肝糖原的提取.鉴定与定量

生物化学实验报告

姓 名:

学 号: 3130010071

专业年级: 2013级临床医学

组 别: 第2实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称 肝糖原的提取、鉴定、分离 实验日期 2014-12-25 合作者 评分

陈海玲

教师签名

实验地点

第2实验室

指导老师 朱利娜

批改日期

一、实验目的

1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。

2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。

3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

● 肝糖原的提取

糖原储存于细胞内,采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀,再溶于热水中。 ● 糖原的鉴定

糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO 4 + 2NaOH = Na2SO 4 + Cu(OH)2Cu(OH)2 + C6H 12O 6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O

2CuOH = H20 + Cu2红色) Cu(OH)2 ==== H2黑色) ● 肝糖原的定量

糖原在浓酸中可水解为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10—100mg 范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,而保留肝糖原。

三、实验材料

● 仪器:

1、普通离心机,室温-100℃恒温水浴箱(x2),722型分光光度计,精度为 10mg 级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架,离心管,试管

4、刻度吸量管(2ml ,5ml),1000μl 微量可调取液器 5、100ml 容量瓶 6、白瓷反应板 ● 试剂:

鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl 、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L) 蒽酮显色剂

四、实验步骤

● 肝糖原的提取

鸡肝约1.5g ,剪碎

+5%CClCOOH 1ml

3

研磨至乳状

+5%CCl3COOH 3ml 研磨成肝匀浆

全部转入离心管中,离心3min (4000r/min)

取上清液

+5ml 95%乙醇,混匀,静置10min 离心5min (

4000r/min)

取沉淀 +蒸馏水2ml

沸水浴2min ,溶解沉淀

+浓HCl 0.2ml

15min ,冷却

糖原溶液0.1ml

呈色对比

+班氏试剂0.2ml(4d)

混匀

沸水浴,观察变化 ● 注意事项:

1、提取肝糖原时,向上清液中加入等量的95%乙醇后,必须混匀。由于上清液为水溶液,比重大于95%乙醇,溶液分成两层。加之上清液已4ml 多,加上等量

乙醇,总量接近9ml ,混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。

2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色,20-30个之间使碘呈现紫色,60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长,故呈蓝色,而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下(通常8-12个葡萄糖残基),吸附碘后呈现红棕色。

3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定

鸡肝 0.15 g

+30% KOH 1.5ml 沸水浴15min

冷却,全部转入100ml 容量瓶中

加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液

取3支干净的试管,按下表操作:

试剂(ml ) 空白管 蒸馏水

标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液

1.0 —— —— 2.5

标准管 —— 1.0 —— 2.5

样品管 —— —— 1.0 2.5

混匀,沸水浴10min ,冷却。在722型或721型分光光度计620nm 波长处,用空

白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度(A ). 计算:

肝糖原(g/100g肝组织)=

100A 测定100

X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重(g )1000

五、实验现象与结果讨论

● 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。

● 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,但与碘试剂原来颜色区别不大。

● 鸡肝加碱沸水浴后分层,上层为红棕色,下层无色。

● 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管(由左至右)对比

● 将空白管在620nm 处的A 值设定为0,测得标准管、样品管的A 值如下:

1 2 3 平均值

空白管 0 0 0 0

标准管 0.610 0.612 0.616 0.613

样品管 0.085 0.085 0.091 0.087

肝糖原(g/100g肝组织)=

100A 测定100

X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重(g )1000

≈0.525

从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原,但在定性实验中结果不明显,可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少,造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿状态,糖原分解以维持血糖稳定,因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。

生物化学实验报告

姓 名:

学 号: 3130010071

专业年级: 2013级临床医学

组 别: 第2实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称 肝糖原的提取、鉴定、分离 实验日期 2014-12-25 合作者 评分

陈海玲

教师签名

实验地点

第2实验室

指导老师 朱利娜

批改日期

一、实验目的

1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。

2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。

3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

● 肝糖原的提取

糖原储存于细胞内,采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀,再溶于热水中。 ● 糖原的鉴定

糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO 4 + 2NaOH = Na2SO 4 + Cu(OH)2Cu(OH)2 + C6H 12O 6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O

2CuOH = H20 + Cu2红色) Cu(OH)2 ==== H2黑色) ● 肝糖原的定量

糖原在浓酸中可水解为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10—100mg 范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,而保留肝糖原。

三、实验材料

● 仪器:

1、普通离心机,室温-100℃恒温水浴箱(x2),722型分光光度计,精度为 10mg 级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架,离心管,试管

4、刻度吸量管(2ml ,5ml),1000μl 微量可调取液器 5、100ml 容量瓶 6、白瓷反应板 ● 试剂:

鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl 、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L) 蒽酮显色剂

四、实验步骤

● 肝糖原的提取

鸡肝约1.5g ,剪碎

+5%CClCOOH 1ml

3

研磨至乳状

+5%CCl3COOH 3ml 研磨成肝匀浆

全部转入离心管中,离心3min (4000r/min)

取上清液

+5ml 95%乙醇,混匀,静置10min 离心5min (

4000r/min)

取沉淀 +蒸馏水2ml

沸水浴2min ,溶解沉淀

+浓HCl 0.2ml

15min ,冷却

糖原溶液0.1ml

呈色对比

+班氏试剂0.2ml(4d)

混匀

沸水浴,观察变化 ● 注意事项:

1、提取肝糖原时,向上清液中加入等量的95%乙醇后,必须混匀。由于上清液为水溶液,比重大于95%乙醇,溶液分成两层。加之上清液已4ml 多,加上等量

乙醇,总量接近9ml ,混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。

2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色,20-30个之间使碘呈现紫色,60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长,故呈蓝色,而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下(通常8-12个葡萄糖残基),吸附碘后呈现红棕色。

3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定

鸡肝 0.15 g

+30% KOH 1.5ml 沸水浴15min

冷却,全部转入100ml 容量瓶中

加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液

取3支干净的试管,按下表操作:

试剂(ml ) 空白管 蒸馏水

标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液

1.0 —— —— 2.5

标准管 —— 1.0 —— 2.5

样品管 —— —— 1.0 2.5

混匀,沸水浴10min ,冷却。在722型或721型分光光度计620nm 波长处,用空

白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度(A ). 计算:

肝糖原(g/100g肝组织)=

100A 测定100

X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重(g )1000

五、实验现象与结果讨论

● 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。

● 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,但与碘试剂原来颜色区别不大。

● 鸡肝加碱沸水浴后分层,上层为红棕色,下层无色。

● 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管(由左至右)对比

● 将空白管在620nm 处的A 值设定为0,测得标准管、样品管的A 值如下:

1 2 3 平均值

空白管 0 0 0 0

标准管 0.610 0.612 0.616 0.613

样品管 0.085 0.085 0.091 0.087

肝糖原(g/100g肝组织)=

100A 测定100

X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重(g )1000

≈0.525

从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原,但在定性实验中结果不明显,可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少,造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿状态,糖原分解以维持血糖稳定,因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。


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