3. 用组织法分离长出菌落后，如果多个菌落混杂在一起如何进行进一步的分离纯化?
4. 想一想直接挑取法除了进行单孢分离外还有其他什么用途?
5．单孢子分离技术有哪些优点?
附录3 真菌和细菌的菌种保藏
病原生物纯培养的保存和贮藏技术是比较复杂而十分重要的。在实际研究工作中，经常需要将保存的菌种与一些已知的或已鉴定过的标准菌种对比。而被研究的分离物，一旦鉴定结束，也应妥善保存和贮藏，以便今后进一步研究和对比之用。菌种纯培养的保存和贮藏中最重要的是如何保存这众多的分离物，使之不会因贮藏条件不妥而死亡，不因保存方法不当而发生变异，不被其他生物污染，能长期保存其生命力和原有性状不变。为达此目标，通常都采用部分抑制或完全抑制病原生物的生长和代谢活动的方式以延长其存活期，并减少变异。常用保藏方法有：
1．室温保存 许多真菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温(10～15℃)条件下，放在玻璃橱内即可。对于鞭毛菌亚门的真菌，只适宜用这种方法保存，但每隔2～3个月，就要移植一次。为了防止真菌在培养保存过程中致病力的退化和变异(如失去致病力，菌丝体变为黏液状，或失去产孢能力等)，常使用天然培养基，尽量减少糖的用量，有的直接放在灭菌的土壤中保存。室温保存的优点是简便易行，无需特殊设备，缺点是培养基易干燥，每1～3个月需要移植一次。
2．低温保存 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包好，移至2～8℃的冰箱中保藏，是最常用的保存菌种的方法。保藏时间依微生物的种类而有不同。真菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移植一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移植一次。此法为实验室和工厂菌种室常用，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备。缺点是容易变异。因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，致使微生物的代谢改变而影响了微生物的性状，并且需要屡次传代。若菌种经常使用，而条件不变，宜应用此
法。如能放在-20℃或-60℃冰箱中或液氮罐中，则存活期 可以更长。但是放在-20℃或-60℃冰箱中的材料，尤其是放在液氮中的培养物外面必须密封，以防冻裂或破损。
3．石蜡油保存 利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，
其油面高度应超过斜面顶部lcm，以隔绝斜面上菌种与空气接触，使之处于无氧条件下，以抑制菌种的生长与代谢活动，而培养基也不会干燥。这是许多真菌菌种的保存方法，效果好(一般可保藏2年以上不死)而成本低。无芽孢的细菌也可保存一年左右。加入石蜡油的菌种管可以放在室温下，也可放在冰箱中。当重新需要菌种时，只要用接种钩从油面下钩取小块菌体重新放在斜面或平板上即可恢复生长。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移植。缺点是保存时必须直立放臵，所占位臵较大，同时也不便携带。
4．灭菌蒸馏水悬浮保存 土壤浸液和蒸馏水，经过灭菌以后，把细菌菌苔悬浮到这些液体中，密封后保存在冰箱中，其存活期可长达10年，是很理想而简易的保存方法。
几乎所有的真菌均可采用蒸馏水保存法，即把子板上生长的菌丝切成小块，连同培养基一起放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后放在室温下即可长期保存。是目前最理想的保存方法。
5．干燥保存 许多菌种在干燥后就会死亡，但真菌的菌丝体和孢子，有芽孢的细菌等，经适当的干燥后可以长期存活。常用的干燥保存法是使用灭菌。速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。
(1) 以无菌的脱脂牛奶(作为保护剂，使蛋白质不致变性)将微生物制成细胞悬液，加入长颈球形底的小玻璃管内，此管又称安瓿。
(2) 将安瓿放在低温下冷冻。冷冻剂为干冰(固体二氧化碳)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃，将安瓿插入冷冻剂，只需冷冻4～5 min。
(3) 准备冷冻槽。槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。
(4) 安瓿放入冷冻槽中的干燥瓶内。
(5) 抽气 一般若在30min内，能达到102.67 Pa真空度时，则干燥物不致溶化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.66 Pa，保持压力6～8 h即可。
(6) 封口。抽真空干燥后，取出安瓿，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约l0min(即可达到26.66 Pa)，以在真空状态下封口。拟煤气喷灯的细火焰在安瓿颈中央进行封口。密封的安瓿管可盛放在冰箱中。
(7) 菌种的恢复生长。将安瓿管顶部用酒精消毒后，在火焰上加热，然后加一滴灭菌水使玻璃管炸裂，再向管中加入0.2 ml的灭菌水或蛋白胨水，静臵数分钟后，摇匀成悬浮液，吸出放在培养基平板上。臵温箱中适温下便可恢复生长。
此法为菌种保存方法中最有效的方法。对一般生活力强的微生物或其孢子以及无芽孢细菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。但设备和操作都比较复杂，适用于菌种长期保存。