真菌植酸酶的研究现状和前景_武燕平

安徽农业科学, J o u r n a l o f A n h u i A g r i . S c i . 2010, 38(24) :12964-12968责任编辑　郑丹丹　责任校对　况玲玲

真菌植酸酶的研究现状和前景

武燕平, 杨平平

＊

　(山东轻工业学院, 山东济南

250353)

摘要　介绍真菌植酸酶的最新研究进展, 其中着重介绍了真菌植酸酶的耐热性提高、pH 改善方法、二硫键的作用以及真菌植酸酶糖基化效应的影响。

关键词　真菌植酸酶; 糖基化; 二硫键; 耐热性中图分类号　S816. 7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010) 24-12964-05R e s e a r c h S t a t u s a n dF o r e g r o u n d o f F u n g a l P h y t a s e WUY a n -p i n g e t a l 　(S h a n d o n g I n s t i t u t e o f L i g h t I n d u s t r y , J i n a n , S h a n d o n g 250353) A b s t r a c t 　Th e l a t e s t r e s e a r c hp r o g r e s s e s o n f u n g a l p h y t a s e w e r e i n t r o d u c e d . T h e m e t h o d s o f e n h a n c i n g t h e t h e r m o -s t a b i l i t y o f f u n g a l p h y t a s e a n d i m p r o v i n g p H , t h e f u n c t i o no f d i s u l f i d e b o n d s , t h e g l y c o s y l a t i o n e f f e c t i n f u n g a l p h y t a s e w e r e m a i n l y i n t r o d u c e d . K e y w o r d s 　Fu n g a l p h y t a s e ; G l y c o s y l a t i o n ; D i s u l f i d e b o n d s ; T h e r m o -s t a b i l i t y

　　植酸[m y o -i n o s i t o l (1, 2, 3, 4, 5, 6) h e x a k i s p h o s p h a t e (I U -P A C -I U B , 1968) ]是磷在谷物、豆类和油料等作物籽实中的基本贮存方式, 含量高达1%～3%,占植物中总磷的60%～80%

[1]

酶活最大值出现在p H 值2. 5和温度52～55℃。加入10m m o l /L 甘氨酸55℃孕育24h , 酶活保持97%,同样条件下, 不加热保护剂, 酶活保持87%。V 和K m a x m 值分别为1074I U /ml 和606m m o l /L 。

G a r g o v a 等[8]从野生菌A s p e r g i l l u s n i g e r 中分离到胞外酸性磷酸酶, 此植酸酶为3-植酸酶。蛋白纯化由P S 50膜连续超滤, S e p h a d e x G -100凝胶过滤, D E A E -S e p h a r o s e C L 6B 和C M -S e p h a r o s e C L 6B 离子交换层析。最大催化速率出现在p H 值2. 0～2. 4和温度66℃。

中国农业科学院Z h a n g 等

[9]

。植酸是一种阴离子螯合剂, 它与多种二价阳离子形

[2]

2+

2+

2+

2+

2+

2+

成复合物, 如C a 、Mg 、Zn 、Cu 、Fe 和M n 。而且

植酸与蛋白形成复合物, 它们之间的相互作用力影响到蛋白的空间结构, 从而导致蛋白水溶性、水解能力及酶活降低

[3]

。

植酸酶(m y o -i n o s i t o l h e x a k i s p h o s p h a t e p h o s p h o h y d r o l a s e s ) 催化植酸水解成五磷酸肌醇(I P 或I P P 。植酸完全水5) 3或I 解产物是1分子的肌醇和6分子的无机磷。根据植酸原始脱磷位点不同, 植酸酶大致可分为3类:3-植酸酶(E C 3. 1. 3. 8) , 6-植酸酶和5-植酸酶。其中3-植酸酶来自A s p e r g i l l u s n i g e r , N e u r o s p o r a c r a s s a , P s e u d o m o n a s , K l e b s i e l l a s p . A S R 1等真菌微

生物, 水解开始于植酸上第3个碳位点[4]。根据催化机制也可以将植酸酶分为3类

[5]

从A s p e r g i l l u s f i c u u mN T G -23

中分离一种新的植酸酶。蛋白纯化经过D E A E -c e l l u l o s e 离子交换层析, S u p e r d e x 75C M -纤维素柱和S u p e r d e x 75F P L C -凝胶过滤步骤。凝胶过滤和S D S -P A G E 显示此酶分子量为65. 5k D , 最适p H 值1. 3, 最适温度67℃,K . 295m m o l /L, m 值为0V 为55. 9n m o l /mi n 。60℃酶活不变, 70℃孵育20m i n 酶m a x

活无明显损失。

1. 2　耐热性的提高方法　在饲料加工中制丸需要高温和蒸汽工序, 因此提高植酸酶的耐热性有利于减少植酸酶活性在制丸中的损失。研究者发现嗜热微生物的植酸酶耐热性较好, 只是产量远远达不到工业要求, 所以在商业植酸酶的基础上利用定点突变、蛋白设计和寻找修饰耐热基因等方法提高酶的耐热性。C h e n 等

[10]

:①组氨酸植酸酶或称酸性植酸酶

H A P s (E C 3. 1. 3. 2) ; ②β-螺旋植酸酶B P P s (E C 3. 1. 3. 8) ; ③

紫酸磷酸酶或半胱氨酸植酸酶P A P s (E C 3. 1. 3. 2) 。其中来自真菌和E . c o l i 的植酸酶属于第①类, 这类酶拥有相同的活性序列(R H G X R X P ) 、催化中心和10个半胱氨酸残基。1　真菌植酸酶活性1. 1　纯化和性质　关于真菌植酸酶的纯化和性质有大量的报道。C a s e y 等曾报道A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶的纯化及其性质。A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶经过超滤、离子交换层析、凝胶过滤和等电聚焦层析等纯化步骤。纯化后的酶分子量为84k D , 单体蛋白; 最适温度和最适p H 值分别为65℃和5. 0; K 值分别为100m m o l /L 和7m 值和V m a x n m o l /s , 这些值与以前的微生物植酸酶报道的范围相符。A s -p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶在80℃时的耐热性比2种商业植酸酶产品要好。

V a t s 等

[7]

[6]

利用基因结构延伸突变改善酶的

热稳定性。将来源于A s p e r g i l l u s n i g e r N 25的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体p E T -30b (+) 上, 以重组表达载体

p E T -30b -F p h y A (m ) 为模板经P C R 扩增获得结构延伸突变植酸酶基因p h y A (e ) , 在植酸酶基因C 端增加了来源于p E T -30b -F p h y A (m ) 载体上的13个氨基酸残基。含突变基因的重组表达载体p P I C 9k -p h y A (e ) 在G S 115酵母中表达。纯化的突变体p p -N P (e ) 与野生型酶P P -N P (m ) -8相比, P P -N P A (e ) 的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10m i n , 热稳定性比野生型提高21%,比活力略有提高。最适反应p H 值为5. 6, 有效p H 值范围4. 6～6. 6, 比未突变菌株扩大了0. 4个单位。

Z h a n g 等

[11]

从腐烂木材中分离到A s p e r g i l l u s n i g e rv a n

T e i g h e m , 胞外酶活性为22592U /mg 。经过离子交换和凝胶

过滤2种层析纯化, 纯化后的分子性质显示出这个天然植酸酶是一种低聚物, 分子量为353k D , 单体为66k D 。纯化后的

作者简介　武燕平(1983-) , 女, 山东菏泽人, 硕士研究生, 研究方向:

微生物制药。＊通讯作者, 博士, 教授, 硕士生导师, E -m a i l :j i a n n a n y p p @163. c o m 。

收稿日期　2010-05-10

研究A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶氢键网络和离

子相互作用力在耐热性中所起的作用, 利用同源性修饰A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 的耐热性。与同源微生物相比,

A s p e r g m (A f p )

38卷24期　　　　　　　　　　　　　　　　武燕平等　真菌植酸酶的研究现状和前景12965

残基(E 35, S 42, R 168, R 248) , 在E 35-S 42区域形成了氢键网络, 在R 168-R 248和D 161-D 244区域具有离子相互作用。研究中, A f p 在E 35A , R 168A 和R 248A 区域或单独缺失或联合缺失形成具有缺失功能的7个突变子。7个突变子的热稳定性均下降, 最高损失25%(P

此后, Z h a n g 等

[12]

是盐离子影响到静电环境, 增强了产物从活性位点分离的能力。模型研究显示虽然活性位点与八肽定位相似, 但是α-螺旋、β折叠及卷曲在排列上有些不同, 这些可以解释实测到的催化作用和盐作用的不同。

1. 4　酶活影响因素　酶活性不仅受到金属离子、抑制剂、有机离子的影响, 还受到去污剂和离液剂等的影响, 但不同来源的植酸酶受到这些离子的作用又不尽相同。C a s e y 等

2+

2+

2+

2+

2+

-[6]

曾

指出A s p e r g i l l u s n i g e rA T C C 9142植酸酶在M g , M n , C u , C d , H g , Z n 和F 存在时中度激活植酸酶活性,

2+3+2+

不受F e 或F e 的影响, 但受到C a 的中度抑制。V a t s 等

[7]

2+

通过基因理性设计和随机突变子累积提取到A s p e r g i l l u s n i g e r v a n T e i g h e m , 该植酸酶不受大多

效应改善植酸酶的耐热性和最适p H 范围。上面提到的A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 突变子:耐热性突变株P h y A 18和2个p H 改变的菌株E 228K 和K 300E 。从随机突变子中筛选出4个突变子(S 149P , F 131L , K 112R , K 195R ) , 将这4个依次结合前面3个突变子, 融合在一起。突变子E 228K 将亲

本的p H 值从5. 5降到4. 0, 并且在p H 值为3. 5时特异性增加(P

1. 3　pH 的改善　动物胃内水解的p H 值约为3. 0～3. 5, 在该范围内A s p e r g i l l u s n i g e P h y A 活性最低, P h y B 在p H 值2. 5左右时具有较高催化活性, 但在通常认为的幼畜胃酸性环境下两者无活性。植酸酶的p H 值不仅与内部基因有关, 而且与外部缓冲液有关。K i m 等利用蛋白质理性设计改善A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 最佳p H 值, 以适应动物胃内的酸性环境。设计通过替换底物结合位点的氨基酸来改变活性位点的电荷量和极性, 以此达到改变酶的性质。根据P h y A 的晶体结构, 在Q 50, K 91, K 94, E 228, D 262, K 300和K 301位置进行单一或多重突变, 将这些突变子在P i c h i a p a s -t o r i s 酵母中表达。野生型有2个最适p H 值, 17个突变子或者丢掉其中一个或者将p H 值5. 5改变为更酸性的位点, 突变子E 228K 表现出更好更全面的变化, 最适p H 值突变为3. 8, 在p H 值3. 5时水解大豆植酸高出野生菌266%(P

W e a v e r 等

[14]

[13]

数的金属离子、抑制剂和有机溶剂的影响。非离子和阳离子去污剂(0. 1%～5. 0%)能够稳定酶活, 但是阴离子去污剂

(S D S ) 即使在0. 1%的水平也能严重抑制酶活。离液剂盐酸胍、尿素、碘化钾(0. 5～8. 0m o l /L ) 严重影响植酸酶活性。Z h a n g 等

2+

[9]

从A s p e r g i l l u s f i c u u mN T G -23中分离到一种酸性植

2+

2+

2+

酸酶, 该植酸酶活性不受金属离子(如C a , M g , M n , Z n ) 影响, 但是受到E D T A 影响。1. 5　底物特异性　真菌植酸酶的底物特异性很广泛。C a s e y 等

[6]

曾指出A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142植酸酶的底物首选为

[8]

植酸, 但也能水解非植酸磷酸化底物。G a r g o v a 等从野生

菌A s p e r g i l l u s n i g e r 分离到胞外3-植酸酶, 该酸性磷酸酶有广泛的底物特异性, 对植酸钠有很高的亲和性, 比对4-硝基苯磷酸盐的亲和力高出2. 5倍。Z h a n g 等

[9]

从A s p e r g i l l u s f i c u -

u mN T G -23中分离的酸性植酸酶底物广泛, 对胃蛋白酶和胰蛋白酶有很强的抗性。

[16]

1. 6　晶体结构　Xi a n g 等的研究表明A s p e r g i l l u s f i c u u m 晶体结构中携带磷酸化组氨酸。观察A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶的热稳定性高的晶体结构, 其晶体结构分辨率为1. 5 。A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶整体折叠结构类似于其他植酸酶。A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶与A s p e r g i l l u s f i c u u m 有66%的序列一致性, 但是A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶耐热性较差。这2个植酸酶结构的叠印显示出两者之间的一些重大差异。特别是A s -p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶极性残基的加入, 离子间的相互斥力消失, 形成氢键相互作用, 稳定的酶结构; C 末端由精氨酸残基替换诱导形成螺旋盖, 在高温变性后折叠复性时也起关键作用。A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 植酸酶的热弹性可能是由于各区域稳定性的增强, 这对于蛋白质的折叠至关重要; A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶耐热性的增强可能是由与A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 植酸酶等价的关键残基突变而来的。根据试验中电子密度推测出6个N -糖基化位点, 实际观测在晶体结构这些位点出现糖基化。此外, 这种酶的催化残基H i s 59出现部分磷酸化, 从而表现出反应中间体, 提供结构转变的洞察点, 这可能有助于理解酸性磷酸酶家族的催化机理。这种催化中间体可以确认组氨酸酸性磷酸酶家族的2步催化机理。1. 7　二硫键作用　As p e r g i l l u s s p . 植酸酶包含5个二硫键

[17]

通过定点突变扩大A s p e r g i l l u s n i g e P h y B 最

适p H 范围, 来适应幼畜胃部的p H 值范围。底物特异性位

点同一残基用不同的氨基酸替换, 设计2个突变体:E 272K 和E 272Q 。用一个中性氨基酸(E 272Q ) 或碱性氨基酸(E 272K ) 取代酸性氨基酸, 并在P i c h i a p a s t o r i s 酵母中超量表达。野生型的最适p H 值为2. 5, 突变子E 272K 的最适p H 值为3. 2。与野生型相比, 突变子E 272K 的K H 值2. 5m 值在p 时减少为原来的1/36, 在p H 值3. 2时减少为原来的1/6, 同时改善了底物的亲和力。

U l l a h 等研究了2种微生物植酸酶在4种不同的普通缓冲液下的p H 曲线。缓冲液中含有氯化钙、氯化钠和氟化钠。钙离子影响A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶, 最适p H 值升至8. 0。高浓度的氯化钠使真菌植酸酶的p H 值在3～4范围内徘徊, 而E . c o l i 的植酸酶p H 值则从5. 5降到2. 0。2种微生物的植酸酶在酸性条件下受到氟化钠的抑制。高浓度氯化, 75x m 2, [15]

。为了阐明它们的作用, 在二硫苏糖醇(D T T ) 有无的情

[18]

况下, 研究植酸酶的反应和折叠。W a n g 等为了探讨二硫

键, 利用固有荧光光谱, 远紫外圆二色的光谱(C D ) 和酶活性

,

12966　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年

酶催化活性、稳定性及构象的变化。变性剂浓度相同, 2m m o l /LD T T 存在, 酶失活和蛋白伸展大大提高。随着催化活性的变化, 荧光衍射发生最大红移, 椭圆度下降到222n m 。D T T 缺失时蛋白伸展动力学为2个一阶双相反应, D T T 存在时为1个一阶单相反应。由此可以说明酶失活最可能与构象变化有关, 二硫键在三维结构和催化活性中发挥重要作用。

U l l a h 等

[19]

H ib e r g -N i e l s e n 等

[22]

进行了小角度X 射线衍射糖基化

高的P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶(P h y ) 和其相应的去糖基化植酸酶(d g P h y ) , 以此阐明高浓度的糖蛋白之间的相互作用。首先, 相同的蛋白质浓度(m g /m l ) 下, P h y 的相对排除体积比

d g P h y 高出约75%,说明多聚糖显著提高排除体积。其次, d g P h y 相对排除体积随着蛋白浓度的增加而增加; 但是, P h y 排除体积随着蛋白浓度增加而降低。第3, 盐度对2种糖基化形式的效应明显不同。d g P h y 的相对排除体积随着离子强度的增加而减少, 而P h y 相对排除体积随着离子强度的增加而增强。所以多聚糖有助于蛋白的空间位阻稳定, 而且有助于维持复杂环境中糖基化间的静电斥力作用。

B a g g e r 等

[23]

利用动态光散射监测真菌植酸酶的变性和复

性, 探讨二硫键在植酸酶中的作用。氯化胍为变性剂, 透析

方法复性, 硫醇试剂防止复性。植酸酶在氯化胍下变性失活, 在磷酸三(2-氯乙基) 酯(T C E P ) 下复性, 这表明二硫键是折叠必要的。流体力学半径在有活性和无活性时分别为4和14n m 。通过透析去除变性剂植酸酶再折叠, 流体力学半径回至4n m 。变性植酸酶稀释法复性时, 温度在25～37℃范围内, 而不是较高的温度。此后U l l a h 等又用同样的方法研究了A s p e r g i l l u s n i g e r P h y B 植酸酶

[32]

分析P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶-S D S 系统糖蛋

白光热谱, 研究糖基化和表面活性剂的相互作用, 其中主要研究了十二烷基硫酸钠(S D S ) 和P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基

化、去糖基化2种形式之间的相互作用。24℃,S D S 滴定P h y 和d g P h y , 然后用等温滴定热量法(I T C ) 和同步辐射圆二色(S R C D ) 光谱研究分析。C D 光谱说明原酶状态和S D S 变性后状态基本类似, 因此2种糖基化形式变性前后结构相当。变性状态远非蛋白充分展开, 而是保留原来结构。此外, 还发现多聚糖对S D S 变性有稍微的抵制。植酸酶-S D S 的亲和性异常的低, 比以前报道的所有球状蛋白低了3～5倍。糖链和肽基团的相对亲和力分析结果表明, 糖键相对亲和性比表面活性剂低很多。饱和状态, 多聚糖吸附能力约为S D S (g /g ) 的1/2和普通蛋白的1/5。2　真菌植酸酶的表达

2. 1　真菌植酸酶在微生物宿主中的表达　真菌植酸酶在微生物系统中表达, 主要是在细菌中的大肠杆菌E . c o l i 和真菌

[24]

中的酵母菌中表达。H u o 等将来自A s p e r g i l l u s n i g e r F 246的植酸酶基因在大肠杆菌E . c o l i 中表达。从p M D 18T -植酸酶回收植酸酶基因片段, 与原核表达载体p E T 30a +连接, 构建重组表达载体p E T 30a +-植酸酶, 加I P T G 在大肠杆菌中高效诱导。S D S -P A G E 电泳检测到转化细胞裂解物中有明显的分子量为50k D 的蛋白带。通过吸收S D S -P A G E 和蛋白定量扫描估计, 该可溶性融合蛋白含量约占大肠杆菌转化细胞中可溶性蛋白的40%,它的植酸酶活性是天然植酸酶的8倍。植酸酶在大肠杆菌E . c o l i 表达是获取和提高植酸酶活性的基础研究, 基础研究促进新的微生态制剂的发展。

Z h a o 等

[25]

, 1. 0m o l /LG u C l 时,

P h y B 植酸酶蛋白流体力学半径从5. 5n m 降到4. 4n m , 183k D 的活性同型二聚体降到92k D 的单体。分子量和折叠状

态之间的关系是真菌植酸酶组氨酸酸性磷酸酶(H A P ) 的重要特征之一。P h y A 植酸酶在氯化钠为0. 5m o l /L 时活力爆发, 同样条件下P h y B 植酸酶受到严重抑制。P h y A 植酸酶和P h y B 植酸酶结构差异很大, 活性位点和底物结合区的化学环境也不同, 所以它们受单价阳离子的作用也不同。

在研究植酸酶活性时发现真菌组氨酸磷酸酶氨基酸中有一个保守的8-半胱氨酸基序

[20]

。这些保守的氨基酸并不

与催化功能直接联系, 但是对二硫键的形成至关重要。它们的作用类似于另一个8-半胱氨酸基序, 而后者基序最近在近

500种植物多肽氨基酸序列中有过报道。还有一个由2个半胱氨酸组成的二硫键在所有丝状子囊菌植酸酶的N -末形成。众所周知, 二硫键增加蛋白质的稳定性和耐热性。因此, 有理由认为这些额外的二硫键有助于黑曲霉植酸酶稳定性。1. 8　糖基化效应　真核细胞中蛋白糖基化发生在复杂的内质网环境中。糖基化是真菌植酸酶与细菌植酸酶的差别所在, 也是真菌植酸酶耐热的关键因素之一。真菌植酸酶中P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化程度最高, 大多数研究者利用该酶研究真菌植酸酶糖基化的影响。

[21]

H ib e r g -N i e l s e n 等研究P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化和聚合反应动力学的相互关系。P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶有糖基化形式(P h y ) 和去糖基化形式(d g P h y ) , 动态(D L S ) 和静态(S L S ) 的光散射研究它们的动力学和热稳定性, 发现离开平衡变性温度T (d ) , 多聚糖有力促进动力学稳定性(即降低了不可逆转的变性率) 。例如在p H 值4. 5～5. 0, T (d ) 差异仅为1～3℃时, d g P h y 聚集率比P h y 快200倍。此外, 2种形式的第二维里系数B (22) 用S L S 测量。P h y 的聚集率随热变性蛋白的浓度缩放, 说明一阶动力学与热变性状态有关。类似但不显著的相关性在d g P h y 中也有发现, d g P h y 的聚集过程是由变性蛋白质控制的。对B (22) 的测量显示, d g P h y 稍高于P h y , 表明与P h y 相比, d g P h y 更受缓冲液的影响, 因此可以排除多聚糖强水化作用是动力学稳定性的原由。聚集作用。

将具有优良特性的A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶

(P h y A ) 在P i c h i a p a s t o r i s 克隆并超量表达。高产细胞外植酸酶菌株A s p e r g i l l u s n i g e r s p . 植酸酶基因克隆并在P i c h i a p a s t o -r i s G S 115中表达, 分泌表达载体为p P I C Z a l p h a A 。复合诱导

培养基(B u f f e r e d m e t h a n o l c o m p l e x m e d i u m , B M M Y ) 培养4d , 甲醇作为诱导剂, 催化植酸酶体外分泌。发酵液中表达植酸酶的活性为天然植酸酶的30000倍, 天然植酸酶活性为503U /mg 。L i n e w e a v e r -B u r k p l o t (莱思威佛-伯克作图法) 显示植酸钠的K 196m m o l /L , p -n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e (对硝m 值为0. 基苯酚磷酸盐) 的K 16m m o l /L 。耐热性试验显示m 值为18. 重组植酸酶90℃5m i n 活性为原来的70%,90℃30m i n 活性为原来的65%,高于商业植酸酶。

38卷24期　　　　　　　　　　　　　　　　武燕平等　真菌植酸酶的研究现状和前景12967

重组蛋白生产, 成为新型的平台。这个研究领域又叫作分子农业, 其发展迅速, 一些植物源重组蛋白已进入临床试验阶段。广泛的比较研究发现糖基化植酸酶(来自A s p e r g i l l u s n i -g e r ) 在不同的植株(包括烟草和标准豆科M e d i c a g o t r u n c a t u -l a ) 中表达, 特别是M . t r u n c a t u l a , 其叶子累计植酸酶达到最高水平, 是一个很有前途的生产体系

[26]

印迹、蛋白印迹和酶活性分析, 该技术证实蛋白能够在鱼内表达、活跃和分泌。同样的饲料转基因鱼明显高于未转基因鱼类, 而且在一种以植酸为主要的饲料中转基因鱼高出未转基因鱼的6倍, 当喂养鱼类的饲料中添加植酸酶时也出现以

上结果, 表明无论是喂养植酸酶还是将基因转入鱼类体内, 都能有效降解植酸, 并且能克服一些抗营养因素。

将从黑曲霉菌株A s p e r g i l l u s n i g e r 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫-杆状病毒表达系统中表达, S D S -P A G E 电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1. 43和1. 90g /L血淋巴液。酶活性测定结果表明, 在蚕体和蛹的表达活性分别为4. 67×10和5. 99×10U /L 血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60℃,最适p H 值为5. 5～5. 0和2. 5。杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性, 可以用于生产饲用植酸酶。3　结论和展望　

植酸酶降解植酸, 减少环境中磷负荷, 降低蛋白的螯合性, 提高金属的生物利用效用, 是环境友好因子。作为饲料添加剂的植酸酶来源于A s p e r g i l l u s n i g e r , 因为A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶产量最高, 比活也好。A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶因其基因中含有耐热基因, 所以其具有耐热性。真菌植酸酶中P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化程度最高, 糖基化有助于稳定蛋白空间结构和维持复杂环境中静电斥力作用, 从而稳定植酸酶活性, 而且糖基化能提高植酸酶的耐热性。真菌植酸酶各具特性, 如果将它们综合在一起, 将是理想的商业菌株。

植酸酶在大肠杆菌E . c o l i 和真菌中的酵母菌中表达, 研究这些基础能够促进新的微生态制剂的发展。而植酸酶基因子在植物中表达则是大势所趋, 植物取代传统的大规模重组蛋白生产, 成为新型的平台。如果表达嵌合植酸酶基因植物和土壤改良剂相结合, 有可能提高作物磷营养, 提高农业系统磷肥的效率。参考文献

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8

8

[31]

。植物可以用作植

酸酶的生产基地, 也可以直接作为动物饲料。真菌植酸酶因其活性高、耐热好, 是生产转基因植物优良的基因来源。U l l a h 等将来自A s p e r g i l l u s f i c u u m 的真菌植酸酶基因

克隆和在马铃薯叶片表达。该重组酶具有催化活性且酶活稳定, 双子叶植物的叶片表达蛋白保持A . f i c u u m 植酸酶物理和化学的基本特性, 表达酶的糖基化低于天然植酸酶15%,真菌植酸酶的特性———双峰p H 值, 也发生改变。尽管如此, 植酸最适p H 值5. 0保持不变, p H 值4. 0合成底物对硝基苯磷酸盐也不变, 最适温度也保持不变。表达植酸酶与天然酶一样受到伪底物、六硫肌醇(m y o -i n o s i t o l h e x a s u l f a t e ) 的抑制, 在抑制剂浓度20m m o l /L时失去约90%的活性。类似标准植酸酶, 叶中表达植酸酶在精氨酸修饰的苯甲酰甲醛下完全失活。此外, 叶片表达植酸酶20-m e r 内肽受抗体的抑制, 经X 光推测它存在于真菌植酸酶三维结构的分子表面。生化证据表明, 真菌植酸酶在叶片中克隆和表达, 建立一个稳定而积极的生物催化系统。

G e o r g e 等[28]将来自土壤真菌A s p e r g i l l u s n i g e r 的嵌合植酸酶基因(e x ::p h y A ) 转入N i c o t i a n a t a b a c u m (烟草) 表达。与矢量控制和野生型植物相比, 3个独立转化株胞外植酸酶活性增加, 前两者都没有检测到胞外植酸酶。转基因N . t a b a -c u m 植物种植在无菌琼脂上, 植酸释放的磷为矢量控制植物的3. 7倍。尽管如此, 在2个未经修正的磷缺乏的土壤中, 植物表达嵌合植酸酶基因, 并没有改善磷的释放量。但是当土壤经由磷酸盐和石灰或植酸改良后, 转基因植物比对照组多出52%的积累磷。很多实例显示转基因植物的积极效应与土壤中植酸的含量相对应。植物分泌植酸酶到土壤中, 不一定能确保改善植物中磷元素, 因为土壤中植酸可用性也至关重要。不过如果表达嵌合植酸酶基因植物和土壤改良剂相结合, 有可能提高作物磷营养, 提高农业系统磷肥的效率。L i 等将来自A s p e r g i l l u s f i c u u m 的植酸酶基因(A f -P h y A ) , A r a b i d o p s i s (拟南芥)P k y 10g e n e 启动子和胡萝卜的e x t e n s i n 信号肽三者连接在大豆中表达, 使其具有根特异性和分泌表达性。转基因大豆根部分泌物中植酸酶活性和磷含量分别为4. 7U /mg 和439m m o l /L , 而对照分别为0. 8U /m g 和120m m o l /L。根特异性启动子对重组植酸酶的分泌存在潜在的性能, 为土壤中植酸分解成无机磷为植物利用提供新的前景。

2. 3　真菌植酸酶在动物中的表达　鱼类不利用植酸磷, 从而给水环境带来磷污染。进一步研究, 植酸螯合金属和蛋白, 造成它们的无效利用。而植酸酶可以降解植酸产生无机磷, 从而被鱼类直接利用。H o s t e t l e r 等

[30]

[29]

[27]

将A s p e r g i l l u s n i g e r

植酸酶基因转入日本青鳉, 改善对植酸的吸收利用。生长模型检测到鱼降解植酸的可行性和效率, 同时检测鱼生长和植-P C R

12968　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年

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(上接第12947页)

降趋势, 只有淀粉含量还在增高; 花后第50天, 所测有机物质含量均呈下降趋势。由此可见, 花后第50天物质积累已

经基本完成, 白茄子种子已经具备基本发芽力, 可作为生产上指导采种期。

(4) 白茄子与对照在物质积累及含水量变化趋势方面存在明显差异, 说明同一物种不同品种间种子发育生理成熟时期存在差异。所以在其他茄果类种子生产上应结合自身生理变化特性, 确定种子成熟时期。白茄子与对照品种的种子发育生理变化波动情况及积累水平也均存在明显的差异。

总之, 花后50d 白茄子已经具备发芽力, 可作为生产上的指导采种时期。白茄子各项指标与对照品种差异较显著, 其有机物质积累水平均低于对照。参考文献

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安徽农业科学, J o u r n a l o f A n h u i A g r i . S c i . 2010, 38(24) :12964-12968责任编辑　郑丹丹　责任校对　况玲玲

真菌植酸酶的研究现状和前景

武燕平, 杨平平

＊

　(山东轻工业学院, 山东济南

250353)

摘要　介绍真菌植酸酶的最新研究进展, 其中着重介绍了真菌植酸酶的耐热性提高、pH 改善方法、二硫键的作用以及真菌植酸酶糖基化效应的影响。

关键词　真菌植酸酶; 糖基化; 二硫键; 耐热性中图分类号　S816. 7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010) 24-12964-05R e s e a r c h S t a t u s a n dF o r e g r o u n d o f F u n g a l P h y t a s e WUY a n -p i n g e t a l 　(S h a n d o n g I n s t i t u t e o f L i g h t I n d u s t r y , J i n a n , S h a n d o n g 250353) A b s t r a c t 　Th e l a t e s t r e s e a r c hp r o g r e s s e s o n f u n g a l p h y t a s e w e r e i n t r o d u c e d . T h e m e t h o d s o f e n h a n c i n g t h e t h e r m o -s t a b i l i t y o f f u n g a l p h y t a s e a n d i m p r o v i n g p H , t h e f u n c t i o no f d i s u l f i d e b o n d s , t h e g l y c o s y l a t i o n e f f e c t i n f u n g a l p h y t a s e w e r e m a i n l y i n t r o d u c e d . K e y w o r d s 　Fu n g a l p h y t a s e ; G l y c o s y l a t i o n ; D i s u l f i d e b o n d s ; T h e r m o -s t a b i l i t y

　　植酸[m y o -i n o s i t o l (1, 2, 3, 4, 5, 6) h e x a k i s p h o s p h a t e (I U -P A C -I U B , 1968) ]是磷在谷物、豆类和油料等作物籽实中的基本贮存方式, 含量高达1%～3%,占植物中总磷的60%～80%

[1]

酶活最大值出现在p H 值2. 5和温度52～55℃。加入10m m o l /L 甘氨酸55℃孕育24h , 酶活保持97%,同样条件下, 不加热保护剂, 酶活保持87%。V 和K m a x m 值分别为1074I U /ml 和606m m o l /L 。

G a r g o v a 等[8]从野生菌A s p e r g i l l u s n i g e r 中分离到胞外酸性磷酸酶, 此植酸酶为3-植酸酶。蛋白纯化由P S 50膜连续超滤, S e p h a d e x G -100凝胶过滤, D E A E -S e p h a r o s e C L 6B 和C M -S e p h a r o s e C L 6B 离子交换层析。最大催化速率出现在p H 值2. 0～2. 4和温度66℃。

中国农业科学院Z h a n g 等

[9]

。植酸是一种阴离子螯合剂, 它与多种二价阳离子形

[2]

2+

2+

2+

2+

2+

2+

成复合物, 如C a 、Mg 、Zn 、Cu 、Fe 和M n 。而且

植酸与蛋白形成复合物, 它们之间的相互作用力影响到蛋白的空间结构, 从而导致蛋白水溶性、水解能力及酶活降低

[3]

。

植酸酶(m y o -i n o s i t o l h e x a k i s p h o s p h a t e p h o s p h o h y d r o l a s e s ) 催化植酸水解成五磷酸肌醇(I P 或I P P 。植酸完全水5) 3或I 解产物是1分子的肌醇和6分子的无机磷。根据植酸原始脱磷位点不同, 植酸酶大致可分为3类:3-植酸酶(E C 3. 1. 3. 8) , 6-植酸酶和5-植酸酶。其中3-植酸酶来自A s p e r g i l l u s n i g e r , N e u r o s p o r a c r a s s a , P s e u d o m o n a s , K l e b s i e l l a s p . A S R 1等真菌微

生物, 水解开始于植酸上第3个碳位点[4]。根据催化机制也可以将植酸酶分为3类

[5]

从A s p e r g i l l u s f i c u u mN T G -23

中分离一种新的植酸酶。蛋白纯化经过D E A E -c e l l u l o s e 离子交换层析, S u p e r d e x 75C M -纤维素柱和S u p e r d e x 75F P L C -凝胶过滤步骤。凝胶过滤和S D S -P A G E 显示此酶分子量为65. 5k D , 最适p H 值1. 3, 最适温度67℃,K . 295m m o l /L, m 值为0V 为55. 9n m o l /mi n 。60℃酶活不变, 70℃孵育20m i n 酶m a x

活无明显损失。

1. 2　耐热性的提高方法　在饲料加工中制丸需要高温和蒸汽工序, 因此提高植酸酶的耐热性有利于减少植酸酶活性在制丸中的损失。研究者发现嗜热微生物的植酸酶耐热性较好, 只是产量远远达不到工业要求, 所以在商业植酸酶的基础上利用定点突变、蛋白设计和寻找修饰耐热基因等方法提高酶的耐热性。C h e n 等

[10]

:①组氨酸植酸酶或称酸性植酸酶

H A P s (E C 3. 1. 3. 2) ; ②β-螺旋植酸酶B P P s (E C 3. 1. 3. 8) ; ③

紫酸磷酸酶或半胱氨酸植酸酶P A P s (E C 3. 1. 3. 2) 。其中来自真菌和E . c o l i 的植酸酶属于第①类, 这类酶拥有相同的活性序列(R H G X R X P ) 、催化中心和10个半胱氨酸残基。1　真菌植酸酶活性1. 1　纯化和性质　关于真菌植酸酶的纯化和性质有大量的报道。C a s e y 等曾报道A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶的纯化及其性质。A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶经过超滤、离子交换层析、凝胶过滤和等电聚焦层析等纯化步骤。纯化后的酶分子量为84k D , 单体蛋白; 最适温度和最适p H 值分别为65℃和5. 0; K 值分别为100m m o l /L 和7m 值和V m a x n m o l /s , 这些值与以前的微生物植酸酶报道的范围相符。A s -p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142胞外酶在80℃时的耐热性比2种商业植酸酶产品要好。

V a t s 等

[7]

[6]

利用基因结构延伸突变改善酶的

热稳定性。将来源于A s p e r g i l l u s n i g e r N 25的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体p E T -30b (+) 上, 以重组表达载体

p E T -30b -F p h y A (m ) 为模板经P C R 扩增获得结构延伸突变植酸酶基因p h y A (e ) , 在植酸酶基因C 端增加了来源于p E T -30b -F p h y A (m ) 载体上的13个氨基酸残基。含突变基因的重组表达载体p P I C 9k -p h y A (e ) 在G S 115酵母中表达。纯化的突变体p p -N P (e ) 与野生型酶P P -N P (m ) -8相比, P P -N P A (e ) 的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10m i n , 热稳定性比野生型提高21%,比活力略有提高。最适反应p H 值为5. 6, 有效p H 值范围4. 6～6. 6, 比未突变菌株扩大了0. 4个单位。

Z h a n g 等

[11]

从腐烂木材中分离到A s p e r g i l l u s n i g e rv a n

T e i g h e m , 胞外酶活性为22592U /mg 。经过离子交换和凝胶

过滤2种层析纯化, 纯化后的分子性质显示出这个天然植酸酶是一种低聚物, 分子量为353k D , 单体为66k D 。纯化后的

作者简介　武燕平(1983-) , 女, 山东菏泽人, 硕士研究生, 研究方向:

微生物制药。＊通讯作者, 博士, 教授, 硕士生导师, E -m a i l :j i a n n a n y p p @163. c o m 。

收稿日期　2010-05-10

研究A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶氢键网络和离

子相互作用力在耐热性中所起的作用, 利用同源性修饰A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 的耐热性。与同源微生物相比,

A s p e r g m (A f p )

38卷24期　　　　　　　　　　　　　　　　武燕平等　真菌植酸酶的研究现状和前景12965

残基(E 35, S 42, R 168, R 248) , 在E 35-S 42区域形成了氢键网络, 在R 168-R 248和D 161-D 244区域具有离子相互作用。研究中, A f p 在E 35A , R 168A 和R 248A 区域或单独缺失或联合缺失形成具有缺失功能的7个突变子。7个突变子的热稳定性均下降, 最高损失25%(P

此后, Z h a n g 等

[12]

是盐离子影响到静电环境, 增强了产物从活性位点分离的能力。模型研究显示虽然活性位点与八肽定位相似, 但是α-螺旋、β折叠及卷曲在排列上有些不同, 这些可以解释实测到的催化作用和盐作用的不同。

1. 4　酶活影响因素　酶活性不仅受到金属离子、抑制剂、有机离子的影响, 还受到去污剂和离液剂等的影响, 但不同来源的植酸酶受到这些离子的作用又不尽相同。C a s e y 等

2+

2+

2+

2+

2+

-[6]

曾

指出A s p e r g i l l u s n i g e rA T C C 9142植酸酶在M g , M n , C u , C d , H g , Z n 和F 存在时中度激活植酸酶活性,

2+3+2+

不受F e 或F e 的影响, 但受到C a 的中度抑制。V a t s 等

[7]

2+

通过基因理性设计和随机突变子累积提取到A s p e r g i l l u s n i g e r v a n T e i g h e m , 该植酸酶不受大多

效应改善植酸酶的耐热性和最适p H 范围。上面提到的A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 突变子:耐热性突变株P h y A 18和2个p H 改变的菌株E 228K 和K 300E 。从随机突变子中筛选出4个突变子(S 149P , F 131L , K 112R , K 195R ) , 将这4个依次结合前面3个突变子, 融合在一起。突变子E 228K 将亲

本的p H 值从5. 5降到4. 0, 并且在p H 值为3. 5时特异性增加(P

1. 3　pH 的改善　动物胃内水解的p H 值约为3. 0～3. 5, 在该范围内A s p e r g i l l u s n i g e P h y A 活性最低, P h y B 在p H 值2. 5左右时具有较高催化活性, 但在通常认为的幼畜胃酸性环境下两者无活性。植酸酶的p H 值不仅与内部基因有关, 而且与外部缓冲液有关。K i m 等利用蛋白质理性设计改善A s -p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶(P h y A ) 最佳p H 值, 以适应动物胃内的酸性环境。设计通过替换底物结合位点的氨基酸来改变活性位点的电荷量和极性, 以此达到改变酶的性质。根据P h y A 的晶体结构, 在Q 50, K 91, K 94, E 228, D 262, K 300和K 301位置进行单一或多重突变, 将这些突变子在P i c h i a p a s -t o r i s 酵母中表达。野生型有2个最适p H 值, 17个突变子或者丢掉其中一个或者将p H 值5. 5改变为更酸性的位点, 突变子E 228K 表现出更好更全面的变化, 最适p H 值突变为3. 8, 在p H 值3. 5时水解大豆植酸高出野生菌266%(P

W e a v e r 等

[14]

[13]

数的金属离子、抑制剂和有机溶剂的影响。非离子和阳离子去污剂(0. 1%～5. 0%)能够稳定酶活, 但是阴离子去污剂

(S D S ) 即使在0. 1%的水平也能严重抑制酶活。离液剂盐酸胍、尿素、碘化钾(0. 5～8. 0m o l /L ) 严重影响植酸酶活性。Z h a n g 等

2+

[9]

从A s p e r g i l l u s f i c u u mN T G -23中分离到一种酸性植

2+

2+

2+

酸酶, 该植酸酶活性不受金属离子(如C a , M g , M n , Z n ) 影响, 但是受到E D T A 影响。1. 5　底物特异性　真菌植酸酶的底物特异性很广泛。C a s e y 等

[6]

曾指出A s p e r g i l l u s n i g e r A T C C 9142植酸酶的底物首选为

[8]

植酸, 但也能水解非植酸磷酸化底物。G a r g o v a 等从野生

菌A s p e r g i l l u s n i g e r 分离到胞外3-植酸酶, 该酸性磷酸酶有广泛的底物特异性, 对植酸钠有很高的亲和性, 比对4-硝基苯磷酸盐的亲和力高出2. 5倍。Z h a n g 等

[9]

从A s p e r g i l l u s f i c u -

u mN T G -23中分离的酸性植酸酶底物广泛, 对胃蛋白酶和胰蛋白酶有很强的抗性。

[16]

1. 6　晶体结构　Xi a n g 等的研究表明A s p e r g i l l u s f i c u u m 晶体结构中携带磷酸化组氨酸。观察A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶的热稳定性高的晶体结构, 其晶体结构分辨率为1. 5 。A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶整体折叠结构类似于其他植酸酶。A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶与A s p e r g i l l u s f i c u u m 有66%的序列一致性, 但是A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶耐热性较差。这2个植酸酶结构的叠印显示出两者之间的一些重大差异。特别是A s -p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶极性残基的加入, 离子间的相互斥力消失, 形成氢键相互作用, 稳定的酶结构; C 末端由精氨酸残基替换诱导形成螺旋盖, 在高温变性后折叠复性时也起关键作用。A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 植酸酶的热弹性可能是由于各区域稳定性的增强, 这对于蛋白质的折叠至关重要; A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶耐热性的增强可能是由与A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 植酸酶等价的关键残基突变而来的。根据试验中电子密度推测出6个N -糖基化位点, 实际观测在晶体结构这些位点出现糖基化。此外, 这种酶的催化残基H i s 59出现部分磷酸化, 从而表现出反应中间体, 提供结构转变的洞察点, 这可能有助于理解酸性磷酸酶家族的催化机理。这种催化中间体可以确认组氨酸酸性磷酸酶家族的2步催化机理。1. 7　二硫键作用　As p e r g i l l u s s p . 植酸酶包含5个二硫键

[17]

通过定点突变扩大A s p e r g i l l u s n i g e P h y B 最

适p H 范围, 来适应幼畜胃部的p H 值范围。底物特异性位

点同一残基用不同的氨基酸替换, 设计2个突变体:E 272K 和E 272Q 。用一个中性氨基酸(E 272Q ) 或碱性氨基酸(E 272K ) 取代酸性氨基酸, 并在P i c h i a p a s t o r i s 酵母中超量表达。野生型的最适p H 值为2. 5, 突变子E 272K 的最适p H 值为3. 2。与野生型相比, 突变子E 272K 的K H 值2. 5m 值在p 时减少为原来的1/36, 在p H 值3. 2时减少为原来的1/6, 同时改善了底物的亲和力。

U l l a h 等研究了2种微生物植酸酶在4种不同的普通缓冲液下的p H 曲线。缓冲液中含有氯化钙、氯化钠和氟化钠。钙离子影响A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶, 最适p H 值升至8. 0。高浓度的氯化钠使真菌植酸酶的p H 值在3～4范围内徘徊, 而E . c o l i 的植酸酶p H 值则从5. 5降到2. 0。2种微生物的植酸酶在酸性条件下受到氟化钠的抑制。高浓度氯化, 75x m 2, [15]

。为了阐明它们的作用, 在二硫苏糖醇(D T T ) 有无的情

[18]

况下, 研究植酸酶的反应和折叠。W a n g 等为了探讨二硫

键, 利用固有荧光光谱, 远紫外圆二色的光谱(C D ) 和酶活性

,

12966　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年

酶催化活性、稳定性及构象的变化。变性剂浓度相同, 2m m o l /LD T T 存在, 酶失活和蛋白伸展大大提高。随着催化活性的变化, 荧光衍射发生最大红移, 椭圆度下降到222n m 。D T T 缺失时蛋白伸展动力学为2个一阶双相反应, D T T 存在时为1个一阶单相反应。由此可以说明酶失活最可能与构象变化有关, 二硫键在三维结构和催化活性中发挥重要作用。

U l l a h 等

[19]

H ib e r g -N i e l s e n 等

[22]

进行了小角度X 射线衍射糖基化

高的P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶(P h y ) 和其相应的去糖基化植酸酶(d g P h y ) , 以此阐明高浓度的糖蛋白之间的相互作用。首先, 相同的蛋白质浓度(m g /m l ) 下, P h y 的相对排除体积比

d g P h y 高出约75%,说明多聚糖显著提高排除体积。其次, d g P h y 相对排除体积随着蛋白浓度的增加而增加; 但是, P h y 排除体积随着蛋白浓度增加而降低。第3, 盐度对2种糖基化形式的效应明显不同。d g P h y 的相对排除体积随着离子强度的增加而减少, 而P h y 相对排除体积随着离子强度的增加而增强。所以多聚糖有助于蛋白的空间位阻稳定, 而且有助于维持复杂环境中糖基化间的静电斥力作用。

B a g g e r 等

[23]

利用动态光散射监测真菌植酸酶的变性和复

性, 探讨二硫键在植酸酶中的作用。氯化胍为变性剂, 透析

方法复性, 硫醇试剂防止复性。植酸酶在氯化胍下变性失活, 在磷酸三(2-氯乙基) 酯(T C E P ) 下复性, 这表明二硫键是折叠必要的。流体力学半径在有活性和无活性时分别为4和14n m 。通过透析去除变性剂植酸酶再折叠, 流体力学半径回至4n m 。变性植酸酶稀释法复性时, 温度在25～37℃范围内, 而不是较高的温度。此后U l l a h 等又用同样的方法研究了A s p e r g i l l u s n i g e r P h y B 植酸酶

[32]

分析P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶-S D S 系统糖蛋

白光热谱, 研究糖基化和表面活性剂的相互作用, 其中主要研究了十二烷基硫酸钠(S D S ) 和P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基

化、去糖基化2种形式之间的相互作用。24℃,S D S 滴定P h y 和d g P h y , 然后用等温滴定热量法(I T C ) 和同步辐射圆二色(S R C D ) 光谱研究分析。C D 光谱说明原酶状态和S D S 变性后状态基本类似, 因此2种糖基化形式变性前后结构相当。变性状态远非蛋白充分展开, 而是保留原来结构。此外, 还发现多聚糖对S D S 变性有稍微的抵制。植酸酶-S D S 的亲和性异常的低, 比以前报道的所有球状蛋白低了3～5倍。糖链和肽基团的相对亲和力分析结果表明, 糖键相对亲和性比表面活性剂低很多。饱和状态, 多聚糖吸附能力约为S D S (g /g ) 的1/2和普通蛋白的1/5。2　真菌植酸酶的表达

2. 1　真菌植酸酶在微生物宿主中的表达　真菌植酸酶在微生物系统中表达, 主要是在细菌中的大肠杆菌E . c o l i 和真菌

[24]

中的酵母菌中表达。H u o 等将来自A s p e r g i l l u s n i g e r F 246的植酸酶基因在大肠杆菌E . c o l i 中表达。从p M D 18T -植酸酶回收植酸酶基因片段, 与原核表达载体p E T 30a +连接, 构建重组表达载体p E T 30a +-植酸酶, 加I P T G 在大肠杆菌中高效诱导。S D S -P A G E 电泳检测到转化细胞裂解物中有明显的分子量为50k D 的蛋白带。通过吸收S D S -P A G E 和蛋白定量扫描估计, 该可溶性融合蛋白含量约占大肠杆菌转化细胞中可溶性蛋白的40%,它的植酸酶活性是天然植酸酶的8倍。植酸酶在大肠杆菌E . c o l i 表达是获取和提高植酸酶活性的基础研究, 基础研究促进新的微生态制剂的发展。

Z h a o 等

[25]

, 1. 0m o l /LG u C l 时,

P h y B 植酸酶蛋白流体力学半径从5. 5n m 降到4. 4n m , 183k D 的活性同型二聚体降到92k D 的单体。分子量和折叠状

态之间的关系是真菌植酸酶组氨酸酸性磷酸酶(H A P ) 的重要特征之一。P h y A 植酸酶在氯化钠为0. 5m o l /L 时活力爆发, 同样条件下P h y B 植酸酶受到严重抑制。P h y A 植酸酶和P h y B 植酸酶结构差异很大, 活性位点和底物结合区的化学环境也不同, 所以它们受单价阳离子的作用也不同。

在研究植酸酶活性时发现真菌组氨酸磷酸酶氨基酸中有一个保守的8-半胱氨酸基序

[20]

。这些保守的氨基酸并不

与催化功能直接联系, 但是对二硫键的形成至关重要。它们的作用类似于另一个8-半胱氨酸基序, 而后者基序最近在近

500种植物多肽氨基酸序列中有过报道。还有一个由2个半胱氨酸组成的二硫键在所有丝状子囊菌植酸酶的N -末形成。众所周知, 二硫键增加蛋白质的稳定性和耐热性。因此, 有理由认为这些额外的二硫键有助于黑曲霉植酸酶稳定性。1. 8　糖基化效应　真核细胞中蛋白糖基化发生在复杂的内质网环境中。糖基化是真菌植酸酶与细菌植酸酶的差别所在, 也是真菌植酸酶耐热的关键因素之一。真菌植酸酶中P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化程度最高, 大多数研究者利用该酶研究真菌植酸酶糖基化的影响。

[21]

H ib e r g -N i e l s e n 等研究P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化和聚合反应动力学的相互关系。P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶有糖基化形式(P h y ) 和去糖基化形式(d g P h y ) , 动态(D L S ) 和静态(S L S ) 的光散射研究它们的动力学和热稳定性, 发现离开平衡变性温度T (d ) , 多聚糖有力促进动力学稳定性(即降低了不可逆转的变性率) 。例如在p H 值4. 5～5. 0, T (d ) 差异仅为1～3℃时, d g P h y 聚集率比P h y 快200倍。此外, 2种形式的第二维里系数B (22) 用S L S 测量。P h y 的聚集率随热变性蛋白的浓度缩放, 说明一阶动力学与热变性状态有关。类似但不显著的相关性在d g P h y 中也有发现, d g P h y 的聚集过程是由变性蛋白质控制的。对B (22) 的测量显示, d g P h y 稍高于P h y , 表明与P h y 相比, d g P h y 更受缓冲液的影响, 因此可以排除多聚糖强水化作用是动力学稳定性的原由。聚集作用。

将具有优良特性的A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶

(P h y A ) 在P i c h i a p a s t o r i s 克隆并超量表达。高产细胞外植酸酶菌株A s p e r g i l l u s n i g e r s p . 植酸酶基因克隆并在P i c h i a p a s t o -r i s G S 115中表达, 分泌表达载体为p P I C Z a l p h a A 。复合诱导

培养基(B u f f e r e d m e t h a n o l c o m p l e x m e d i u m , B M M Y ) 培养4d , 甲醇作为诱导剂, 催化植酸酶体外分泌。发酵液中表达植酸酶的活性为天然植酸酶的30000倍, 天然植酸酶活性为503U /mg 。L i n e w e a v e r -B u r k p l o t (莱思威佛-伯克作图法) 显示植酸钠的K 196m m o l /L , p -n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e (对硝m 值为0. 基苯酚磷酸盐) 的K 16m m o l /L 。耐热性试验显示m 值为18. 重组植酸酶90℃5m i n 活性为原来的70%,90℃30m i n 活性为原来的65%,高于商业植酸酶。

38卷24期　　　　　　　　　　　　　　　　武燕平等　真菌植酸酶的研究现状和前景12967

重组蛋白生产, 成为新型的平台。这个研究领域又叫作分子农业, 其发展迅速, 一些植物源重组蛋白已进入临床试验阶段。广泛的比较研究发现糖基化植酸酶(来自A s p e r g i l l u s n i -g e r ) 在不同的植株(包括烟草和标准豆科M e d i c a g o t r u n c a t u -l a ) 中表达, 特别是M . t r u n c a t u l a , 其叶子累计植酸酶达到最高水平, 是一个很有前途的生产体系

[26]

印迹、蛋白印迹和酶活性分析, 该技术证实蛋白能够在鱼内表达、活跃和分泌。同样的饲料转基因鱼明显高于未转基因鱼类, 而且在一种以植酸为主要的饲料中转基因鱼高出未转基因鱼的6倍, 当喂养鱼类的饲料中添加植酸酶时也出现以

上结果, 表明无论是喂养植酸酶还是将基因转入鱼类体内, 都能有效降解植酸, 并且能克服一些抗营养因素。

将从黑曲霉菌株A s p e r g i l l u s n i g e r 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫-杆状病毒表达系统中表达, S D S -P A G E 电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1. 43和1. 90g /L血淋巴液。酶活性测定结果表明, 在蚕体和蛹的表达活性分别为4. 67×10和5. 99×10U /L 血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60℃,最适p H 值为5. 5～5. 0和2. 5。杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性, 可以用于生产饲用植酸酶。3　结论和展望　

植酸酶降解植酸, 减少环境中磷负荷, 降低蛋白的螯合性, 提高金属的生物利用效用, 是环境友好因子。作为饲料添加剂的植酸酶来源于A s p e r g i l l u s n i g e r , 因为A s p e r g i l l u s n i g e r 植酸酶产量最高, 比活也好。A s p e r g i l l u s f i c u u m 植酸酶因其基因中含有耐热基因, 所以其具有耐热性。真菌植酸酶中P e n i o p h o r a l y c i i 植酸酶糖基化程度最高, 糖基化有助于稳定蛋白空间结构和维持复杂环境中静电斥力作用, 从而稳定植酸酶活性, 而且糖基化能提高植酸酶的耐热性。真菌植酸酶各具特性, 如果将它们综合在一起, 将是理想的商业菌株。

植酸酶在大肠杆菌E . c o l i 和真菌中的酵母菌中表达, 研究这些基础能够促进新的微生态制剂的发展。而植酸酶基因子在植物中表达则是大势所趋, 植物取代传统的大规模重组蛋白生产, 成为新型的平台。如果表达嵌合植酸酶基因植物和土壤改良剂相结合, 有可能提高作物磷营养, 提高农业系统磷肥的效率。参考文献

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8

8

[31]

。植物可以用作植

酸酶的生产基地, 也可以直接作为动物饲料。真菌植酸酶因其活性高、耐热好, 是生产转基因植物优良的基因来源。U l l a h 等将来自A s p e r g i l l u s f i c u u m 的真菌植酸酶基因

克隆和在马铃薯叶片表达。该重组酶具有催化活性且酶活稳定, 双子叶植物的叶片表达蛋白保持A . f i c u u m 植酸酶物理和化学的基本特性, 表达酶的糖基化低于天然植酸酶15%,真菌植酸酶的特性———双峰p H 值, 也发生改变。尽管如此, 植酸最适p H 值5. 0保持不变, p H 值4. 0合成底物对硝基苯磷酸盐也不变, 最适温度也保持不变。表达植酸酶与天然酶一样受到伪底物、六硫肌醇(m y o -i n o s i t o l h e x a s u l f a t e ) 的抑制, 在抑制剂浓度20m m o l /L时失去约90%的活性。类似标准植酸酶, 叶中表达植酸酶在精氨酸修饰的苯甲酰甲醛下完全失活。此外, 叶片表达植酸酶20-m e r 内肽受抗体的抑制, 经X 光推测它存在于真菌植酸酶三维结构的分子表面。生化证据表明, 真菌植酸酶在叶片中克隆和表达, 建立一个稳定而积极的生物催化系统。

G e o r g e 等[28]将来自土壤真菌A s p e r g i l l u s n i g e r 的嵌合植酸酶基因(e x ::p h y A ) 转入N i c o t i a n a t a b a c u m (烟草) 表达。与矢量控制和野生型植物相比, 3个独立转化株胞外植酸酶活性增加, 前两者都没有检测到胞外植酸酶。转基因N . t a b a -c u m 植物种植在无菌琼脂上, 植酸释放的磷为矢量控制植物的3. 7倍。尽管如此, 在2个未经修正的磷缺乏的土壤中, 植物表达嵌合植酸酶基因, 并没有改善磷的释放量。但是当土壤经由磷酸盐和石灰或植酸改良后, 转基因植物比对照组多出52%的积累磷。很多实例显示转基因植物的积极效应与土壤中植酸的含量相对应。植物分泌植酸酶到土壤中, 不一定能确保改善植物中磷元素, 因为土壤中植酸可用性也至关重要。不过如果表达嵌合植酸酶基因植物和土壤改良剂相结合, 有可能提高作物磷营养, 提高农业系统磷肥的效率。L i 等将来自A s p e r g i l l u s f i c u u m 的植酸酶基因(A f -P h y A ) , A r a b i d o p s i s (拟南芥)P k y 10g e n e 启动子和胡萝卜的e x t e n s i n 信号肽三者连接在大豆中表达, 使其具有根特异性和分泌表达性。转基因大豆根部分泌物中植酸酶活性和磷含量分别为4. 7U /mg 和439m m o l /L , 而对照分别为0. 8U /m g 和120m m o l /L。根特异性启动子对重组植酸酶的分泌存在潜在的性能, 为土壤中植酸分解成无机磷为植物利用提供新的前景。

2. 3　真菌植酸酶在动物中的表达　鱼类不利用植酸磷, 从而给水环境带来磷污染。进一步研究, 植酸螯合金属和蛋白, 造成它们的无效利用。而植酸酶可以降解植酸产生无机磷, 从而被鱼类直接利用。H o s t e t l e r 等

[30]

[29]

[27]

将A s p e r g i l l u s n i g e r

植酸酶基因转入日本青鳉, 改善对植酸的吸收利用。生长模型检测到鱼降解植酸的可行性和效率, 同时检测鱼生长和植-P C R

12968　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年

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降趋势, 只有淀粉含量还在增高; 花后第50天, 所测有机物质含量均呈下降趋势。由此可见, 花后第50天物质积累已

经基本完成, 白茄子种子已经具备基本发芽力, 可作为生产上指导采种期。

(4) 白茄子与对照在物质积累及含水量变化趋势方面存在明显差异, 说明同一物种不同品种间种子发育生理成熟时期存在差异。所以在其他茄果类种子生产上应结合自身生理变化特性, 确定种子成熟时期。白茄子与对照品种的种子发育生理变化波动情况及积累水平也均存在明显的差异。

总之, 花后50d 白茄子已经具备发芽力, 可作为生产上的指导采种时期。白茄子各项指标与对照品种差异较显著, 其有机物质积累水平均低于对照。参考文献

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