《中药化学实验讲义》
实验须知
中药化学实验教学是中药化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。为此，提出下列实验须知：
1．遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。
2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，贴上标签（日期、样品名称、纯度、mp 、bp 、TLC 、重量）交给老师。
3．实验室中保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内，废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。
4．公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电、药用试剂。严格药品用量。
5．保持实验室内整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。
实验一 薄层板的制备、活度测定及应用
一、目的要求
1．掌握硅胶薄层板的制备及薄层层析的操作方法
2．掌握硅胶薄层活度的测定方法
3．应用薄层层析法检测识中草药化学成分
二、实验材料
薄层层析用硅胶G ，硅胶F ，羧甲基纤维素钠，0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene ），苏丹红（Sudan Ⅲ），靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline ），苯，微量点样管，10×20cm 玻璃板20块，碾钵7套。
三、实验操作
（一）薄层板的制备
1．硅胶薄层的制备
（1）硅胶G 薄层 取硅胶G 或硅胶GF 一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。
（2）硅胶（H ）羧甲基纤维钠（CMC-Na ）薄层 CMC-Na 系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5~1%浓度（常用0.8%），宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。
取薄层层析用硅胶，按1：3~3.5的比例加入羧甲基纤维素钠溶液顺时针方向搅拌混合并排除气泡，按照硅胶G 薄层涂布法制备薄层，让其自然阴干，100℃下活化30分钟。活化温度不应过高，防止碳化。冷后于干燥器内备用。
注：国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G （G 是Gypsum 石膏的缩写。表示加了石膏），硅胶H （H 表示不加石膏），硅胶GF254（F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰）。硅胶GF365（表示加石膏和波长365nm 显黄色荧光的硫化锌镉）。
2．特殊薄层的制备
根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。
（1）酸、碱薄层和pH 缓冲薄层
为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铅薄层使用，硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1~0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH 的缓冲液代替水铺层，制成一定pH 缓冲的薄层。
（2）络合薄层
硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G 薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。
（二）、吸附剂的活度测定
1．硅胶活度的测定
一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。
欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene ）。苏丹红（Sudan Ⅲ），靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10μl点滴于硅胶G 或硅胶H 薄层上，以苯为展开剂，展开10cm （约20分钟），三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。
2．氧化铝活度的测定
一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。
染料试剂的配制：取偶氮苯（Azobenzene ）50mg ，对甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene ）, 苏丹黄（Sudan I, Benzeneazo-β-naphthol ），苏丹红（Sudan Ⅲ Tetrazobenzol-β-naphthol ），对氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene ）各20mg ，分别溶于50ml 重蒸馏的四氯化碳（经氢氧化钠干燥）中。
常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm 左右轻轻点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml 染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°之间，展开后测出各斑点的Rf 值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。
另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。观察有无变化。
表1 氧化铝活度与偶氮染料外值关系
偶氮染料
偶氮苯
苏丹黄
苏丹红
对氨基偶氮苯 氧化铝活度级Rf 值 二级 0.59 0.02 0.00 0.00 三级 0.72 0.45 0.25 0.10 0.05 四级 0.85 0.69 0.87 0.35 0.08 五级 0.95 0.89 0.98 0.50 0.19 对甲氧基偶氮苯 0.16
（三）、薄层层析的应用
薄层层析法在中药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。
实验操作：蒽醌类成分的鉴别
三、思考题
1. 为何在铺板之前，色谱用的玻璃板要完全洗净并干燥？
2. 为何铺好的TLC 板用前要在烘箱中干燥？
试验二 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定
（一）概述
大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。 自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll ）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种： R 1
2
晶 形 黄色针晶
橙色细针晶 熔 点 318~320℃ 206~208℃
196℃
256~257℃
207℃ R 1 -H -H -H -CH 3 -CH 3
R 2 -COOH -CH 2OH -CH 3 -OH - 名 称 大黄酸(Rhein) 芦荟大黄素(Aloe-emodin) 大黄酚(Chyrsophanol) 金色片状结晶 大黄素(Emodin) 大黄素甲醚(Physcion) 橙色针晶 砖红色针晶
大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH ，酸性最强；大黄素连有β-OH ，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH ，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH 3和-CH 3，后者只连有-CH 3，因而后者酸性排在第四位。
（二）实验目的和要求
1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。
2．掌握PH 梯度法的原理及操作技术。
3．学习蒽醌类化合物鉴定方法。
（三）实验方法
实验试剂及试药：
大黄药材粗粉2Kg ，氯仿500ml 10瓶，浓硫酸2瓶，冰醋酸，乙醚，苯，乙酸乙酯，碳酸钠（5% Na 2CO 3溶液3000ml ），碳酸氢钠（5% NaHCO 3溶液3000ml ），氢氧化钠（5% NaOH溶液1000ml ），氢氧化钾，醋酸镁试剂，
实验仪器设备：
500ml 圆底烧瓶15个，冷凝回流管15只，500ml-1000ml 分液漏斗15只，500ml 烧杯30只，100-250ml 量筒15只，常压漏斗（5-10cm 斗径15只），定性滤纸（10cm ）2盒，毛细管点样器1盒，玻璃喷瓶4套，广谱PH 试纸7盒，纱布一卷
多孔水浴锅，旋转蒸发仪
1．大黄总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉（100g ）加20%H2SO 4水溶液200ml ，氯仿500ml ，
水浴回流4hr ，过滤，测量滤液体积。
残渣
氯仿提取液（约450ml ）
注意：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。
2．总蒽醌苷元的分离与精制
大黄酸的分离与精制
将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml 移至1000ml 的大分液漏斗中，加PH8缓冲液（5% NaHCO3溶液）275ml 振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml 烧杯中，加HCl 酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml 加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。
大黄素的分离与精制
将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液（5%NaCO3溶液）275ml 振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl 酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml 冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。
芦荟大黄素的分离和精制
余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 碱水液540ml 或用
0.5%KOH540ml振摇萃取，碱水液加HCl 酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml 乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。
3. 鉴定
1. 化学检识：分别取总蒽醌提取物少许，用乙醚溶解，做如下反应：
A ：碱液试验：取试液1ml ，加20%NaOH数滴，观察颜色。
B ．醋酸镁反应：取试样1ml ，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。
2．薄层鉴定：
吸附剂：硅胶-CMC
展开剂：C 6H 6-EtOAc(3:2或97：9) 。
显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH喷雾。
（四）实验指导
1．本实验讲解要点及注意事项。
① PH梯度萃取的原理及注意事项。
② 如何设计萃取分离方案的程序与方法。
③ 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl 3，回洗碱水液。
⑤ 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。
2．实验报告要求
① 记录大黄总蒽醌的提取方法及总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量）。
② 总蒽醌的显色鉴别结果。
③ 记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及薄层色谱鉴别结果。
实验三 槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
芦丁（Rutin ）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。
芦丁是由槲皮素（Quercetin ）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose ）〔为葡萄糖（Glucose ）与鼠李糖（Rhamnose ）组成的双糖〕脱水合成的苷。为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P 样作用。可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用
作防治高血压病的辅助治疗剂。现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。
一、实验目的
1．通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2．掌握芦丁的一种提取、精制方法及提制过程中防止甙水解的方法。
3. 掌握黄酮甙水解生成甙元的方法及二者之间的分离。
4．熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法和纸层析鉴定方法。
二、实验原理
本实验主要是利用芸香苷中含有较多的酚羟基，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出芸香苷结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芸香苷对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。
三、实验材料
槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、1％的氢氧化钠溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液、1％的葡萄糖溶液、1％的鼠李糖溶液、1％芸香苷乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、碳酸钡、广泛pH 试纸、中速层析滤纸等。
四、实验内容
（一）提取：
称取槐米30g ，在乳钵中研碎后，投入300ml0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分钟，在搅拌下加入石灰乳调pH9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8~9），趁热倾出上清液, 用棉花过滤。残渣加100ml 水，加石灰乳调pH9，煮沸30分钟，趁热用棉花过滤，二次滤液合并。滤液保持在60℃，加浓HCl ，调pH2-3，放置过夜，则析出芦丁沉淀。
加0.4％硼砂水溶液200ml ，在搅拌下加石灰乳调pH 值至8~9，加热，煮沸15min ，随时补充失去的水分，保持pH8~9，倾出上清液，用四层纱布过滤；同样操作再提取一次。合并两次滤液，放冷，并用盐酸调pH 至2~3，放置过夜，待析出结晶，过滤，滤饼用蒸馏水洗至pH5-6，抽干，置空气中晾干，得粗制芸香苷，称重，计算得率。
（二）精制：
将芸香苷粗品悬浮于蒸馏水中，煮沸至芸香苷全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分钟，趁热抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤至干，置空气中晾干，或60~70℃干燥，得精制芸香苷，称重，计算得率。
（三）芸香苷的水解：
取芸香苷1g ，研碎，加2％硫酸水溶液80ml ，小火加热，微沸回流30-60min ，并及时补充蒸发掉的水分。在加热过程中，开始时溶液呈浑浊状态，约10min 后，
溶液由浑浊转为澄清，逐渐析出黄色小针状结晶，即水解产物槲皮素，继续加热至结晶物不再增加时为止。抽滤，保留滤液20ml ，以检查滤液中的单糖。所滤得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70％乙醇80ml 加热回流使之溶解，趁热抽滤，放置析晶。抽滤，得精制槲皮素。减压下110℃干燥，可得槲皮素无水物。
(四) 芸香苷、槲皮素及糖的检识
1．颜色反应
① α-萘酚-浓硫酸（Molisch ）试验：
取芸香苷少许置于试管中，加乙醇1ml 振摇，加α-萘酚试剂2~3滴振摇，倾斜试管，沿管壁徐徐加入0.5ml 浓硫酸，静置，观察两层溶液界面变化，出现紫红色环者为阳性反应，表示试样的分子中含有糖的结构，糖和甙类均呈阳性反应，比较芸香苷和槲皮素的不同。
②盐酸-镁粉试验：
取芸香苷少许置于试管中，加5％乙醇2ml ，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50mg ，即产生剧烈的反应。溶液逐渐由黄色变为红色。
③ 三氯化铁试验
取样品水或乙醇液，加入三氯化铁试剂数滴，观察颜色变化。
④三氯化铝试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％三氯化铝甲醇试剂2~3滴，呈鲜黄色。以同样方法试验槲皮素。
⑤醋酸镁试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％醋酸镁甲醇试剂2~3滴，呈黄色荧光反应。以同样方法试验槲皮素（反应也可在滤纸上进行，观察荧光）。
⑥ 氧氯化锆-枸橼酸试验：
取芸香苷少许置于试管中，加甲醇1~2ml，在水浴上加热溶解，再加2％氧氯化锆甲醇试剂3~4滴，呈鲜黄色。然后加2%枸橼酸甲醇试剂3~4滴，黄色变浅，加蒸馏水稀释变无色。以同样方法试验槲皮素进行对照。
⑦ 氢氧化钠试验：
取芸香苷少许置于试管中，加水2ml 振摇，观察试管中有无变化。滴加1％氢氧化钠溶液数滴，振摇使溶解，呈黄色澄清溶液。再加入1％盐酸溶液数滴使呈酸性反应，则溶液由澄清转为浑浊状态。
2．色谱检识
(1) 槲皮素和芦丁的薄层鉴定
①聚酰胺薄层色谱：
固定相：聚酰胺薄层板
样品：a 精制芦丁 b 芦丁标准品 c 精制槲皮素
展开剂：氯仿—甲醇—丁酮—乙酰丙酮：(16：10：5：1)
显色：
a 可见光下观察色斑，再于紫外灯下观察荧光斑点
b 喷洒AlCl3乙醇液后观察。
②硅胶薄层色谱
吸附剂：硅胶G ，105℃下活化2h
展开剂：a. 氯仿：甲醇：甲酸（15：5：1）
b. 氯仿：丁酮：甲酸（5：3：1）
显色剂：1%FeCl3和1%K3[Fe（CN ）6]水溶液，应用时等体积混合。
(2) 芸香苷和槲皮素的纸色谱检识：
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样 品：自制1％芸香苷乙醇溶液
自制1％槲皮素乙醇溶液
对照品：1％槲皮素标准品与1％芸香苷标准品乙醇溶液
展开剂：a. 正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
b. 15％醋酸水溶液
展距：10-15cm
显色：a. 在可见光下观察斑点颜色，再在紫外灯下观察斑点颜色
b. 喷三氯化铝试剂呈黄色斑点
c ．经氨气熏后再于可见、紫外下观察。
(3) 糖的纸色谱检识：取上述芸香苷水解后的母液20ml ，加入氢氧化钡细粉（约
2.6g ）中和至pH7，滤除生成的硫酸钡沉淀（可用滑石粉助滤）。滤液中水浴中浓缩至1~2ml，供纸色谱点样用。
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样 品：水解浓缩液
对照品：a. 葡萄糖标准品水溶液
b. 鼠李糖标准品水溶液
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
显 色：a. 喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃加热10min ，显棕色或棕红色斑点 b. 喷氨性硝酸银试剂，于100℃左右加热，呈棕褐色斑点。
五、实验说明及注意事项
1．本实验采用碱溶酸沉法从槐米中提取芸香苷，收率稳定，且操作简便。在提取前应注意将槐米略捣碎，使芸香苷易于被热水溶出。槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使生成钙盐沉淀除支。pH 应严格控制在8-9，不得超过10。因为在强
碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香甙水解破坏，使提取率明显下降。酸沉一步pH 为2-3，不宜过低，否则会使芸香甙形成盐溶于水，降低了收率。
2．提取过程中加入硼砂水的作用：即能调节碱性水溶液的pH ，又能保护芸香甙分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香甙不受损失。
3．芸香甙的提取方法除了用碱溶酸沉法外，还可利用芸香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。又报道将生产工艺改进为95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后将粗浸膏经除去脂溶性杂质后，用水洗净，过滤，干燥即得芸香甙，可提高收率6．96%，并降低了成本。因此可根据不同原料采用各种不同方法提取。
4．槲皮素以乙醇重结晶时，如所用的乙醇浓度过高（90％以上），一般不易析出结晶。此时可于乙醇溶液中滴加适量蒸馏水，使呈微浊状态，放置，槲皮素即可析出。
六、思考题
1．本实验提取过程中应注意哪些问题？
2．根据芸香苷的性质还可采用何种方法进行提取？简要说明理由。
七、参考文献
1．海药物研究所：中草药有效成分的提取和分离 234—240页
2．中国医学科学院药物研究所：中草药有效成分的研究(第一分册)219—225 1972
3．日本药学杂志，72(333) 1952；76(1210) 1956，80(304) 1960；80(698) 1960
4．Chem ， Pharm ． Bull ， ll (167)， 1963
实验四 黄连中盐酸小檗碱的提取、精制和鉴定
黄连为毛莨科黄连属植物黄连、三角叶黄连或云连等的干燥根茎。具有清热燥湿、清心除烦、泻火解毒的功效。黄连的有效成分主要是生物碱，已分离出的主要有：小檗碱（Berbenie ），又名黄连素，巴马丁、黄连碱，甲基黄连碱、药根碱、表木兰碱等，其中以小檗碱含量最高，可达10%左右，且以盐酸盐的状态存在于黄连中。小檗碱盐酸对痢疾杆菌、葡萄球菌和链球菌等均有显著抑制作用，临床用于治疗细菌性痢疾和胃肠炎等，无耐药性和副作用。
一、 实验目的：
1、掌握盐酸小檗碱的一种提取方法，熟悉盐析法、重结晶法。
2、掌握小檗碱的结构特点，特殊的理化性质和薄层鉴定方法。
3、通过实验熟悉和掌握柱层析法的分离原理及操作技能。
二、 小檗碱的结构及性质
小檗碱为黄色长针状结晶，具5.5个结晶水，m.p145℃，能缓缓溶于冷水中（1：20），微溶于冷乙醇（1：100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，与酸结合成盐时失去一分子水，其硝酸盐和氢碘酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水，较易溶于沸水，其硫酸盐，构椽酸盐在水中溶解度较大。盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃左右分解为棕红色小檗红碱，285℃左右完全溶融，UV λmax265nm ，343nm 。游离小檗碱易和1分子丙酮或1分子氯仿或1.5分子苯结合成一黄色络合物晶体。
三、 实验原理
本实验利用小檗碱与含氧酸（硝酸例外）所成盐在水中溶解度较大的性质，采用稀硫酸将其以硫酸盐形式提取出来，再根据小檗碱与氢卤酸所成盐在水中溶解度较小的特点，在将小檗碱游离后，加入盐酸使其形成盐酸盐，结合成盐析法，使之沉淀析出。
四、 实验内容
1、提取
取黄连粗粉25克，加入0.2%H2SO 4液200ml 加热煎煮1小时（注意随时补充蒸发损失的溶剂），纱布过滤，残渣再加0.2%H2SO 4液200ml 加热煎煮45分钟，纱布过滤，两次滤液合并。向滤液中加入石灰乳调节pH12，抽滤，再向抽滤所得的滤液中滴加浓HCl ，调节pH2-3，然后加入8%（W/V）氯化钠，搅拌并使完全溶解，并继续搅拌至溶液出现微浊现象为止，放置过夜。则有盐酸小檗碱沉淀析出。
2、分离及精制
抽滤，得盐酸小檗碱粗品，水洗，加适量蒸馏水加热溶解，趁热抽滤，滤液放置，则有盐酸小檗碱结晶析出。再进行重结晶：即滤取结晶，加入适量乙醇，水浴加热溶解，趁热抽滤，滤液放置结晶。待盐酸小檗碱析出完全后，滤出，80℃干燥，得成品。
3、盐酸小檗碱的检识
（1）取盐酸小檗碱少许，加10%稀硫酸适量使之溶解后，加入一点漂白粉，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加热使期溶于水中，加10%NAOH使呈强碱性，然后滴加丙酮数滴，可见有黄色结晶性的小檗碱丙酮加成物生成。
4、薄层层析鉴定
薄层板：硅胶G-CMC 板
样品：实验所得精制盐酸小檗碱的醇溶液
对照品：1%盐酸小檗碱的醇溶液
展开剂：氯仿：甲醇=7：2，氨水饱和20分钟
展距：10cm
显色：自然光下观察
结果：计算Rf 值
5、柱层析分离
吸附剂：12克氧化铝（80-100目）
层析柱：1х40cm 玻璃柱（也可用碱式滴定管代替）
洗脱剂：95%乙醇
（1）氧化铝吸附柱的制备（湿法装柱）
取一根25cm 碱式滴定管代作层析管用，管的下端套一段约3-4cm 长的乳胶管，在乳胶管上夹一螺旋夹，以控制洗脱液流出速度。在层析管的下端填一层松紧合适平整的脱脂棉。将此层析管垂直地固定在铁架台上，关闭螺旋夹。
管内先加入一定体积的洗脱剂（此处用95%乙醇），打开螺旋夹，放出管内乙醇，将层析管下端的脱脂棉内的空气充分赶尽，然后再向层析管中加入一定体积的乙醇。
取中性氧化铝（100-200目）12克于烧杯中，加一定体积的乙醇调成浆状，赶尽其中气泡，然后通过小玻璃漏斗将浆状氧化铝徐徐注入注中，并同时打开下端螺旋夹，让洗脱剂缓缓流出，不断用手轻轻振动玻璃柱，使氧化铝沉降均匀。当柱内液面接近氧化铝柱面时，关闭螺旋夹。
（2） 样品的加入
称取50-100mg 盐酸小檗碱，加少量95%乙醇于水浴上加热溶解，用滴管沿层析管壁小心加入，勿使氧化铝柱面受到振动。找开螺旋夹，当液体表面下降接触氧化铝时，关闭螺旋夹。
（3）洗脱
用滴管吸取95%乙醇，经管壁轻轻加入柱内，打开螺旋夹，控制流速20-30滴/分钟，不断加入洗脱剂，使洗脱剂的液面始终高于氧化铝。待氧化铝柱上呈现数段不同颜色的色带时，继续冲洗，使其彼此分离，并收集鲜黄色带，此段为盐酸小檗碱，其余色带为其它成分。
五、实验说明及注意事项
1、整个操作过程，氧化铝柱表面应保持一定高度的溶剂（洗脱剂），不得使柱面溶剂流干。
2、一般采用等量收集洗脱液流份。每份洗脱剂体积的毫升数，一般与吸附剂重量相近。如果洗脱剂极性较大或样品各组份结构相近似时，每份收集量要小；
3、洗脱时流速不宜过快，太快时柱中交换来不及达到平衡，影响分离效果；
4、由于氧化铝表面活性较大，有时会促使某些成分发生变化，应在短时间内完
成一个柱层析的分离，以免样品在柱上起异构化、氧化、皂化、水合以及脱氢形成双键等反应。样品在柱上会扩散也会影响分离效果。
5、氧化铝的粒度一般为100-200目，用量一般为样品量的20-50倍，根据被分离的化合物而定，有时可达100-200倍。硅胶吸附柱层析粒度一般为100-160目或160目以上，用量为样品量的30-60倍，较难分离的化合物可选用500-1000倍。
六、思考题
1、采用柱层析分离时应注意哪些方面的问题？
2、为什么本实验采用氧化铝而不采用硅胶作吸附剂？
《中药化学实验讲义》
实验须知
中药化学实验教学是中药化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。为此，提出下列实验须知：
1．遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。
2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，贴上标签（日期、样品名称、纯度、mp 、bp 、TLC 、重量）交给老师。
3．实验室中保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内，废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。
4．公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电、药用试剂。严格药品用量。
5．保持实验室内整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。
实验一 薄层板的制备、活度测定及应用
一、目的要求
1．掌握硅胶薄层板的制备及薄层层析的操作方法
2．掌握硅胶薄层活度的测定方法
3．应用薄层层析法检测识中草药化学成分
二、实验材料
薄层层析用硅胶G ，硅胶F ，羧甲基纤维素钠，0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene ），苏丹红（Sudan Ⅲ），靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline ），苯，微量点样管，10×20cm 玻璃板20块，碾钵7套。
三、实验操作
（一）薄层板的制备
1．硅胶薄层的制备
（1）硅胶G 薄层 取硅胶G 或硅胶GF 一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。
（2）硅胶（H ）羧甲基纤维钠（CMC-Na ）薄层 CMC-Na 系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5~1%浓度（常用0.8%），宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。
取薄层层析用硅胶，按1：3~3.5的比例加入羧甲基纤维素钠溶液顺时针方向搅拌混合并排除气泡，按照硅胶G 薄层涂布法制备薄层，让其自然阴干，100℃下活化30分钟。活化温度不应过高，防止碳化。冷后于干燥器内备用。
注：国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G （G 是Gypsum 石膏的缩写。表示加了石膏），硅胶H （H 表示不加石膏），硅胶GF254（F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰）。硅胶GF365（表示加石膏和波长365nm 显黄色荧光的硫化锌镉）。
2．特殊薄层的制备
根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。
（1）酸、碱薄层和pH 缓冲薄层
为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铅薄层使用，硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1~0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH 的缓冲液代替水铺层，制成一定pH 缓冲的薄层。
（2）络合薄层
硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G 薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。
（二）、吸附剂的活度测定
1．硅胶活度的测定
一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。
欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene ）。苏丹红（Sudan Ⅲ），靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10μl点滴于硅胶G 或硅胶H 薄层上，以苯为展开剂，展开10cm （约20分钟），三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。
2．氧化铝活度的测定
一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。
染料试剂的配制：取偶氮苯（Azobenzene ）50mg ，对甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene ）, 苏丹黄（Sudan I, Benzeneazo-β-naphthol ），苏丹红（Sudan Ⅲ Tetrazobenzol-β-naphthol ），对氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene ）各20mg ，分别溶于50ml 重蒸馏的四氯化碳（经氢氧化钠干燥）中。
常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm 左右轻轻点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml 染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°之间，展开后测出各斑点的Rf 值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。
另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。观察有无变化。
表1 氧化铝活度与偶氮染料外值关系
偶氮染料
偶氮苯
苏丹黄
苏丹红
对氨基偶氮苯 氧化铝活度级Rf 值 二级 0.59 0.02 0.00 0.00 三级 0.72 0.45 0.25 0.10 0.05 四级 0.85 0.69 0.87 0.35 0.08 五级 0.95 0.89 0.98 0.50 0.19 对甲氧基偶氮苯 0.16
（三）、薄层层析的应用
薄层层析法在中药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。
实验操作：蒽醌类成分的鉴别
三、思考题
1. 为何在铺板之前，色谱用的玻璃板要完全洗净并干燥？
2. 为何铺好的TLC 板用前要在烘箱中干燥？
试验二 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定
（一）概述
大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。 自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll ）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种： R 1
2
晶 形 黄色针晶
橙色细针晶 熔 点 318~320℃ 206~208℃
196℃
256~257℃
207℃ R 1 -H -H -H -CH 3 -CH 3
R 2 -COOH -CH 2OH -CH 3 -OH - 名 称 大黄酸(Rhein) 芦荟大黄素(Aloe-emodin) 大黄酚(Chyrsophanol) 金色片状结晶 大黄素(Emodin) 大黄素甲醚(Physcion) 橙色针晶 砖红色针晶
大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH ，酸性最强；大黄素连有β-OH ，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH ，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH 3和-CH 3，后者只连有-CH 3，因而后者酸性排在第四位。
（二）实验目的和要求
1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。
2．掌握PH 梯度法的原理及操作技术。
3．学习蒽醌类化合物鉴定方法。
（三）实验方法
实验试剂及试药：
大黄药材粗粉2Kg ，氯仿500ml 10瓶，浓硫酸2瓶，冰醋酸，乙醚，苯，乙酸乙酯，碳酸钠（5% Na 2CO 3溶液3000ml ），碳酸氢钠（5% NaHCO 3溶液3000ml ），氢氧化钠（5% NaOH溶液1000ml ），氢氧化钾，醋酸镁试剂，
实验仪器设备：
500ml 圆底烧瓶15个，冷凝回流管15只，500ml-1000ml 分液漏斗15只，500ml 烧杯30只，100-250ml 量筒15只，常压漏斗（5-10cm 斗径15只），定性滤纸（10cm ）2盒，毛细管点样器1盒，玻璃喷瓶4套，广谱PH 试纸7盒，纱布一卷
多孔水浴锅，旋转蒸发仪
1．大黄总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉（100g ）加20%H2SO 4水溶液200ml ，氯仿500ml ，
水浴回流4hr ，过滤，测量滤液体积。
残渣
氯仿提取液（约450ml ）
注意：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。
2．总蒽醌苷元的分离与精制
大黄酸的分离与精制
将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml 移至1000ml 的大分液漏斗中，加PH8缓冲液（5% NaHCO3溶液）275ml 振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml 烧杯中，加HCl 酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml 加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。
大黄素的分离与精制
将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液（5%NaCO3溶液）275ml 振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl 酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml 冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。
芦荟大黄素的分离和精制
余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 碱水液540ml 或用
0.5%KOH540ml振摇萃取，碱水液加HCl 酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml 乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。
3. 鉴定
1. 化学检识：分别取总蒽醌提取物少许，用乙醚溶解，做如下反应：
A ：碱液试验：取试液1ml ，加20%NaOH数滴，观察颜色。
B ．醋酸镁反应：取试样1ml ，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。
2．薄层鉴定：
吸附剂：硅胶-CMC
展开剂：C 6H 6-EtOAc(3:2或97：9) 。
显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH喷雾。
（四）实验指导
1．本实验讲解要点及注意事项。
① PH梯度萃取的原理及注意事项。
② 如何设计萃取分离方案的程序与方法。
③ 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl 3，回洗碱水液。
⑤ 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。
2．实验报告要求
① 记录大黄总蒽醌的提取方法及总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量）。
② 总蒽醌的显色鉴别结果。
③ 记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及薄层色谱鉴别结果。
实验三 槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
芦丁（Rutin ）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。
芦丁是由槲皮素（Quercetin ）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose ）〔为葡萄糖（Glucose ）与鼠李糖（Rhamnose ）组成的双糖〕脱水合成的苷。为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P 样作用。可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用
作防治高血压病的辅助治疗剂。现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。
一、实验目的
1．通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2．掌握芦丁的一种提取、精制方法及提制过程中防止甙水解的方法。
3. 掌握黄酮甙水解生成甙元的方法及二者之间的分离。
4．熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法和纸层析鉴定方法。
二、实验原理
本实验主要是利用芸香苷中含有较多的酚羟基，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出芸香苷结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芸香苷对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。
三、实验材料
槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、1％的氢氧化钠溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液、1％的葡萄糖溶液、1％的鼠李糖溶液、1％芸香苷乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、碳酸钡、广泛pH 试纸、中速层析滤纸等。
四、实验内容
（一）提取：
称取槐米30g ，在乳钵中研碎后，投入300ml0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分钟，在搅拌下加入石灰乳调pH9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8~9），趁热倾出上清液, 用棉花过滤。残渣加100ml 水，加石灰乳调pH9，煮沸30分钟，趁热用棉花过滤，二次滤液合并。滤液保持在60℃，加浓HCl ，调pH2-3，放置过夜，则析出芦丁沉淀。
加0.4％硼砂水溶液200ml ，在搅拌下加石灰乳调pH 值至8~9，加热，煮沸15min ，随时补充失去的水分，保持pH8~9，倾出上清液，用四层纱布过滤；同样操作再提取一次。合并两次滤液，放冷，并用盐酸调pH 至2~3，放置过夜，待析出结晶，过滤，滤饼用蒸馏水洗至pH5-6，抽干，置空气中晾干，得粗制芸香苷，称重，计算得率。
（二）精制：
将芸香苷粗品悬浮于蒸馏水中，煮沸至芸香苷全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分钟，趁热抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤至干，置空气中晾干，或60~70℃干燥，得精制芸香苷，称重，计算得率。
（三）芸香苷的水解：
取芸香苷1g ，研碎，加2％硫酸水溶液80ml ，小火加热，微沸回流30-60min ，并及时补充蒸发掉的水分。在加热过程中，开始时溶液呈浑浊状态，约10min 后，
溶液由浑浊转为澄清，逐渐析出黄色小针状结晶，即水解产物槲皮素，继续加热至结晶物不再增加时为止。抽滤，保留滤液20ml ，以检查滤液中的单糖。所滤得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70％乙醇80ml 加热回流使之溶解，趁热抽滤，放置析晶。抽滤，得精制槲皮素。减压下110℃干燥，可得槲皮素无水物。
(四) 芸香苷、槲皮素及糖的检识
1．颜色反应
① α-萘酚-浓硫酸（Molisch ）试验：
取芸香苷少许置于试管中，加乙醇1ml 振摇，加α-萘酚试剂2~3滴振摇，倾斜试管，沿管壁徐徐加入0.5ml 浓硫酸，静置，观察两层溶液界面变化，出现紫红色环者为阳性反应，表示试样的分子中含有糖的结构，糖和甙类均呈阳性反应，比较芸香苷和槲皮素的不同。
②盐酸-镁粉试验：
取芸香苷少许置于试管中，加5％乙醇2ml ，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50mg ，即产生剧烈的反应。溶液逐渐由黄色变为红色。
③ 三氯化铁试验
取样品水或乙醇液，加入三氯化铁试剂数滴，观察颜色变化。
④三氯化铝试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％三氯化铝甲醇试剂2~3滴，呈鲜黄色。以同样方法试验槲皮素。
⑤醋酸镁试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％醋酸镁甲醇试剂2~3滴，呈黄色荧光反应。以同样方法试验槲皮素（反应也可在滤纸上进行，观察荧光）。
⑥ 氧氯化锆-枸橼酸试验：
取芸香苷少许置于试管中，加甲醇1~2ml，在水浴上加热溶解，再加2％氧氯化锆甲醇试剂3~4滴，呈鲜黄色。然后加2%枸橼酸甲醇试剂3~4滴，黄色变浅，加蒸馏水稀释变无色。以同样方法试验槲皮素进行对照。
⑦ 氢氧化钠试验：
取芸香苷少许置于试管中，加水2ml 振摇，观察试管中有无变化。滴加1％氢氧化钠溶液数滴，振摇使溶解，呈黄色澄清溶液。再加入1％盐酸溶液数滴使呈酸性反应，则溶液由澄清转为浑浊状态。
2．色谱检识
(1) 槲皮素和芦丁的薄层鉴定
①聚酰胺薄层色谱：
固定相：聚酰胺薄层板
样品：a 精制芦丁 b 芦丁标准品 c 精制槲皮素
展开剂：氯仿—甲醇—丁酮—乙酰丙酮：(16：10：5：1)
显色：
a 可见光下观察色斑，再于紫外灯下观察荧光斑点
b 喷洒AlCl3乙醇液后观察。
②硅胶薄层色谱
吸附剂：硅胶G ，105℃下活化2h
展开剂：a. 氯仿：甲醇：甲酸（15：5：1）
b. 氯仿：丁酮：甲酸（5：3：1）
显色剂：1%FeCl3和1%K3[Fe（CN ）6]水溶液，应用时等体积混合。
(2) 芸香苷和槲皮素的纸色谱检识：
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样 品：自制1％芸香苷乙醇溶液
自制1％槲皮素乙醇溶液
对照品：1％槲皮素标准品与1％芸香苷标准品乙醇溶液
展开剂：a. 正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
b. 15％醋酸水溶液
展距：10-15cm
显色：a. 在可见光下观察斑点颜色，再在紫外灯下观察斑点颜色
b. 喷三氯化铝试剂呈黄色斑点
c ．经氨气熏后再于可见、紫外下观察。
(3) 糖的纸色谱检识：取上述芸香苷水解后的母液20ml ，加入氢氧化钡细粉（约
2.6g ）中和至pH7，滤除生成的硫酸钡沉淀（可用滑石粉助滤）。滤液中水浴中浓缩至1~2ml，供纸色谱点样用。
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样 品：水解浓缩液
对照品：a. 葡萄糖标准品水溶液
b. 鼠李糖标准品水溶液
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
显 色：a. 喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃加热10min ，显棕色或棕红色斑点 b. 喷氨性硝酸银试剂，于100℃左右加热，呈棕褐色斑点。
五、实验说明及注意事项
1．本实验采用碱溶酸沉法从槐米中提取芸香苷，收率稳定，且操作简便。在提取前应注意将槐米略捣碎，使芸香苷易于被热水溶出。槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使生成钙盐沉淀除支。pH 应严格控制在8-9，不得超过10。因为在强
碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香甙水解破坏，使提取率明显下降。酸沉一步pH 为2-3，不宜过低，否则会使芸香甙形成盐溶于水，降低了收率。
2．提取过程中加入硼砂水的作用：即能调节碱性水溶液的pH ，又能保护芸香甙分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香甙不受损失。
3．芸香甙的提取方法除了用碱溶酸沉法外，还可利用芸香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。又报道将生产工艺改进为95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后将粗浸膏经除去脂溶性杂质后，用水洗净，过滤，干燥即得芸香甙，可提高收率6．96%，并降低了成本。因此可根据不同原料采用各种不同方法提取。
4．槲皮素以乙醇重结晶时，如所用的乙醇浓度过高（90％以上），一般不易析出结晶。此时可于乙醇溶液中滴加适量蒸馏水，使呈微浊状态，放置，槲皮素即可析出。
六、思考题
1．本实验提取过程中应注意哪些问题？
2．根据芸香苷的性质还可采用何种方法进行提取？简要说明理由。
七、参考文献
1．海药物研究所：中草药有效成分的提取和分离 234—240页
2．中国医学科学院药物研究所：中草药有效成分的研究(第一分册)219—225 1972
3．日本药学杂志，72(333) 1952；76(1210) 1956，80(304) 1960；80(698) 1960
4．Chem ， Pharm ． Bull ， ll (167)， 1963
实验四 黄连中盐酸小檗碱的提取、精制和鉴定
黄连为毛莨科黄连属植物黄连、三角叶黄连或云连等的干燥根茎。具有清热燥湿、清心除烦、泻火解毒的功效。黄连的有效成分主要是生物碱，已分离出的主要有：小檗碱（Berbenie ），又名黄连素，巴马丁、黄连碱，甲基黄连碱、药根碱、表木兰碱等，其中以小檗碱含量最高，可达10%左右，且以盐酸盐的状态存在于黄连中。小檗碱盐酸对痢疾杆菌、葡萄球菌和链球菌等均有显著抑制作用，临床用于治疗细菌性痢疾和胃肠炎等，无耐药性和副作用。
一、 实验目的：
1、掌握盐酸小檗碱的一种提取方法，熟悉盐析法、重结晶法。
2、掌握小檗碱的结构特点，特殊的理化性质和薄层鉴定方法。
3、通过实验熟悉和掌握柱层析法的分离原理及操作技能。
二、 小檗碱的结构及性质
小檗碱为黄色长针状结晶，具5.5个结晶水，m.p145℃，能缓缓溶于冷水中（1：20），微溶于冷乙醇（1：100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，与酸结合成盐时失去一分子水，其硝酸盐和氢碘酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水，较易溶于沸水，其硫酸盐，构椽酸盐在水中溶解度较大。盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃左右分解为棕红色小檗红碱，285℃左右完全溶融，UV λmax265nm ，343nm 。游离小檗碱易和1分子丙酮或1分子氯仿或1.5分子苯结合成一黄色络合物晶体。
三、 实验原理
本实验利用小檗碱与含氧酸（硝酸例外）所成盐在水中溶解度较大的性质，采用稀硫酸将其以硫酸盐形式提取出来，再根据小檗碱与氢卤酸所成盐在水中溶解度较小的特点，在将小檗碱游离后，加入盐酸使其形成盐酸盐，结合成盐析法，使之沉淀析出。
四、 实验内容
1、提取
取黄连粗粉25克，加入0.2%H2SO 4液200ml 加热煎煮1小时（注意随时补充蒸发损失的溶剂），纱布过滤，残渣再加0.2%H2SO 4液200ml 加热煎煮45分钟，纱布过滤，两次滤液合并。向滤液中加入石灰乳调节pH12，抽滤，再向抽滤所得的滤液中滴加浓HCl ，调节pH2-3，然后加入8%（W/V）氯化钠，搅拌并使完全溶解，并继续搅拌至溶液出现微浊现象为止，放置过夜。则有盐酸小檗碱沉淀析出。
2、分离及精制
抽滤，得盐酸小檗碱粗品，水洗，加适量蒸馏水加热溶解，趁热抽滤，滤液放置，则有盐酸小檗碱结晶析出。再进行重结晶：即滤取结晶，加入适量乙醇，水浴加热溶解，趁热抽滤，滤液放置结晶。待盐酸小檗碱析出完全后，滤出，80℃干燥，得成品。
3、盐酸小檗碱的检识
（1）取盐酸小檗碱少许，加10%稀硫酸适量使之溶解后，加入一点漂白粉，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加热使期溶于水中，加10%NAOH使呈强碱性，然后滴加丙酮数滴，可见有黄色结晶性的小檗碱丙酮加成物生成。
4、薄层层析鉴定
薄层板：硅胶G-CMC 板
样品：实验所得精制盐酸小檗碱的醇溶液
对照品：1%盐酸小檗碱的醇溶液
展开剂：氯仿：甲醇=7：2，氨水饱和20分钟
展距：10cm
显色：自然光下观察
结果：计算Rf 值
5、柱层析分离
吸附剂：12克氧化铝（80-100目）
层析柱：1х40cm 玻璃柱（也可用碱式滴定管代替）
洗脱剂：95%乙醇
（1）氧化铝吸附柱的制备（湿法装柱）
取一根25cm 碱式滴定管代作层析管用，管的下端套一段约3-4cm 长的乳胶管，在乳胶管上夹一螺旋夹，以控制洗脱液流出速度。在层析管的下端填一层松紧合适平整的脱脂棉。将此层析管垂直地固定在铁架台上，关闭螺旋夹。
管内先加入一定体积的洗脱剂（此处用95%乙醇），打开螺旋夹，放出管内乙醇，将层析管下端的脱脂棉内的空气充分赶尽，然后再向层析管中加入一定体积的乙醇。
取中性氧化铝（100-200目）12克于烧杯中，加一定体积的乙醇调成浆状，赶尽其中气泡，然后通过小玻璃漏斗将浆状氧化铝徐徐注入注中，并同时打开下端螺旋夹，让洗脱剂缓缓流出，不断用手轻轻振动玻璃柱，使氧化铝沉降均匀。当柱内液面接近氧化铝柱面时，关闭螺旋夹。
（2） 样品的加入
称取50-100mg 盐酸小檗碱，加少量95%乙醇于水浴上加热溶解，用滴管沿层析管壁小心加入，勿使氧化铝柱面受到振动。找开螺旋夹，当液体表面下降接触氧化铝时，关闭螺旋夹。
（3）洗脱
用滴管吸取95%乙醇，经管壁轻轻加入柱内，打开螺旋夹，控制流速20-30滴/分钟，不断加入洗脱剂，使洗脱剂的液面始终高于氧化铝。待氧化铝柱上呈现数段不同颜色的色带时，继续冲洗，使其彼此分离，并收集鲜黄色带，此段为盐酸小檗碱，其余色带为其它成分。
五、实验说明及注意事项
1、整个操作过程，氧化铝柱表面应保持一定高度的溶剂（洗脱剂），不得使柱面溶剂流干。
2、一般采用等量收集洗脱液流份。每份洗脱剂体积的毫升数，一般与吸附剂重量相近。如果洗脱剂极性较大或样品各组份结构相近似时，每份收集量要小；
3、洗脱时流速不宜过快，太快时柱中交换来不及达到平衡，影响分离效果；
4、由于氧化铝表面活性较大，有时会促使某些成分发生变化，应在短时间内完
成一个柱层析的分离，以免样品在柱上起异构化、氧化、皂化、水合以及脱氢形成双键等反应。样品在柱上会扩散也会影响分离效果。
5、氧化铝的粒度一般为100-200目，用量一般为样品量的20-50倍，根据被分离的化合物而定，有时可达100-200倍。硅胶吸附柱层析粒度一般为100-160目或160目以上，用量为样品量的30-60倍，较难分离的化合物可选用500-1000倍。
六、思考题
1、采用柱层析分离时应注意哪些方面的问题？
2、为什么本实验采用氧化铝而不采用硅胶作吸附剂？