实验三：坐骨神经腓肠肌标本制备
一、实验原理
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观察兴奋和兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生理现象和过程。所制备坐骨神经腓肠肌标本是生理学实验中必须掌握的一项基本技能。
二、实验目的
本实验目的在于学习破坏蛙类脑脊髓法，掌握坐骨神经腓肠肌标本的制备技术、并获得兴奋性良好的标本，为以后有关实验打下基础。
三、实验对象
蛙或蟾蜍。
四、实验器材与药品
1．器械：蛙类动物手术器械，包括普通剪刀、小手术剪刀、镊子、探针、锌铜弓、玻璃分针、蛙板、玻璃板、固定针等。
2．药品：任氏液。
3．其他：瓷盘、培养皿、小烧杯、棉花、棉线、纱布、滴管等。
五、实验步骤与观察指标
1．破坏脑和脊髓 取蟾蜍1只，用布包裹蟾蜍四肢躯干露出头部，用左手握住蟾蜍，并用食指按压头部前端，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触、触及凹陷处即枕骨大孔的所在。将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔，这时将探针尖端转向头方，向前探人颅腔内，然后向各方搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确在颅腔内，术者可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出；再由枕骨大孔刺入，并转向尾方，与脊髓平行刺入脊管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否完全破坏，可检查动防四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后，同一千棉球压迫针孔，以止其出血。另一方法是去脑后再捣毁脊髓。
2．剪除躯干上部及内脏 在骶髂关节水平以上0．5～1cm 处剪断脊柱。左手握住蟾蜍后肢、用拇指压止骶骨，使蟾蜍头与内脏自然下垂，右手持粗剪刀（非手术剪），沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。剪除过程中注意勿损伤坐骨神经。
3．剥皮 左手握紧脊柱断端（注意不要握住或压迫神经），右手捏住其上的皮肤边缘、用力向下剥掉全部后肢的皮肤（图4.28）。把标本放在盛有任氏液的培养皿中。将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面步骤。
4．分离两腿 用镊子夹住脊柱标本提起，背面朝上，剪去向上突起的尾骨（注意勿损伤坐骨神经）。然后沿正中线用剪刀将脊柱和耻骨联合中央辟开两侧大腿，并完全分离。将两条腿浸入盛有任氏液的培养皿中。
图4.28 蛙类坐骨神经腓肠肌标本的初步制作过程
（a ）（b ）剪除躯干上部和内脏 （c ）剥掉后背及下肢皮肤
5．制作坐骨神经腓肠肌标本
（1）分离坐骨神经：取一条腿放置在蛙板上的玻璃片上，用一固定针将粗制标本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），将下肢拉直并向外旋转趾蹼朝上，用固定针在跖骨部固定在蛙板上，用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经至尾骨处、再循坐骨神经沟（股二头肌和半膜肌之间的裂缝处），找出坐骨神经的大腿段，用玻璃分针仔细剥离，剪断坐骨神经的所有分支，并将神经分离直至膝关节处。
（2）分离腓肠肌：用玻璃分针或镊子将腓肠肌跟腱分离，并穿线结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，以手术剪刀剪去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，惟需注意勿损伤支配该肌的神经分支。
（3）游离坐骨神经腓肠肌标本：将该后肢股部所有肌肉从膝关节起沿股骨剥离并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3处剪断股骨，剪下一小段与神经相连的脊柱（1～2个脊椎骨）在膝关节下将小腿剪掉，留下的即为坐骨神经腓肠肌标本（图4.29）。
图4.29 坐骨神经腓肠肌标本的精细制作过程
其各部连接关系如下：
脊柱小块→坐骨神经→膝关节→腓肠肌→跟腱→线（连接张力换能器）
↓
股骨小段（固定于肌肉槽内的侧孔）。
（4）检查标本的兴奋性：用经任氏溶液润湿的锌铜弓轻轻接触一下坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好，即可将标本放在盛有任氏液的培养皿中，以备实验用。若无锌铜弓，亦可用中等强度单个电刺激作上述试验。
六、注意事项
1．沿脊柱中央把下半身剪为左右两大半时，要正中，否则会损伤坐骨神经。
2．神经分离需用玻璃分针，分离过程中操作必须精细，避免用金属器械碰夹神经，以免损伤。同时要注意持针分离方向应由中心向外周，以免将神经上段撕伤。坐骨神经周围的组织和神经的小分支，可用分针钝性分离或用剪刀逐步剪掉。
3．所用的器械要洁净，接触蛙皮肤，特别是蟾蜍皮肤的用具必须洗净后使用。
4．应经常用任氏液湿润标本，防止干燥。
七、思考题：根据个人体会，总结制备新鲜完整的坐骨神经标本过程中的注意事项和技巧。
实验三：坐骨神经腓肠肌标本制备
一、实验原理
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观察兴奋和兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生理现象和过程。所制备坐骨神经腓肠肌标本是生理学实验中必须掌握的一项基本技能。
二、实验目的
本实验目的在于学习破坏蛙类脑脊髓法，掌握坐骨神经腓肠肌标本的制备技术、并获得兴奋性良好的标本，为以后有关实验打下基础。
三、实验对象
蛙或蟾蜍。
四、实验器材与药品
1．器械：蛙类动物手术器械，包括普通剪刀、小手术剪刀、镊子、探针、锌铜弓、玻璃分针、蛙板、玻璃板、固定针等。
2．药品：任氏液。
3．其他：瓷盘、培养皿、小烧杯、棉花、棉线、纱布、滴管等。
五、实验步骤与观察指标
1．破坏脑和脊髓 取蟾蜍1只，用布包裹蟾蜍四肢躯干露出头部，用左手握住蟾蜍，并用食指按压头部前端，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触、触及凹陷处即枕骨大孔的所在。将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔，这时将探针尖端转向头方，向前探人颅腔内，然后向各方搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确在颅腔内，术者可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出；再由枕骨大孔刺入，并转向尾方，与脊髓平行刺入脊管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否完全破坏，可检查动防四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后，同一千棉球压迫针孔，以止其出血。另一方法是去脑后再捣毁脊髓。
2．剪除躯干上部及内脏 在骶髂关节水平以上0．5～1cm 处剪断脊柱。左手握住蟾蜍后肢、用拇指压止骶骨，使蟾蜍头与内脏自然下垂，右手持粗剪刀（非手术剪），沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。剪除过程中注意勿损伤坐骨神经。
3．剥皮 左手握紧脊柱断端（注意不要握住或压迫神经），右手捏住其上的皮肤边缘、用力向下剥掉全部后肢的皮肤（图4.28）。把标本放在盛有任氏液的培养皿中。将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面步骤。
4．分离两腿 用镊子夹住脊柱标本提起，背面朝上，剪去向上突起的尾骨（注意勿损伤坐骨神经）。然后沿正中线用剪刀将脊柱和耻骨联合中央辟开两侧大腿，并完全分离。将两条腿浸入盛有任氏液的培养皿中。
图4.28 蛙类坐骨神经腓肠肌标本的初步制作过程
（a ）（b ）剪除躯干上部和内脏 （c ）剥掉后背及下肢皮肤
5．制作坐骨神经腓肠肌标本
（1）分离坐骨神经：取一条腿放置在蛙板上的玻璃片上，用一固定针将粗制标本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），将下肢拉直并向外旋转趾蹼朝上，用固定针在跖骨部固定在蛙板上，用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经至尾骨处、再循坐骨神经沟（股二头肌和半膜肌之间的裂缝处），找出坐骨神经的大腿段，用玻璃分针仔细剥离，剪断坐骨神经的所有分支，并将神经分离直至膝关节处。
（2）分离腓肠肌：用玻璃分针或镊子将腓肠肌跟腱分离，并穿线结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，以手术剪刀剪去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，惟需注意勿损伤支配该肌的神经分支。
（3）游离坐骨神经腓肠肌标本：将该后肢股部所有肌肉从膝关节起沿股骨剥离并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3处剪断股骨，剪下一小段与神经相连的脊柱（1～2个脊椎骨）在膝关节下将小腿剪掉，留下的即为坐骨神经腓肠肌标本（图4.29）。
图4.29 坐骨神经腓肠肌标本的精细制作过程
其各部连接关系如下：
脊柱小块→坐骨神经→膝关节→腓肠肌→跟腱→线（连接张力换能器）
↓
股骨小段（固定于肌肉槽内的侧孔）。
（4）检查标本的兴奋性：用经任氏溶液润湿的锌铜弓轻轻接触一下坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好，即可将标本放在盛有任氏液的培养皿中，以备实验用。若无锌铜弓，亦可用中等强度单个电刺激作上述试验。
六、注意事项
1．沿脊柱中央把下半身剪为左右两大半时，要正中，否则会损伤坐骨神经。
2．神经分离需用玻璃分针，分离过程中操作必须精细，避免用金属器械碰夹神经，以免损伤。同时要注意持针分离方向应由中心向外周，以免将神经上段撕伤。坐骨神经周围的组织和神经的小分支，可用分针钝性分离或用剪刀逐步剪掉。
3．所用的器械要洁净，接触蛙皮肤，特别是蟾蜍皮肤的用具必须洗净后使用。
4．应经常用任氏液湿润标本，防止干燥。
七、思考题：根据个人体会，总结制备新鲜完整的坐骨神经标本过程中的注意事项和技巧。