酸奶菌种的分离及鉴定
乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。
目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。
保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius ）:长杆形，直径1-3mm 左右, 能产生大量的乳酸。酸碱度方面, 为耐酸或嗜酸性, 因低 pH能防止一些微生物的生长; 温度方面, 为嗜温至少许嗜热, 最适生长温度在37-45℃之间, 对低温非常敏感。 嗜热链球菌（S.thermophilus ）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。 本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。
一、 实验内容
（1） 乳酸菌的分离纯化
1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养
2．菌落观察与镜检
3．筛选生产用菌株
（2） 优化酸奶制作条件
1．制备发酵液
2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产
3．观察发酵情况
4．品尝发酵产品，进行质量评价
5．记录结果
二、 实验器材
1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）
2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇) 、酵母膏、琼
脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香
柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；
0.4gNaOH 固体、4.2ml 浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼
脂30g
香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g ；
3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH
试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml 三角瓶（带玻珠）、移
液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线
绳、标签、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml 烧杯、酒精灯、石棉网、接
种针（环）、擦镜纸
四、实验方法
4.1乳酸菌的分离纯化
4.1.1分离
(1) 配制BCG 牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。
BCG 牛乳培养基配制
A 溶液：脱脂乳粉100g, 水500ml ，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG ）乙醇溶液1ml ，80℃灭菌20min 。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG ）乙醇溶液用1.6g 溴甲酚绿加入20ml 无水乙醇中，再加水至100ml 制成）
B 溶液：酵母膏10g ，水500ml ，琼脂20g ，PH6.8，121℃湿热灭菌20min 。
以灭菌操作趁热将A 溶液和B 溶液混合均匀后倒平板。
（2）样品的处理
按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml 检样，放入装有90ml 无菌水的三角瓶内，振摇混匀。
（3）分离方法
①倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min 后，每培养皿倾注约15ml 左右已溶化的BCG 牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。
②十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。
③分离
在BCG 牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h 。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
4.1.2鉴别
（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。
脱脂乳试管培养基成分：20g 脱脂奶粉，285ml 灭菌水。
配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。
（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h 。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h 能凝固的牛乳管，作菌种待用
4.2优化酸奶制作条件
（1）乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min ，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g ，无菌水100ml ，蔗糖6g 。
（2） 接种
将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装12瓶，将瓶盖拧紧密封。
（3） 发酵
将接种后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培养箱中培养2或4h 时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h 以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）, 凝块均匀致密, 无乳清晰出, 无汽泡, 获得较好口感和特有风味。
（4） 发酵产物鉴定——纸层析法 将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上， 40℃培养48h 。取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。展开剂：水30mL 、 苯甲醇150mL 、 正丁醇150mL 、甲酸3.3mL 。 显色剂 ： 将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L 的 NaOH调pH 到6.7。显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf 值，确定发酵产物中是否有乳酸
五、预期结果
1．分离鉴定获得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌
2．获得酸奶制作的最佳条件
六、实验进度
酸奶菌种的分离及鉴定
乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。
目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。
保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius ）:长杆形，直径1-3mm 左右, 能产生大量的乳酸。酸碱度方面, 为耐酸或嗜酸性, 因低 pH能防止一些微生物的生长; 温度方面, 为嗜温至少许嗜热, 最适生长温度在37-45℃之间, 对低温非常敏感。 嗜热链球菌（S.thermophilus ）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。 本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。
一、 实验内容
（1） 乳酸菌的分离纯化
1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养
2．菌落观察与镜检
3．筛选生产用菌株
（2） 优化酸奶制作条件
1．制备发酵液
2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产
3．观察发酵情况
4．品尝发酵产品，进行质量评价
5．记录结果
二、 实验器材
1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）
2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇) 、酵母膏、琼
脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香
柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；
0.4gNaOH 固体、4.2ml 浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼
脂30g
香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g ；
3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH
试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml 三角瓶（带玻珠）、移
液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线
绳、标签、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml 烧杯、酒精灯、石棉网、接
种针（环）、擦镜纸
四、实验方法
4.1乳酸菌的分离纯化
4.1.1分离
(1) 配制BCG 牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。
BCG 牛乳培养基配制
A 溶液：脱脂乳粉100g, 水500ml ，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG ）乙醇溶液1ml ，80℃灭菌20min 。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG ）乙醇溶液用1.6g 溴甲酚绿加入20ml 无水乙醇中，再加水至100ml 制成）
B 溶液：酵母膏10g ，水500ml ，琼脂20g ，PH6.8，121℃湿热灭菌20min 。
以灭菌操作趁热将A 溶液和B 溶液混合均匀后倒平板。
（2）样品的处理
按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml 检样，放入装有90ml 无菌水的三角瓶内，振摇混匀。
（3）分离方法
①倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min 后，每培养皿倾注约15ml 左右已溶化的BCG 牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。
②十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。
③分离
在BCG 牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h 。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
4.1.2鉴别
（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。
脱脂乳试管培养基成分：20g 脱脂奶粉，285ml 灭菌水。
配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。
（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h 。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h 能凝固的牛乳管，作菌种待用
4.2优化酸奶制作条件
（1）乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min ，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g ，无菌水100ml ，蔗糖6g 。
（2） 接种
将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装12瓶，将瓶盖拧紧密封。
（3） 发酵
将接种后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培养箱中培养2或4h 时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h 以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）, 凝块均匀致密, 无乳清晰出, 无汽泡, 获得较好口感和特有风味。
（4） 发酵产物鉴定——纸层析法 将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上， 40℃培养48h 。取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。展开剂：水30mL 、 苯甲醇150mL 、 正丁醇150mL 、甲酸3.3mL 。 显色剂 ： 将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L 的 NaOH调pH 到6.7。显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf 值，确定发酵产物中是否有乳酸
五、预期结果
1．分离鉴定获得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌
2．获得酸奶制作的最佳条件
六、实验进度