鲟源致病性嗜水气单胞菌X1的分离

微生物学通报 AUG 20, 2008, 35(8): 1186~1191 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS

[email protected]

鲟源致病性嗜水气单胞菌X1的分离

鉴定与药敏特性研究

李圆圆* 曹海鹏* 何 珊 杨先乐**

(农业部渔业动植物病原库 上海海洋大学 上海 200090)

摘 要: 从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1, 其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 CFU/mL, 具有较强毒力; 菌株X1为革兰氏阴性杆菌, 菌体大小为1.0 μm~1.2 μm×2.1 μm~2.4 μm, 周生侧鞭毛, 在兔血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈, 经ATB细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析, 菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(登录号：EU669667); 其系统发育分析表明, 菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号：X74676.1)的亲缘关系最近, 其同源性为99％。此外, 菌株X1对先锋必、左氟沙星等2种药物高度敏感, 对妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、庆大霉素、复达欣、万古霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10种药物中度敏感。 关键词: 西伯利亚鲟, 嗜水气单胞菌, 鉴定, 药敏特性

Isolation and Identification of Aeromonas hydrophila Strain X1 from Acipenser baerii and Its Antibiotic Sensitivity

LI Yuan-Yuan* CAO Hai-Peng* HE Shan YANG Xian-Le**

(Aquatic Pathogen Collection Center of Ministry of Agriculture, SHOU, Shanghai 200090)

Abstract: A pathogenic bacterial strain X1 was isolated from Siberian sturgeon (Acipenser baerii) suffering with bacterial septicemia. The 50% lethal concentration (LC50) of strain X1 was 5.62×105 CFU/mL, which showed that strain X1 was rather strong virulent to Acipenser baerii. Strain X1 was gram negative and 1.0 μm~1.2 μm × 2.1 μm~2.4 μm in size with peritrichous flagella, and had β-hemolytic activity on rabbit blood agar. By means of ATB expression identification and 16S rDNA sequence analysis, strain X1 was identified as Aeromonas hydrophila (locus number: EU669667), which was the closest relative to Aeromo-nas hydrophila strain ATCC35654 (locus number: X74676.1) with 99% homology. In addition, strain X1 was highly sensitive to cefoperazone and cravit, and intermediately sensitive to ten kinds of antibiotics in-cluding tobramycin, norfloxacin, sulperazone, kanamycin, gentamycin, fortum, vancomycin, neomycina, polymyxin B and lomefloxacin.

基金项目：国家科技支撑计划资助项目(No. 2006BAD03B0506); 上海市优秀青年教师科研专项基金(No. B-8101-08-0017); 上海海洋大

学青年科研基金(No. 6690107251)

*共同第一作者

**通讯作者：Tel: 021-65710870; : [email protected] 收稿日期：2008-01-12; 接受日期：2008-04-25

李圆圆等: 鲟源致病性嗜水气单胞菌X1的分离鉴定与药敏特性研究

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Keywords: Acipenser baerii, Aeromonas hydrophila, Identification, Antibiotic sensitivity西伯利亚鲟(Acipenser baerii)隶属于鲟科(Acipenserdae)鲟属(Acipenser), 是现存26种鲟类中的一种, 主要分布于俄罗斯西部的颚毕河至东部的科雷马河之间的西伯利亚各河流之中[1]。西伯利亚鲟具有生长速度快、适应性强、肉质好、鱼籽酱品质高等优点, 已推广至德国、法国和匈牙利等国进行人工养殖[2]。西伯利亚鲟自1996年首次被中国引进, 目前其养殖量仅次于施氏鲟(Acipenser schren- ckii), 居中国鲟鱼养殖产量的第2位[3]。然而, 近年来病害的发生已成为鲟鱼养殖业可持续发展的瓶颈。因此, 关于鲟鱼病害的分离鉴定及其药敏特性等基础理论研究对鲟鱼病害的有效防治显得尤为重要。2006年6月中旬, 我国浙江省千岛湖鲟鱼养殖场的西伯利亚鲟感染了严重的以“肌肉、肾脏、性腺、肠道充血、出血, 肝脏有出血点, 肛门红肿并伴有血水流出”为主要病症的细菌性败血症, 本实验从自然发病的鲟鱼体内分离得到1株致病菌X1, 经人工回归感染试验和毒力试验证实该菌株具有较强致病力; 在此基础上, 在电镜下观察了菌株X1的形态, 分析了菌株X1的生理生化特性, 通过对菌株X1的16S rDNA序列分析构建了系统发育树, 采用生理生化鉴定和分子鉴定2种手段对该菌株进行了鉴定, 并进一步研究了其药敏特性, 以期丰富鲟鱼病原生物学特性, 为鲟细菌性病害的有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 鲟鱼来源

自然患病和健康的西伯利亚鲟, 体重50 g~70 g, 体长13 cm~16 cm, 均由浙江省千岛湖鲟鱼养殖基地提供。

1.2 致病菌的分离与鉴定

1.2.1 致病菌的分离：选取具有典型自然发病症状的濒死西伯利亚鲟, 用75%的酒精棉反复擦拭病鱼

体表后, 无菌操作取病鱼的肝、肾等病灶组织以及少量腹水, 分别于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基平板上划线分离, 于28℃下培养24 h后, 挑取优势单菌落划线纯化, 并接种于TSA培养基斜面上, 于4℃冰箱保存。

1.2.2 致病菌的人工回归感染试验：用无菌生理盐水分别刮下斜面保藏的各分离菌株的菌苔, 并将其菌悬液浓度稀释为2.2×107 CFU/mL, 然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染, 每尾注射剂量为0.2 mL。以注射等量无菌生理盐水的健康西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8 尾, 水温为19℃~22℃。连续7 d观察并记录实验鱼的病症及死亡数目, 同时对人工回归感染发病濒死的实验鱼进行病原菌再分离, 观察再分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致。

1.2.3 致病菌株毒力测定：将分离的致病菌株菌悬液分别稀释成2.2×104 CFU/mL、2.2×105 CFU/mL、2.2×106 CFU/mL、2.2×107 CFU/mL, 然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染, 每尾注射剂量为0.2 mL。以注射等量无菌生理盐水的健康西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8 尾, 水温为19℃~22℃。连续7 d观察并记录实验鱼的死亡数目, 并用概率单位图解法[4]计算半数致死浓度(LC50)。

1.2.4 病原菌的鉴定：将分离的致病菌株接种在兔血琼脂平板上, 于28℃下培养24 h, 观察有无溶血圈产生; 同时将新鲜培养的致病菌株进行革兰氏染色, 并用透射电镜对其形态进行观察。此外, 用ATB细菌鉴定仪对分离的致病菌株进行生理生化鉴定, 并测定其16S rDNA序列, 在NCBI中利用Blastn软件与GenBank + EMBL + DDBJ + PDB基因库中已知的16S rDNA序列进行同源性比较, 选取同源性较高的序列并利用BioEdit 7.0和Mega 4.0软件进行多重比较后构建系统发育树。

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微生物学通报

2008, Vol.35, No.8

1.3 致病菌药敏特性的测定

药敏试验采用KB纸片扩散法[4]。即以涂布法接种致病菌株, 然后将药敏纸片(购于杭州天和微生物制剂有限公司)贴在培养基上, 28℃培养24 h后, 测定抑菌圈直径(mm), 根据《现代诊断学手册》标准[5], 判断致病菌株对药物的敏感程度。

人工注射感染西伯利亚鲟后7 d, 西伯利亚鲟的死亡率高达100％(表1), 实验病鱼也表现出肛门红肿, 腹部充满血水, 肠道充血、出血等病症, 而且从人工回归感染濒死的病鱼体内又可分离到与菌株X1形态特征及理化特性一致的菌株。根据建立的实验鱼死亡率(％)与菌液浓度对数[ log(CFU/mL) ] 的关系曲线：y =36.25x 158.58(图1), 菌株X1对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 CFU/mL, 根据Devesa对鱼类致病菌毒力的划分标准[6], 可判定菌株X1对西伯利亚鲟具有较强的毒力。

2 结果

2.1 致病菌的分离

从自然发病的西伯利亚鲟体内分离到4 株优势菌株, 分别暂命名为X1、X2、X3、X4, 经过人工回归感染试验, 仅菌株X1对西伯利亚鲟具有致病性,

表

1 人工回归感染结果

Table 1 Results of artificial infection test of strain X1

菌株

Strain X1 X2 X3 X4

注射浓度

Concentration(CFU/mL)

2.2×10 2.2×10 2.2×107 2.2×107

77

鱼数 Number (尾)

8 8 8 8

1 d 2 0 0 0

2 d 4 0 0 0

死亡数目Death number(尾) 3 d 6 0 0 0

4 d 6 0 0 0

5 d 7 0 0 0

6 d 8 0 0 0

7 d 8 0 0 0

死亡率 Mortality(%)

100% 0 0 0

鉴定仪对菌株X1的生理生化鉴定结果表明(表2), 菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila), 鉴定结果的可信度为99%。通过NCBI网站搜索与菌株X1的 16S rDNA序列同源性高的各种菌的16S rDNA序列, 结果表明(表3), 菌株X1的16S rDNA序列与GenBank基因库中细菌菌株的同源性比较最为接近的菌株均为气单胞菌属(Aeromonas), 构建的系统发育树结果进一步表明(图4), 菌株X1(登录号：EU669667)与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号：

X74676.1)的亲缘关系最近, 其同源性为99％。综合

图1 鲟死亡率(％)与菌液浓度对数 ( log (CFU/mL)) 的

关系曲线

Fig. 1 The relation curve of sturgeon mortality with loga-rithm of bacterial concentration

2.2 致病菌的鉴定

菌株X1为革兰氏阴性杆菌, 大小约为1.0 μm~ 1.2 μm×2.1 μm~2.4 μm, 周生侧鞭毛(图2), 在兔血琼脂平板上可产生明显的β-溶血圈(图3)。ATB细菌

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图2 电镜下菌株X1的形态

Fig. 2 The morphological characteristics of strain X1 by electro microscope

图3 菌株X1在兔血琼脂平板上产生的β-溶血圈

Fig. 3 The beta hemolysis zone of strain X1 on rab-bit-blood agar plate

表2 ATB细菌鉴定仪对菌株X1的鉴定结果

Table 2 The identification of strain X1 by ATB bacteria identification instrument

测定项目Test item 氧化酶OX D-葡萄糖GLU 水杨素SAL D-蜜二糖MEL L-岩藻糖FUC D-山梨醇SOR L-阿拉伯糖ARA 丙酸盐PROP 癸酸盐CAP 戊酸盐VALT 甘露醇MAN

注：+：表示阳性; -：表示阴性

结果Result

+ + +   +   + +

测定项目Test item 柠檬酸盐CIT 组氨酸His

2-酮葡萄糖酸盐2 kg 3-羟基-丁酸盐30BU 5-酮基-葡萄糖酸盐5 kg 3-羟基-苯甲酸盐30BU 鼠李糖RHA

N-乙酰葡萄糖胺NAG L-脯氨酸Pro 肌醇INO L-丝氨酸Ser

结果Result

 +     + + +  +

测定项目Test item

蔗糖SAC 麦芽糖MAL 衣康酸ITA 辛二酸盐SUB 丙二酸盐MNT 乙酸盐ACE DL-乳酸盐LAT L-丙氨酸Ala 糖原GLYG

结果Result

+ +     + + +

Note: +: Denotes positivity; : Denotes negativity

表3 菌株X1的16S rDNA序列同基因库中细菌菌株同源性的比较

Table 3 The comparison of 16S rDNA sequence of strain X1 with high homological strains in GenBank

菌种名称Species

嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌脱色亚种

Aeromonas hydrophila subsp. decolorations 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 维隆气单胞菌Aeromonas veronii 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 中间气单胞菌Aeromonas media

菌种编号Strain number

ATCC49140

CCM7232 WAB1968 T20 WAB1877 ATCC35654 WAB1943 211c WAB1920 ATCC7966T

CDC

登录号Locus number

AY987754.1 AY686711.1 DQ207728.2 AM184287.1 AF099022.1 AM184219.1 X74676.1 AM184282.1 AY987746.1 AM184260.1 X74677.1 AY987773.1

分值Score 2579 2573 2567 2567 2567 2566 2560 2560 2556 2553 2549 2545

相似Identity(％)

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

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中间气单胞菌Aeromonas media 维隆气单胞菌Aeromonas veronii 中间气单胞菌Aeromonas media 斑点气单胞菌Aeromonas punctata 斑点气单胞菌Aeromonas punctata

微生物学通报

ATCC33907 HQ010516C ATCC37907T RK27611 WAB1928

X60410.1 DQ029351.1 X74679.1 AY987760.1 AM184267.1

2543 2532 2532 2518

2503

2008, Vol.35, No.8

99 99 99 98 98

形态与生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析结果, 菌株X1可鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。

鲟和达氏鳇的败血症进行过报道, 其主要病原为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)以及类志贺邻单胞菌(Plesio- monas shigelloides)[79]。但从现有文献资料来看, 国内尚无关于西伯利亚鲟细菌性病害的报道。本实验从患细菌性败血症的西伯利亚鲟体内分离得到4 株优势菌株, 其中仅菌株X1经人工回归感染试验证实其对西伯利亚鲟具有极高的致死率, LC50为 5.62×105 CFU/mL, 实验鱼发病症状与自然发病症状基本相同, 而且从人工回归感染的病鱼体内再次分离到与原致病菌株X1形态特征、理化特性一致

2.3 致病菌的药敏特性

菌株X1对30 种药物的敏感性实验结果表明(表4), 菌株X1仅对先锋必、左氟沙星等2 种药物高度敏感, 对妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、庆大霉素、复达欣、万古霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10 种药物中度敏感。

3 讨论

目前国内关于鲟鱼细菌性病害的报道不多, 仅杨治国、储卫华、曹海鹏等先后对俄罗斯鲟、杂交

图4 基于16S rDNA序列的系统发育树

Fig. 4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

表4 菌株X1的药物敏感性

Table 4 The antibiotic sensitivity of strain X1

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李圆圆等: 鲟源致病性嗜水气单胞菌X1的分离鉴定与药敏特性研究

药物 Antibiotics

妥布霉素Tobramycin 头孢呋肟CXM 氟哌酸Norfloxacin 舒普深Sulperazone 卡那霉素Kanamycin 先锋必Cefoperazone 庆大霉素Gentamycin 壮观霉素Spectinomycin 呋喃西林Furacilin 左氟沙星Cravit

敏感程度 Sensitivity

I R I I I S I R R S

药物 Antibiotics

新生霉素Novobiocin 安灭菌Augmentin 复达欣Fortum 氧哌嗪青霉素Avocin 青霉素Penicillin 氨苄青霉素Ampicillin 万古霉素Vancomycin 新霉素Neomycina 先锋V Cefalin V 多粘菌素BPolymyxin B

敏感程度 Sensitivity

R R I R R R I I R I

药物 Antibiotics

头孢西丁Cefoxitin 洛美沙星Lomefloxacin 氧氟沙星Ofloxacin 头孢拉啶Cefradine 先锋噻肟Cefaran 头孢噻吩Cefalotin 苯唑青霉素Bactocill 羧苄青霉素Carbenicillin 头孢孟多Cefamandole 特美汀Timentin

1191

敏感程度 Sensitivity

R I R R R R R R R R

注: S: 表示高度敏感( d >15 mm); I: 表示中度敏感(10 mm≤d≤15 mm); R: 表示低度敏感或不敏感(0 mm≤d

Note: S: Denotes high sensitivity (d >15 mm); I: Denotes moderate sensitivity (10 mm≤d≤15 mm); R: Denotes low or no sensitivity (0 mm≤d

的菌株, 由此证实菌株X1是该病的致病菌株。菌株X1经过形态学和生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析证实该菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydro-phila), 进一步证实了嗜水气单胞菌在鲟鱼人工养殖中的巨大危害性。

嗜水气单胞菌一般单鞭毛, 以极生鞭毛运动[10], 而本实验分离的嗜水气单胞菌X1为周生侧鞭毛, 与杨治国、储卫华等报道的嗜水气单胞菌分离株有明显不同[7,8], 是国内具有周生侧鞭毛的鲟源嗜水气单胞菌的首次报道。侧生鞭毛的形成, 可能与嗜水气单胞菌的flhA、lafK、fliJL、flgN、flgE和maf-5等基因有关[11]。Gavin等研究表明, 嗜水气单胞菌侧生鞭毛能够增强细菌的粘附能力, 是其群体运动和生物膜形成所必需的[12], 这与本实验分离的嗜水气单胞菌X1具有较强毒力的结果是一致的。

目前在细菌分类鉴定方法上, 基于细菌生理生化特性的ATB细菌鉴定系统操作方便, 结果准确, 但数据库中模式菌种数量有限, 部分细菌只能鉴定到属, 对革兰氏阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差; 而分子遗传学鉴定虽然可从本质上阐述细菌间的亲缘关系, 但专业性强, 鉴定时间长[13]。因此, 本实验在菌株X1的分类鉴定时, 将生理生化特性测定与16S rDNA序列分析鉴定相结合, 使鉴定方法更科学, 鉴定结果更可靠、更准确。但本实验发现, 嗜水

气单胞菌X1与沈锦玉等分离的嗜水气单胞菌TS6-2以及张晓君等分离的嗜水气单胞菌菌株在鼠李糖等生化特性方面有所差异[14,15]。出现这些差异, 可能是由于从不同地区和寄主体内分离到的菌株由于地区、气候、水质条件及实验室培养条件等方面的不同而产生的[16]。

本实验结果表明, 嗜水气单胞菌X1对先锋必、左氟沙星等2 种药物高度敏感, 对氟哌酸、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10 种药物中度敏感, 这与储卫华等从患细菌性败血症的俄罗斯鲟和杂交鲟体内分离到的嗜水气单胞菌XY-1的药敏特性有所不同[8], 与沈锦玉等分离的嗜水气单胞菌TS6-2、张晓君等分离的5 株嗜水气单胞菌的药敏特性也不尽相同[14,15]。产生这些药敏特性差异的原因可能是由于不同地方、不同环境中的菌株因接触不同的药物环境影响而产生耐药性变异[17]。此外, 本实验选取的药物并非均可用于生产, 在本实验中仅用于分析嗜水气单胞菌X1的药敏特性, 从嗜水气单胞菌X1的药敏实验结果来看, 嗜水气单胞菌X1对新生霉素、青霉素等水产常见抗生素已产生较强的耐药性, 这警示养殖者在鲟鱼养殖过程中要慎重使用渔用抗生素, 尽量防止细菌耐药性的产生与加重。

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微生物学通报

2008, Vol.35, No.8

参 考 文 献

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水渔业, 2003, 33(2): 1617.

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鉴定与药敏特性研究

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摘 要: 从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1, 其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 CFU/mL, 具有较强毒力; 菌株X1为革兰氏阴性杆菌, 菌体大小为1.0 μm~1.2 μm×2.1 μm~2.4 μm, 周生侧鞭毛, 在兔血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈, 经ATB细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析, 菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(登录号：EU669667); 其系统发育分析表明, 菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号：X74676.1)的亲缘关系最近, 其同源性为99％。此外, 菌株X1对先锋必、左氟沙星等2种药物高度敏感, 对妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、庆大霉素、复达欣、万古霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10种药物中度敏感。 关键词: 西伯利亚鲟, 嗜水气单胞菌, 鉴定, 药敏特性

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Abstract: A pathogenic bacterial strain X1 was isolated from Siberian sturgeon (Acipenser baerii) suffering with bacterial septicemia. The 50% lethal concentration (LC50) of strain X1 was 5.62×105 CFU/mL, which showed that strain X1 was rather strong virulent to Acipenser baerii. Strain X1 was gram negative and 1.0 μm~1.2 μm × 2.1 μm~2.4 μm in size with peritrichous flagella, and had β-hemolytic activity on rabbit blood agar. By means of ATB expression identification and 16S rDNA sequence analysis, strain X1 was identified as Aeromonas hydrophila (locus number: EU669667), which was the closest relative to Aeromo-nas hydrophila strain ATCC35654 (locus number: X74676.1) with 99% homology. In addition, strain X1 was highly sensitive to cefoperazone and cravit, and intermediately sensitive to ten kinds of antibiotics in-cluding tobramycin, norfloxacin, sulperazone, kanamycin, gentamycin, fortum, vancomycin, neomycina, polymyxin B and lomefloxacin.

基金项目：国家科技支撑计划资助项目(No. 2006BAD03B0506); 上海市优秀青年教师科研专项基金(No. B-8101-08-0017); 上海海洋大

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**通讯作者：Tel: 021-65710870; : [email protected] 收稿日期：2008-01-12; 接受日期：2008-04-25

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Keywords: Acipenser baerii, Aeromonas hydrophila, Identification, Antibiotic sensitivity西伯利亚鲟(Acipenser baerii)隶属于鲟科(Acipenserdae)鲟属(Acipenser), 是现存26种鲟类中的一种, 主要分布于俄罗斯西部的颚毕河至东部的科雷马河之间的西伯利亚各河流之中[1]。西伯利亚鲟具有生长速度快、适应性强、肉质好、鱼籽酱品质高等优点, 已推广至德国、法国和匈牙利等国进行人工养殖[2]。西伯利亚鲟自1996年首次被中国引进, 目前其养殖量仅次于施氏鲟(Acipenser schren- ckii), 居中国鲟鱼养殖产量的第2位[3]。然而, 近年来病害的发生已成为鲟鱼养殖业可持续发展的瓶颈。因此, 关于鲟鱼病害的分离鉴定及其药敏特性等基础理论研究对鲟鱼病害的有效防治显得尤为重要。2006年6月中旬, 我国浙江省千岛湖鲟鱼养殖场的西伯利亚鲟感染了严重的以“肌肉、肾脏、性腺、肠道充血、出血, 肝脏有出血点, 肛门红肿并伴有血水流出”为主要病症的细菌性败血症, 本实验从自然发病的鲟鱼体内分离得到1株致病菌X1, 经人工回归感染试验和毒力试验证实该菌株具有较强致病力; 在此基础上, 在电镜下观察了菌株X1的形态, 分析了菌株X1的生理生化特性, 通过对菌株X1的16S rDNA序列分析构建了系统发育树, 采用生理生化鉴定和分子鉴定2种手段对该菌株进行了鉴定, 并进一步研究了其药敏特性, 以期丰富鲟鱼病原生物学特性, 为鲟细菌性病害的有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 鲟鱼来源

自然患病和健康的西伯利亚鲟, 体重50 g~70 g, 体长13 cm~16 cm, 均由浙江省千岛湖鲟鱼养殖基地提供。

1.2 致病菌的分离与鉴定

1.2.1 致病菌的分离：选取具有典型自然发病症状的濒死西伯利亚鲟, 用75%的酒精棉反复擦拭病鱼

体表后, 无菌操作取病鱼的肝、肾等病灶组织以及少量腹水, 分别于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基平板上划线分离, 于28℃下培养24 h后, 挑取优势单菌落划线纯化, 并接种于TSA培养基斜面上, 于4℃冰箱保存。

1.2.2 致病菌的人工回归感染试验：用无菌生理盐水分别刮下斜面保藏的各分离菌株的菌苔, 并将其菌悬液浓度稀释为2.2×107 CFU/mL, 然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染, 每尾注射剂量为0.2 mL。以注射等量无菌生理盐水的健康西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8 尾, 水温为19℃~22℃。连续7 d观察并记录实验鱼的病症及死亡数目, 同时对人工回归感染发病濒死的实验鱼进行病原菌再分离, 观察再分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致。

1.2.3 致病菌株毒力测定：将分离的致病菌株菌悬液分别稀释成2.2×104 CFU/mL、2.2×105 CFU/mL、2.2×106 CFU/mL、2.2×107 CFU/mL, 然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染, 每尾注射剂量为0.2 mL。以注射等量无菌生理盐水的健康西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8 尾, 水温为19℃~22℃。连续7 d观察并记录实验鱼的死亡数目, 并用概率单位图解法[4]计算半数致死浓度(LC50)。

1.2.4 病原菌的鉴定：将分离的致病菌株接种在兔血琼脂平板上, 于28℃下培养24 h, 观察有无溶血圈产生; 同时将新鲜培养的致病菌株进行革兰氏染色, 并用透射电镜对其形态进行观察。此外, 用ATB细菌鉴定仪对分离的致病菌株进行生理生化鉴定, 并测定其16S rDNA序列, 在NCBI中利用Blastn软件与GenBank + EMBL + DDBJ + PDB基因库中已知的16S rDNA序列进行同源性比较, 选取同源性较高的序列并利用BioEdit 7.0和Mega 4.0软件进行多重比较后构建系统发育树。

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2008, Vol.35, No.8

1.3 致病菌药敏特性的测定

药敏试验采用KB纸片扩散法[4]。即以涂布法接种致病菌株, 然后将药敏纸片(购于杭州天和微生物制剂有限公司)贴在培养基上, 28℃培养24 h后, 测定抑菌圈直径(mm), 根据《现代诊断学手册》标准[5], 判断致病菌株对药物的敏感程度。

人工注射感染西伯利亚鲟后7 d, 西伯利亚鲟的死亡率高达100％(表1), 实验病鱼也表现出肛门红肿, 腹部充满血水, 肠道充血、出血等病症, 而且从人工回归感染濒死的病鱼体内又可分离到与菌株X1形态特征及理化特性一致的菌株。根据建立的实验鱼死亡率(％)与菌液浓度对数[ log(CFU/mL) ] 的关系曲线：y =36.25x 158.58(图1), 菌株X1对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 CFU/mL, 根据Devesa对鱼类致病菌毒力的划分标准[6], 可判定菌株X1对西伯利亚鲟具有较强的毒力。

2 结果

2.1 致病菌的分离

从自然发病的西伯利亚鲟体内分离到4 株优势菌株, 分别暂命名为X1、X2、X3、X4, 经过人工回归感染试验, 仅菌株X1对西伯利亚鲟具有致病性,

表

1 人工回归感染结果

Table 1 Results of artificial infection test of strain X1

菌株

Strain X1 X2 X3 X4

注射浓度

Concentration(CFU/mL)

2.2×10 2.2×10 2.2×107 2.2×107

77

鱼数 Number (尾)

8 8 8 8

1 d 2 0 0 0

2 d 4 0 0 0

死亡数目Death number(尾) 3 d 6 0 0 0

4 d 6 0 0 0

5 d 7 0 0 0

6 d 8 0 0 0

7 d 8 0 0 0

死亡率 Mortality(%)

100% 0 0 0

鉴定仪对菌株X1的生理生化鉴定结果表明(表2), 菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila), 鉴定结果的可信度为99%。通过NCBI网站搜索与菌株X1的 16S rDNA序列同源性高的各种菌的16S rDNA序列, 结果表明(表3), 菌株X1的16S rDNA序列与GenBank基因库中细菌菌株的同源性比较最为接近的菌株均为气单胞菌属(Aeromonas), 构建的系统发育树结果进一步表明(图4), 菌株X1(登录号：EU669667)与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号：

X74676.1)的亲缘关系最近, 其同源性为99％。综合

图1 鲟死亡率(％)与菌液浓度对数 ( log (CFU/mL)) 的

关系曲线

Fig. 1 The relation curve of sturgeon mortality with loga-rithm of bacterial concentration

2.2 致病菌的鉴定

菌株X1为革兰氏阴性杆菌, 大小约为1.0 μm~ 1.2 μm×2.1 μm~2.4 μm, 周生侧鞭毛(图2), 在兔血琼脂平板上可产生明显的β-溶血圈(图3)。ATB细菌

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图2 电镜下菌株X1的形态

Fig. 2 The morphological characteristics of strain X1 by electro microscope

图3 菌株X1在兔血琼脂平板上产生的β-溶血圈

Fig. 3 The beta hemolysis zone of strain X1 on rab-bit-blood agar plate

表2 ATB细菌鉴定仪对菌株X1的鉴定结果

Table 2 The identification of strain X1 by ATB bacteria identification instrument

测定项目Test item 氧化酶OX D-葡萄糖GLU 水杨素SAL D-蜜二糖MEL L-岩藻糖FUC D-山梨醇SOR L-阿拉伯糖ARA 丙酸盐PROP 癸酸盐CAP 戊酸盐VALT 甘露醇MAN

注：+：表示阳性; -：表示阴性

结果Result

+ + +   +   + +

测定项目Test item 柠檬酸盐CIT 组氨酸His

2-酮葡萄糖酸盐2 kg 3-羟基-丁酸盐30BU 5-酮基-葡萄糖酸盐5 kg 3-羟基-苯甲酸盐30BU 鼠李糖RHA

N-乙酰葡萄糖胺NAG L-脯氨酸Pro 肌醇INO L-丝氨酸Ser

结果Result

 +     + + +  +

测定项目Test item

蔗糖SAC 麦芽糖MAL 衣康酸ITA 辛二酸盐SUB 丙二酸盐MNT 乙酸盐ACE DL-乳酸盐LAT L-丙氨酸Ala 糖原GLYG

结果Result

+ +     + + +

Note: +: Denotes positivity; : Denotes negativity

表3 菌株X1的16S rDNA序列同基因库中细菌菌株同源性的比较

Table 3 The comparison of 16S rDNA sequence of strain X1 with high homological strains in GenBank

菌种名称Species

嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌脱色亚种

Aeromonas hydrophila subsp. decolorations 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 维隆气单胞菌Aeromonas veronii 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 中间气单胞菌Aeromonas media

菌种编号Strain number

ATCC49140

CCM7232 WAB1968 T20 WAB1877 ATCC35654 WAB1943 211c WAB1920 ATCC7966T

CDC

登录号Locus number

AY987754.1 AY686711.1 DQ207728.2 AM184287.1 AF099022.1 AM184219.1 X74676.1 AM184282.1 AY987746.1 AM184260.1 X74677.1 AY987773.1

分值Score 2579 2573 2567 2567 2567 2566 2560 2560 2556 2553 2549 2545

相似Identity(％)

99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

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中间气单胞菌Aeromonas media 维隆气单胞菌Aeromonas veronii 中间气单胞菌Aeromonas media 斑点气单胞菌Aeromonas punctata 斑点气单胞菌Aeromonas punctata

微生物学通报

ATCC33907 HQ010516C ATCC37907T RK27611 WAB1928

X60410.1 DQ029351.1 X74679.1 AY987760.1 AM184267.1

2543 2532 2532 2518

2503

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99 99 99 98 98

形态与生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析结果, 菌株X1可鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。

鲟和达氏鳇的败血症进行过报道, 其主要病原为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)以及类志贺邻单胞菌(Plesio- monas shigelloides)[79]。但从现有文献资料来看, 国内尚无关于西伯利亚鲟细菌性病害的报道。本实验从患细菌性败血症的西伯利亚鲟体内分离得到4 株优势菌株, 其中仅菌株X1经人工回归感染试验证实其对西伯利亚鲟具有极高的致死率, LC50为 5.62×105 CFU/mL, 实验鱼发病症状与自然发病症状基本相同, 而且从人工回归感染的病鱼体内再次分离到与原致病菌株X1形态特征、理化特性一致

2.3 致病菌的药敏特性

菌株X1对30 种药物的敏感性实验结果表明(表4), 菌株X1仅对先锋必、左氟沙星等2 种药物高度敏感, 对妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、庆大霉素、复达欣、万古霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10 种药物中度敏感。

3 讨论

目前国内关于鲟鱼细菌性病害的报道不多, 仅杨治国、储卫华、曹海鹏等先后对俄罗斯鲟、杂交

图4 基于16S rDNA序列的系统发育树

Fig. 4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

表4 菌株X1的药物敏感性

Table 4 The antibiotic sensitivity of strain X1

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药物 Antibiotics

妥布霉素Tobramycin 头孢呋肟CXM 氟哌酸Norfloxacin 舒普深Sulperazone 卡那霉素Kanamycin 先锋必Cefoperazone 庆大霉素Gentamycin 壮观霉素Spectinomycin 呋喃西林Furacilin 左氟沙星Cravit

敏感程度 Sensitivity

I R I I I S I R R S

药物 Antibiotics

新生霉素Novobiocin 安灭菌Augmentin 复达欣Fortum 氧哌嗪青霉素Avocin 青霉素Penicillin 氨苄青霉素Ampicillin 万古霉素Vancomycin 新霉素Neomycina 先锋V Cefalin V 多粘菌素BPolymyxin B

敏感程度 Sensitivity

R R I R R R I I R I

药物 Antibiotics

头孢西丁Cefoxitin 洛美沙星Lomefloxacin 氧氟沙星Ofloxacin 头孢拉啶Cefradine 先锋噻肟Cefaran 头孢噻吩Cefalotin 苯唑青霉素Bactocill 羧苄青霉素Carbenicillin 头孢孟多Cefamandole 特美汀Timentin

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敏感程度 Sensitivity

R I R R R R R R R R

注: S: 表示高度敏感( d >15 mm); I: 表示中度敏感(10 mm≤d≤15 mm); R: 表示低度敏感或不敏感(0 mm≤d

Note: S: Denotes high sensitivity (d >15 mm); I: Denotes moderate sensitivity (10 mm≤d≤15 mm); R: Denotes low or no sensitivity (0 mm≤d

的菌株, 由此证实菌株X1是该病的致病菌株。菌株X1经过形态学和生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析证实该菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydro-phila), 进一步证实了嗜水气单胞菌在鲟鱼人工养殖中的巨大危害性。

嗜水气单胞菌一般单鞭毛, 以极生鞭毛运动[10], 而本实验分离的嗜水气单胞菌X1为周生侧鞭毛, 与杨治国、储卫华等报道的嗜水气单胞菌分离株有明显不同[7,8], 是国内具有周生侧鞭毛的鲟源嗜水气单胞菌的首次报道。侧生鞭毛的形成, 可能与嗜水气单胞菌的flhA、lafK、fliJL、flgN、flgE和maf-5等基因有关[11]。Gavin等研究表明, 嗜水气单胞菌侧生鞭毛能够增强细菌的粘附能力, 是其群体运动和生物膜形成所必需的[12], 这与本实验分离的嗜水气单胞菌X1具有较强毒力的结果是一致的。

目前在细菌分类鉴定方法上, 基于细菌生理生化特性的ATB细菌鉴定系统操作方便, 结果准确, 但数据库中模式菌种数量有限, 部分细菌只能鉴定到属, 对革兰氏阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差; 而分子遗传学鉴定虽然可从本质上阐述细菌间的亲缘关系, 但专业性强, 鉴定时间长[13]。因此, 本实验在菌株X1的分类鉴定时, 将生理生化特性测定与16S rDNA序列分析鉴定相结合, 使鉴定方法更科学, 鉴定结果更可靠、更准确。但本实验发现, 嗜水

气单胞菌X1与沈锦玉等分离的嗜水气单胞菌TS6-2以及张晓君等分离的嗜水气单胞菌菌株在鼠李糖等生化特性方面有所差异[14,15]。出现这些差异, 可能是由于从不同地区和寄主体内分离到的菌株由于地区、气候、水质条件及实验室培养条件等方面的不同而产生的[16]。

本实验结果表明, 嗜水气单胞菌X1对先锋必、左氟沙星等2 种药物高度敏感, 对氟哌酸、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10 种药物中度敏感, 这与储卫华等从患细菌性败血症的俄罗斯鲟和杂交鲟体内分离到的嗜水气单胞菌XY-1的药敏特性有所不同[8], 与沈锦玉等分离的嗜水气单胞菌TS6-2、张晓君等分离的5 株嗜水气单胞菌的药敏特性也不尽相同[14,15]。产生这些药敏特性差异的原因可能是由于不同地方、不同环境中的菌株因接触不同的药物环境影响而产生耐药性变异[17]。此外, 本实验选取的药物并非均可用于生产, 在本实验中仅用于分析嗜水气单胞菌X1的药敏特性, 从嗜水气单胞菌X1的药敏实验结果来看, 嗜水气单胞菌X1对新生霉素、青霉素等水产常见抗生素已产生较强的耐药性, 这警示养殖者在鲟鱼养殖过程中要慎重使用渔用抗生素, 尽量防止细菌耐药性的产生与加重。

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