第一章 免疫细胞化学基本概念及发展简史
一．免疫细胞化学的基本概念
免疫细胞化学（ immunocytochemistry ）是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原（或抗体）的定位和定量的技术。
应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子，特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。
二．免疫细胞化学的发展简史
1941年， Coons 等创立了荧光抗体法
1959年， Singer 创立了铁蛋白法
1966年， Nakane 等创立了免疫酶技术
1971年， Faulk 和Taylor 创立了免疫胶体金法
1976年， Bayer 等提出了亲合组织化学法
第二章 免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术
一． 取材
（一） 组织标本的取材
1. 活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。
2. 取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远
离病变区的正常组织作为对照。
3. 为充分保存组织的抗原性, 取材要快，尽量保持组织新鲜。
（二） 细胞标本的取材
1． 印片法
应用：活检标本、手术切除的标本。
方法：新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落
细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取出自然干燥，低温保存。
优点：简便省时，细胞抗原保存较好。
缺点：细胞分布不均重叠，影响标记效果。
2． 穿刺吸取涂片法
应用：实质器官的病变区。
方法： ①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。
②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks 液（RPMI
1640液）内，轻搅，500rpm 离心5－10分钟，弃上清，
制成细胞悬液（2x106细胞/ml）, 吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。
优点：细胞均匀。
缺点：细胞易变形。
3． 体液沉淀涂片法
①细胞数多，取一滴直接涂片。
②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm 离心10分
钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。
4． 培养细胞
①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。
②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成涂片。
5． 离心涂片机法
细胞悬液2⨯105~6， 1000r/min， 2min ，50~100μl 。 注意事项：
①防止脱片, 涂黏附剂，。
②为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径
0.6-1.0cm 圆圈内，细胞总数以105为宜。
③粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作
免疫组化。
二．固定
（一）免疫组化的固定法
选择最佳固定的标准
最好的保存细胞和组织的形态结构。
最大限度的保存抗原的免疫活性。
固定有：
（1）物理固定：血膜空气快速干燥，冻结干燥。
（2）化学固定：
固定方法
1. 浸润法（ immersion method） 4－24小时。
2. 灌流法 ( irrigation method )
麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注
入固定液，组织在30分钟内取材。
（二）重要的固定液
1． 10％中性缓冲福尔马林
双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特
点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。固定时间不宜过长。
2． 4%多聚甲醛磷酸缓冲液
适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长。
3． Bouin , s 液
对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组
化染色，4 0C 。
4． Zamboni , s 液
可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。采用2.5%多聚甲
醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。6~18小时。
5． 丙酮
用于冰冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透
性很强 ，保存抗原的免疫活性较好，染色效果稍差。4 0C ，5－10分钟，干燥后低温保存。
6． 95％乙醇
用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其
他试剂混合使用，染色较好。
7． AAF 液：
较常用的固定液。（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml, 浓甲醛10ml. ）
（三）固定剂的选择
各种抗原的最佳固定剂的选择见表。鉴于10%中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig 抗原方面较差，若采用合适的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法，如PAP ，ABC 法，仍不失为一可用的固定剂。固定时间可适当缩短至16-24小时。
免疫球蛋白类抗原可选用含汞类的固定液，(如Zenker 固定液) ，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin 固定液，甲醛醋酸酒精固定液等) 。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig 。
肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP 、癌胚抗原CEA) 对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片）
激素类中的多肽类激素宜选用Bouin 。
组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII 凝血因子等) 可用10%中性甲醛。
待测抗原与固定液的关系
（四）注意事项
免疫组化固定方法的原则是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该：
1．
2．
3．
4．
5． 组织新鲜，尽早、尽快固定。 组织块尽量小(
三．包埋和切片法
固定的和未经固定的组织、细胞以及各种涂片和切片方法均可用于免疫组化，但其效果不同。
（一）冰冻切片
优点：是能较好地保持抗原活性(尤其是表面抗原) 和酶。冰冻切片简便快速，省去固定、包埋和切片处理等一系列繁琐步骤。
缺点：是不能用于回顾性研究，不利于常规检查和长期保存标本，不如石蜡切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片机(Cryostat)，以后者最佳，可制成4~6μm 的薄片。组织切片可直接贴附于玻璃载片，或贴附于涂有明胶或histostik(商品粘附剂) 的玻璃片上，以减少组织片脱落。
为防止冷冻过程中冰晶形成，破坏组织结构和保持抗原，取材后立即将标本浸入深低温预冷的(干冰容器内，－70度) 正已烷液内骤冷30-60秒，取出后再冰冻切片。切片最好尽快进行组化染色亦可吹干储存于片盒内，外包塑料袋，置于－20度低温冰箱，一个月内使用。染色前，从冰箱内取出切片，置室温干燥10分钟，再经丙酮固定5-10分(未固定者) ，即可进入染色程序。
（冰冻切片OCT 包埋，置液氮液面上10－20秒，低温保存。）
（二）石蜡切片
一般厚约3-5μm ，切片于37度烘烤过夜，可置4度保存。切片前，固定的组织块需经酒精逐级脱水，二甲苯透明，再浸蜡包埋。各步骤时间均不宜过长(1-2小时) ，以免组织变脆。
（石蜡切片①脱水、透明在4 0C 进行。②浸蜡、包埋时石蜡温度低于60 0C 。）
（三）振动切片
可把新鲜组织（不固定不冷冻，或低浓度固定液稍稍固定）切成
20~100μm 厚，漂浮免疫组化染色，检出阳性部位，后固定，常规电镜样品制备。适于免疫电镜细胞化学观察。
（四）塑料包埋切片
优点是组织块可同时用于光镜切片、半薄切片（0.5~1.5μm ）和电镜超薄切片。目前常用包埋塑料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，染色前不必脱去包埋材料，但切片易皱折。
（五）超薄切片
载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴
载玻片及盖玻片的处理
①载玻片： 清洗液（酸）浸泡12－24小时，水洗，95％酒精浸泡2小时后擦干或烤干。
②盖玻片：清洗液浸泡2小时，或盐酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。
切片的附贴
免疫组化染色过程较长，并需用含表面活性剂的缓冲液多次浸泡切片。有的石蜡切片染色前要用蛋白酶消化。新鲜组织如用灌注法或浸润法固定后再作冰冻切片会失去粘附性。以上这些因素常常造成染色过程中切片的脱落。要防止这一问题的发生，常规的蛋白甘油附贴法已不符合要求。
免疫组化染色中可选用的附贴剂。
(1) 甘油—明胶：
1%明胶 100ml 混匀，涂布载破片上，切片附贴后置多聚甲醛蒸气(80度) 甘油 12ml 中1小时
麝香草酚 数滴
(2) 甲醛—明胶：
1%明胶 5ml 涂布载片上，切片附贴后置37度温箱中1小时或过夜 2%甲醛 5ml
(3) 铬明矾---明胶：
1%明胶与0.1%铬明矾(硫酸铬钾) 等量混合后即可涂片。600C 晾干。
(4) 多聚赖氨酸：Poly-L-Lysine
0.5% 多聚赖氨酸(MW>300，000) 水溶液，涂布载片后，晾干或45 0C 烤干，一周内应用。
此溶液需冷冻贮藏。
（5）APES ：3-Amino propyltriethoxy silane
APES/丙酮（1/50）涂片晾干。
（6）APES 和Poly-L-lysine （PLL ）联合应用
适于特别容易脱片的情况。
第三章 免疫细胞化学染色
免疫细胞化学的类型
根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为以下几种：
(1) 免疫荧光法(Immunofluorescence technique)
(2) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique)
(3) 亲合组织化学法（affinity histochemistry）
(4) 免疫金银法(Immunogold technique)
(5) 其它：放射免疫法。
此外，尚有根据染色及抗体滴加步骤，分类为直接法，间接法，桥法等。
一．免疫细胞化学染色方法及原理
（一） 免疫荧光技术 (Immunofluorescence technique)
1. 免疫荧光直接法
原理：
优点：简单、省时、特异性强。
缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。
2. 免疫荧光间接法
原理：
优点：一种标记抗体可用于多种一抗（只要一抗是同种动物产生的）；敏感性较直接法高10倍左右。
缺点：非特异性着色机会较多；染色时间长。 3. 双重免疫荧光标记法
标本保存及封片介质
①及时照相，可0－50C 暗处保存。 ②缓冲甘油液（PH8.5）
0.5mmol/lPH8.5碳酸盐缓冲液1份，无荧光甘油9份混匀即用。 荧光显微镜标本制作要求
①载玻片光洁均匀，厚度，在0.8-1.2mm 间，无明显自发荧光。有时需石英玻璃载玻片。
②盖玻片光洁，厚度0.17mm 左右。 ③切片不宜太厚。
④暗视野荧光显微镜和油镜观察时，使用无荧光镜油，或上述
甘油及液体石蜡。
（二） 免疫酶标技术(Immunoperoxidase technique)
1. 酶标抗体法
通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观
察。
HRP （POD ） ALP 直接法
优点：简单、省时、特异性强。
缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。
间接法
优点： 与免疫荧光技术相比，此法终产物可在普通光镜
下观察，切片可长久保存，反复观察。
2. 非标记抗体酶法 (1) 酶桥法
优点：提高了敏感性。
(2) 过氧化物酶—抗过氧化物酶法（peroxidase anti- peroxidase method, PAP 法）
1970年，Sternberger
优点：敏感，适合于石蜡切片中微量抗原的检测。 缺点：步骤多，费时，不适合临床常规检验。
（三） 亲合组织化学（affinity histochemistry）
1. 抗生物素(亲合素) —生物素—过氧化物酶复合物技术(Avidin-Biotin.-Peroxidase Complex technique ABC法) 基本原理：
2．
链酶亲合素－生物素－过氧化物酶复合物技术（Strept
Avidin-Biotin -Peroxidase Complex ，SABC ）
基本原理：
链酶亲合素是一种从链酶菌Streptomyces Avidinii 培养
物中提取的蛋白质，有四个生物素结合位点，亲和力高。是一种接近于更完美的生物素结合蛋白。
生物素是一种水溶性维生素（维生素H ）。生物素活化后，
可以标记抗体和酶而不影响其活性。链酶亲合素同一定浓度的生物素化酶混合后，形成链酶亲合素－生物素－酶复合物 。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。这种复合物即是SABC 。
市售的试剂盒中SABC 的A 液和B 液合二为一。 SABC 具有下述特点：
1． 高敏感性。 2． 低背景。 3． 简便快速。 4． 结果稳定。 试剂盒分型
浓缩型SABC －过氧化物酶
即用型SABC －过氧化物酶：SABC 预稀释，可以直接使用。 浓缩型SABC －碱性磷酸酶 (容易克服组织细胞中内源性
酶的干扰，尤其是血
液、骨髓、胃肠等富含过氧
化物酶的组织，应用
SABC －AP 效果较好。)
即用型SABC －碱性磷酸酶
SABC 免疫组化双重染色试剂盒：(同时采用SABC －POD
和SABC －AP 试剂盒进行免疫组化双重染色。)
3．葡萄球菌蛋白A 技术（Staphylococal Protein A, S P A） 4．凝集素（组织化学）技术
凝集素(lectin)：是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动
物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞而得名。种类很多，常用的为植物凝集素，如：
花生凝集素(Peanut agglutinin) PNA D-半乳糖 刀豆素A （Concanavalin ensifomis agglutinin） Con A D-葡萄糖 特点：1）能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化
合物结构（碳水化合物抗原决定簇）
2）具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合， 从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。
一般认为，细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型及
反映细胞在分化、成熟和细胞恶变中的变化。
凝集素本身不是来源或参与免疫反应的产物，放此讲授，
是由于凝集素具有某些亲合特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。
(四) 免疫金银法(Immunogold technique)
二． 免疫组化染色的重要环节
1．选择最佳的固定方法和制片方法
2．免疫组织化学中的对照实验
由于影响免疫组化的因素甚多，染色中必须有阳性和阴性对照。
① 阳性对照片可选用其它组织标本并行固定、包埋、染色，
并且经该抗体证实为中等阳性反应。
② 阴性对照片仍用上述相同程序，证实其免疫反应为阴性。
待检标本上滴加PBS 以及同种非免疫动物血清以代替第一抗体，用以检查抗体的特异性。若仅滴加第一抗体的标本阳性，说明特异性高。
免疫组化对照试验及判断
注：①第一批抗血清做一次对照实验即可。
②必须用连续切片普通染色组进行对照。
3. 选择抗体的最佳稀释度
最佳稀释度可提高染色的阳性率，获得染色的良好的对比。抗体浓度过高。反而会减弱抗原抗体的结合，甚至出现假阴性结果。 抗体稀释的原则是：
① 抗体的工作滴度(稀释后的应用浓度) 高有助于减少污染蛋
白的非特异着色，节省试剂。
② 选择所测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。 ③ 根据抗体和待染标本等具体情况，确定最佳工作滴度。 ④ 稀释液中常用0.01M PBS ，但不宜放过久。欲放置抗体长久，
可用Tris 缓冲液稀释，或专用抗体稀释液。
直接测定法：其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度。
选择抗体的最佳浓度
一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性染色背景强度
1:50 ＋＋＋＋ ＋＋ 1:100 ＋＋＋ ＋ 1:200 ＋＋ － 阴性对照 － － 在1:100与1:200间如上找出最佳稀释度。
棋盘（方阵）测定法：欲测知二种以上抗体的免疫反应浓度，可测试比较9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应采用1:20的第二抗体，并进一步在1:50-1:100之间寻得第一抗体的最佳工作稀释度。
抗体的最佳滴度测试表
若应用三种以上抗体的染色法，如PAP 法，ABC 法，可按上表求得第二、第三抗体的最佳配伍滴度。之后可按商品说明选择第一抗体滴度，或按优选法求得高稀释度，逐步缩小优选范围，选中最佳滴度。
稀释中，一般常微量加样品。最常用者为10μl 、20μl 、50μl 、100μl 、和200μl 。抗体稀释后应充分混匀。
4．抗体的孵育时间
一般说，抗体稀释度愈高则孵育时间愈长，标本染色对比度愈大。使用高滴度抗体，可将切片置于4度冰箱内过夜(约18小时) ，以增强特异性着色而减少非特异染色，提高对比。为节省时间，加强反应亦可于室温下孵育20分钟，37度下孵育5-10分钟。若标本中抗原很强，可适当延长孵育时间。孵育应在湿盒中进行。
5．其它
注意滴加抗体时应适量。以抗体充分覆盖组织片为准，不可过多或过少。PBS 洗涤抗体时应充分，且应防止使用同一PBS 容器导致交叉反应。最终标本显色时，应用光镜控制和观察最佳显色反应和时间。一般显色时间约为5—15分钟。以阳性反应着色最强而背景开始着色为度。
免疫细胞化学染色的注意事项
① 反应的pH 值应以接近体液环境为宜，即组织片与各种标记抗体液应处于同 一酸碱度（pH7.0-7.2）
② 为避免非特异沉着和交叉反应，各标记抗体液要在染色前经离心去沉淀
③ 要特别注意载玻片是否处于水平位置（滴染时），确保染色液覆盖整个切面。
④ 染色反应要在保湿容器内进行，以防止染色液的蒸发干涸。
⑤ 染色的抗原抗体反应要在37度或室温下进行。但对耐热能力差的抗原，要 在4度低温下延长反应的时间。
四． 免疫组化有关技术
（一） 抗体的保存
抗体的保存40C 保存一年。稀释后40C 保存1－3天、7天后效价显著降低。
（二）增强特异性染色的方法
1． 蛋白酶消化法
①0.1％胰蛋白酶
最常用。用前370C 水浴。消化5－30分钟。
②0．4％胃蛋白酶
370C 消化5－30分钟。
2． 抗原修复
高温高压组织抗原修复
①适用范围：大量常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复，效果优于微波法和直接煮沸法。
②仪器设备：普通家用压力锅。
③缓冲液：0.01M 柠檬酸缓冲液，PH6.0。
④方法：切片水化。缓冲液置于压力锅内加热至沸腾，放入切片，继续加热至喷汽（扣阀至喷汽以4－6分钟为最佳）、1－2分钟后，压力锅离开热源、1分钟后，自来水淋压力锅至室温，开盖，取出切片，蒸馏水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
⑤注意事项：用过的缓冲液弃去。加热时间不宜太长，否则背景加深。
组织抗原微波修复
①适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。 ②仪器设备：家用微波炉，进口微波炉置“DEFROST ”档。 ③方法：去除内源性酶的切片置入盛有已煮沸缓冲液的耐热容器中，继续加热至98－1000C ，持续8－10分钟。取出容器至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
④注意事项：不可将切片从缓冲液中取出冷却。
组织抗原直接煮沸修复
①适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。 ②方法：切片水化。置入盛有已煮沸缓冲液的烧杯中继续加热10分钟。加入蒸馏水补充水分损失。烧杯离开热源，置流水槽内冷却至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
注：
一般，对于不太熟悉的一抗染色石蜡切片时，应比较一下抗原修复、胰酶消化和不做预处理的染色效果。如果石蜡切片无法作出满意的结果，则应考虑用冰冻切片。
3． 合适的抗体稀释度
抗体效价越高，工作液稀释度越高。抗体稀释度越大，孵
育时间越长。
只有高稀释度时才能防止非特异性背景产生。
尽量使用单克隆抗体（MAB ）。
4． 孵育时间
370C ，30－60分钟。40C 过夜（约18小时）或室温。
5． 去污剂
0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%Triton X-100处理切片，去除脂类，促进抗体进入细胞中。但是浓度过高会破坏细胞抗原和细胞膜结构。
6． 显色增敏剂
过氧化物酶底物中加入氯化镍、0.1N 异吡唑、氯化铵、硫酸镍铵等可增强显色敏感度。
（三）非特异染色和内源性过氧化物酶的消除法
在免疫细胞化学染色中，常在非抗原部位出现阳性反应（非抗原抗体反应出现的阳性反应），称为非特异性染色，致背景着色过深。
非特异性染色，背景色过深其可能原因有：
1．粘片剂使用不当。
2．固定(如可因液中残存的游离醛基所引起)
3．切片或涂片太厚。
4．脱蜡不彻底。
5．未用酶消化处理切片或进行抗原修复。
6．内源性酶未阻断。
7．标记抗体、I 抗的不纯；抗体浓度过高，抗体的稀释度不够，反应后冲洗不充
分。
8．血清封闭不够或血清溶血。
9．洗涤不彻底。
10．底物呈色时间过久。
11．细胞或组织与血清或酶之间由于静电吸引所致的吸附作用造成。
去除非特异染色的方法：
1． 血清封闭
加一抗前，用与二抗同种动物非免疫血清封闭组织上带电荷基团，去除其与一抗的非特异性结合。必要时加入2－5％牛血清白蛋白。也可用除制备一抗以外其他动物非免疫血清。室温或37度，30分钟。
2． 缓冲液
洗涤用缓冲液加入0.9%NaCL成为高盐溶液，充分洗涤切片。
3． 尽可能高地稀释一抗。
在组织中的红细胞、粒细胞含有较多的内源性过氧化物酶，
其它细胞和组织中也有少量。为此，实验中设法消除或抑制内源性过氧化物酶。
去除内源性过氧化物酶的常用方法：
3％H 2O 2蒸馏水或PBS ，或3％H 2O 2甲醇， 室温30min 处理切片。
去除内源性生物素的常用方法：
生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC 法，LSAB 法，SP 法SABC 法染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如冰冻切片和肝、肾、脑等组织的石蜡切片，在应用上述染色方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min 左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS 洗5min ，更换3次。
内源性生物素封闭试剂： Avidin Biotin Blocking Reagent (ABB) (市售)
（四）显色时间的控制
①着色太深可减少反应时间。
②过氧化物酶显色时，H 2O 2浓度较大使显色反应过快而致背景加深，过量H 2O 2又抑制酶的活性，故H 2O 2浓度要适中。
五。免疫细胞化学染色结果判定
阳性细胞
①阳性细胞染色分布类型：
胞浆
细胞核
细胞膜
②阳性细胞分布呈现灶性/弥漫性。
③阳性细胞染色强度不一。若细胞间染色强度相同，常常提示为非特异性反应。
④阳性反应定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布。而非特异性反应常常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
⑤切片边缘、刀痕、皱折处或坏死挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常常表现为相同的阳性染色强度，但不能用于判断阳性。 染色失败的原因
假阴性
①固定方法不对，抗原在石蜡切片中遭到破坏，尤其是不规范的石蜡标本。
②未加一抗，或一抗与试剂盒中二抗不配对，或抗体失效，或抗体的浓度过低。
③抗体孵育时间太短。
④染色过程中切片干燥，或未严格按照步骤操作如抗原修复和消化等预处理不当。
⑤酶底物中H 2O 2量少或失效。
⑥复染或脱水剂使用不当。
假阳性
①粘片剂太厚。
②部分多克隆抗体特异性差。
③抗体浓度太高。或抗体孵育时间太长。
④PBS 中未加NaCl ，PH 值不准，洗涤不彻底。
⑤切片在染色过程中干燥。
⑥使用已经变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长，或H 2O 2浓度过高，呈色速度过快。
第四章 免疫细胞化学染色的应用
1． 免疫细胞化学在FCM （Flow Cytometry）中的应用 关键是对细胞进行免疫荧光染色。
方法： 直接染色法
间接染色法
检测对象：细胞膜、细胞质、细胞核
荧光染料：FITC (异硫氰酸荧光素， 需激发光波长488nm ，黄绿色)
PE （藻红蛋白，需激发光波长575 nm ，
红色）
2． 肿瘤免疫细胞化学
判断肿瘤的组织来源
判断肿瘤的恶性程度
判断肿瘤的治疗效果及预后
3． 免疫细胞化学在神经科学中的应用
确定神经递质的性质、定位和分布
追踪神经束的行经
区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞 神经递质共存的研究
4． 消化器官免疫细胞化学
消化管： IEL; 各种抗体形成细胞。
消化腺: 肝炎（肝细胞内病毒抗原的定位及分布） 肝硬化（FN ）
肝癌
5． 肾脏疾病的免疫细胞化学
荧光或酶标抗体检测免疫复合物的分布、形式。发病机制的探讨。
6． 自身抗体的免疫细胞化学检测
抗核抗体---------------SLE
类风湿因子-----------类风湿关节炎
7． 免疫细胞化学在皮肤病学中的应用
抗表皮细胞膜多糖（桥粒）抗体---- 天疱疮
附件：
1．10％中性缓冲福尔马林
甲醛 10毫升
0.01mol/L PH7.4PBS 90ml
2．4%多聚甲醛磷酸缓冲液
多聚甲醛 40克
0.1mmol/LPH7.4PBS 1000ml
3．Bouin , s 液
饱和苦味酸 750ml
4％甲醛 250ml
冰醋酸 50ml （最好用前加）
4．Zamboni , s 液
多聚甲醛 40g
饱和苦味酸 150ml
60 0C 溶解，过滤，冷却
Karasson-Schwit,s PB至1000ml
Karasson-Schwit , s PB:
NaH2PO4.H 2O 3.31g
Na 2HPO4.7H 2O 33.77g
双蒸水 1000ml
5．铬明矾明胶
明胶 5g
蒸水 800ml,70 0C溶解
加铬矾 0.5g
6．甲醛明胶
明胶0.5g
40％甲醛2.5ml
蒸水100ml
7．专用抗体稀释液。
0．5MPH7.4TBS100ml,600C , 优质明胶100g ，溶解，冷却，加入1g 牛血清白蛋白、200mgNaN 3，溶解，过滤，40C 保存。 8．0.1％胰蛋白酶
胰蛋白酶 0.1mg, 1%CaCL2(PH7.8,0.1MNaCL调节)100ml 。 9．0．4％胃蛋白酶
胃蛋白酶 0.4mg 0.1MHCL100ml
第一章 免疫细胞化学基本概念及发展简史
一．免疫细胞化学的基本概念
免疫细胞化学（ immunocytochemistry ）是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原（或抗体）的定位和定量的技术。
应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子，特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。
二．免疫细胞化学的发展简史
1941年， Coons 等创立了荧光抗体法
1959年， Singer 创立了铁蛋白法
1966年， Nakane 等创立了免疫酶技术
1971年， Faulk 和Taylor 创立了免疫胶体金法
1976年， Bayer 等提出了亲合组织化学法
第二章 免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术
一． 取材
（一） 组织标本的取材
1. 活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。
2. 取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远
离病变区的正常组织作为对照。
3. 为充分保存组织的抗原性, 取材要快，尽量保持组织新鲜。
（二） 细胞标本的取材
1． 印片法
应用：活检标本、手术切除的标本。
方法：新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落
细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取出自然干燥，低温保存。
优点：简便省时，细胞抗原保存较好。
缺点：细胞分布不均重叠，影响标记效果。
2． 穿刺吸取涂片法
应用：实质器官的病变区。
方法： ①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。
②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks 液（RPMI
1640液）内，轻搅，500rpm 离心5－10分钟，弃上清，
制成细胞悬液（2x106细胞/ml）, 吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。
优点：细胞均匀。
缺点：细胞易变形。
3． 体液沉淀涂片法
①细胞数多，取一滴直接涂片。
②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm 离心10分
钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。
4． 培养细胞
①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。
②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成涂片。
5． 离心涂片机法
细胞悬液2⨯105~6， 1000r/min， 2min ，50~100μl 。 注意事项：
①防止脱片, 涂黏附剂，。
②为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径
0.6-1.0cm 圆圈内，细胞总数以105为宜。
③粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作
免疫组化。
二．固定
（一）免疫组化的固定法
选择最佳固定的标准
最好的保存细胞和组织的形态结构。
最大限度的保存抗原的免疫活性。
固定有：
（1）物理固定：血膜空气快速干燥，冻结干燥。
（2）化学固定：
固定方法
1. 浸润法（ immersion method） 4－24小时。
2. 灌流法 ( irrigation method )
麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注
入固定液，组织在30分钟内取材。
（二）重要的固定液
1． 10％中性缓冲福尔马林
双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特
点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。固定时间不宜过长。
2． 4%多聚甲醛磷酸缓冲液
适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长。
3． Bouin , s 液
对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组
化染色，4 0C 。
4． Zamboni , s 液
可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。采用2.5%多聚甲
醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。6~18小时。
5． 丙酮
用于冰冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透
性很强 ，保存抗原的免疫活性较好，染色效果稍差。4 0C ，5－10分钟，干燥后低温保存。
6． 95％乙醇
用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其
他试剂混合使用，染色较好。
7． AAF 液：
较常用的固定液。（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml, 浓甲醛10ml. ）
（三）固定剂的选择
各种抗原的最佳固定剂的选择见表。鉴于10%中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig 抗原方面较差，若采用合适的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法，如PAP ，ABC 法，仍不失为一可用的固定剂。固定时间可适当缩短至16-24小时。
免疫球蛋白类抗原可选用含汞类的固定液，(如Zenker 固定液) ，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin 固定液，甲醛醋酸酒精固定液等) 。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig 。
肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP 、癌胚抗原CEA) 对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片）
激素类中的多肽类激素宜选用Bouin 。
组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII 凝血因子等) 可用10%中性甲醛。
待测抗原与固定液的关系
（四）注意事项
免疫组化固定方法的原则是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该：
1．
2．
3．
4．
5． 组织新鲜，尽早、尽快固定。 组织块尽量小(
三．包埋和切片法
固定的和未经固定的组织、细胞以及各种涂片和切片方法均可用于免疫组化，但其效果不同。
（一）冰冻切片
优点：是能较好地保持抗原活性(尤其是表面抗原) 和酶。冰冻切片简便快速，省去固定、包埋和切片处理等一系列繁琐步骤。
缺点：是不能用于回顾性研究，不利于常规检查和长期保存标本，不如石蜡切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片机(Cryostat)，以后者最佳，可制成4~6μm 的薄片。组织切片可直接贴附于玻璃载片，或贴附于涂有明胶或histostik(商品粘附剂) 的玻璃片上，以减少组织片脱落。
为防止冷冻过程中冰晶形成，破坏组织结构和保持抗原，取材后立即将标本浸入深低温预冷的(干冰容器内，－70度) 正已烷液内骤冷30-60秒，取出后再冰冻切片。切片最好尽快进行组化染色亦可吹干储存于片盒内，外包塑料袋，置于－20度低温冰箱，一个月内使用。染色前，从冰箱内取出切片，置室温干燥10分钟，再经丙酮固定5-10分(未固定者) ，即可进入染色程序。
（冰冻切片OCT 包埋，置液氮液面上10－20秒，低温保存。）
（二）石蜡切片
一般厚约3-5μm ，切片于37度烘烤过夜，可置4度保存。切片前，固定的组织块需经酒精逐级脱水，二甲苯透明，再浸蜡包埋。各步骤时间均不宜过长(1-2小时) ，以免组织变脆。
（石蜡切片①脱水、透明在4 0C 进行。②浸蜡、包埋时石蜡温度低于60 0C 。）
（三）振动切片
可把新鲜组织（不固定不冷冻，或低浓度固定液稍稍固定）切成
20~100μm 厚，漂浮免疫组化染色，检出阳性部位，后固定，常规电镜样品制备。适于免疫电镜细胞化学观察。
（四）塑料包埋切片
优点是组织块可同时用于光镜切片、半薄切片（0.5~1.5μm ）和电镜超薄切片。目前常用包埋塑料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，染色前不必脱去包埋材料，但切片易皱折。
（五）超薄切片
载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴
载玻片及盖玻片的处理
①载玻片： 清洗液（酸）浸泡12－24小时，水洗，95％酒精浸泡2小时后擦干或烤干。
②盖玻片：清洗液浸泡2小时，或盐酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。
切片的附贴
免疫组化染色过程较长，并需用含表面活性剂的缓冲液多次浸泡切片。有的石蜡切片染色前要用蛋白酶消化。新鲜组织如用灌注法或浸润法固定后再作冰冻切片会失去粘附性。以上这些因素常常造成染色过程中切片的脱落。要防止这一问题的发生，常规的蛋白甘油附贴法已不符合要求。
免疫组化染色中可选用的附贴剂。
(1) 甘油—明胶：
1%明胶 100ml 混匀，涂布载破片上，切片附贴后置多聚甲醛蒸气(80度) 甘油 12ml 中1小时
麝香草酚 数滴
(2) 甲醛—明胶：
1%明胶 5ml 涂布载片上，切片附贴后置37度温箱中1小时或过夜 2%甲醛 5ml
(3) 铬明矾---明胶：
1%明胶与0.1%铬明矾(硫酸铬钾) 等量混合后即可涂片。600C 晾干。
(4) 多聚赖氨酸：Poly-L-Lysine
0.5% 多聚赖氨酸(MW>300，000) 水溶液，涂布载片后，晾干或45 0C 烤干，一周内应用。
此溶液需冷冻贮藏。
（5）APES ：3-Amino propyltriethoxy silane
APES/丙酮（1/50）涂片晾干。
（6）APES 和Poly-L-lysine （PLL ）联合应用
适于特别容易脱片的情况。
第三章 免疫细胞化学染色
免疫细胞化学的类型
根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为以下几种：
(1) 免疫荧光法(Immunofluorescence technique)
(2) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique)
(3) 亲合组织化学法（affinity histochemistry）
(4) 免疫金银法(Immunogold technique)
(5) 其它：放射免疫法。
此外，尚有根据染色及抗体滴加步骤，分类为直接法，间接法，桥法等。
一．免疫细胞化学染色方法及原理
（一） 免疫荧光技术 (Immunofluorescence technique)
1. 免疫荧光直接法
原理：
优点：简单、省时、特异性强。
缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。
2. 免疫荧光间接法
原理：
优点：一种标记抗体可用于多种一抗（只要一抗是同种动物产生的）；敏感性较直接法高10倍左右。
缺点：非特异性着色机会较多；染色时间长。 3. 双重免疫荧光标记法
标本保存及封片介质
①及时照相，可0－50C 暗处保存。 ②缓冲甘油液（PH8.5）
0.5mmol/lPH8.5碳酸盐缓冲液1份，无荧光甘油9份混匀即用。 荧光显微镜标本制作要求
①载玻片光洁均匀，厚度，在0.8-1.2mm 间，无明显自发荧光。有时需石英玻璃载玻片。
②盖玻片光洁，厚度0.17mm 左右。 ③切片不宜太厚。
④暗视野荧光显微镜和油镜观察时，使用无荧光镜油，或上述
甘油及液体石蜡。
（二） 免疫酶标技术(Immunoperoxidase technique)
1. 酶标抗体法
通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观
察。
HRP （POD ） ALP 直接法
优点：简单、省时、特异性强。
缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。
间接法
优点： 与免疫荧光技术相比，此法终产物可在普通光镜
下观察，切片可长久保存，反复观察。
2. 非标记抗体酶法 (1) 酶桥法
优点：提高了敏感性。
(2) 过氧化物酶—抗过氧化物酶法（peroxidase anti- peroxidase method, PAP 法）
1970年，Sternberger
优点：敏感，适合于石蜡切片中微量抗原的检测。 缺点：步骤多，费时，不适合临床常规检验。
（三） 亲合组织化学（affinity histochemistry）
1. 抗生物素(亲合素) —生物素—过氧化物酶复合物技术(Avidin-Biotin.-Peroxidase Complex technique ABC法) 基本原理：
2．
链酶亲合素－生物素－过氧化物酶复合物技术（Strept
Avidin-Biotin -Peroxidase Complex ，SABC ）
基本原理：
链酶亲合素是一种从链酶菌Streptomyces Avidinii 培养
物中提取的蛋白质，有四个生物素结合位点，亲和力高。是一种接近于更完美的生物素结合蛋白。
生物素是一种水溶性维生素（维生素H ）。生物素活化后，
可以标记抗体和酶而不影响其活性。链酶亲合素同一定浓度的生物素化酶混合后，形成链酶亲合素－生物素－酶复合物 。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。这种复合物即是SABC 。
市售的试剂盒中SABC 的A 液和B 液合二为一。 SABC 具有下述特点：
1． 高敏感性。 2． 低背景。 3． 简便快速。 4． 结果稳定。 试剂盒分型
浓缩型SABC －过氧化物酶
即用型SABC －过氧化物酶：SABC 预稀释，可以直接使用。 浓缩型SABC －碱性磷酸酶 (容易克服组织细胞中内源性
酶的干扰，尤其是血
液、骨髓、胃肠等富含过氧
化物酶的组织，应用
SABC －AP 效果较好。)
即用型SABC －碱性磷酸酶
SABC 免疫组化双重染色试剂盒：(同时采用SABC －POD
和SABC －AP 试剂盒进行免疫组化双重染色。)
3．葡萄球菌蛋白A 技术（Staphylococal Protein A, S P A） 4．凝集素（组织化学）技术
凝集素(lectin)：是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动
物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞而得名。种类很多，常用的为植物凝集素，如：
花生凝集素(Peanut agglutinin) PNA D-半乳糖 刀豆素A （Concanavalin ensifomis agglutinin） Con A D-葡萄糖 特点：1）能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化
合物结构（碳水化合物抗原决定簇）
2）具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合， 从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。
一般认为，细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型及
反映细胞在分化、成熟和细胞恶变中的变化。
凝集素本身不是来源或参与免疫反应的产物，放此讲授，
是由于凝集素具有某些亲合特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。
(四) 免疫金银法(Immunogold technique)
二． 免疫组化染色的重要环节
1．选择最佳的固定方法和制片方法
2．免疫组织化学中的对照实验
由于影响免疫组化的因素甚多，染色中必须有阳性和阴性对照。
① 阳性对照片可选用其它组织标本并行固定、包埋、染色，
并且经该抗体证实为中等阳性反应。
② 阴性对照片仍用上述相同程序，证实其免疫反应为阴性。
待检标本上滴加PBS 以及同种非免疫动物血清以代替第一抗体，用以检查抗体的特异性。若仅滴加第一抗体的标本阳性，说明特异性高。
免疫组化对照试验及判断
注：①第一批抗血清做一次对照实验即可。
②必须用连续切片普通染色组进行对照。
3. 选择抗体的最佳稀释度
最佳稀释度可提高染色的阳性率，获得染色的良好的对比。抗体浓度过高。反而会减弱抗原抗体的结合，甚至出现假阴性结果。 抗体稀释的原则是：
① 抗体的工作滴度(稀释后的应用浓度) 高有助于减少污染蛋
白的非特异着色，节省试剂。
② 选择所测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。 ③ 根据抗体和待染标本等具体情况，确定最佳工作滴度。 ④ 稀释液中常用0.01M PBS ，但不宜放过久。欲放置抗体长久，
可用Tris 缓冲液稀释，或专用抗体稀释液。
直接测定法：其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度。
选择抗体的最佳浓度
一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性染色背景强度
1:50 ＋＋＋＋ ＋＋ 1:100 ＋＋＋ ＋ 1:200 ＋＋ － 阴性对照 － － 在1:100与1:200间如上找出最佳稀释度。
棋盘（方阵）测定法：欲测知二种以上抗体的免疫反应浓度，可测试比较9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应采用1:20的第二抗体，并进一步在1:50-1:100之间寻得第一抗体的最佳工作稀释度。
抗体的最佳滴度测试表
若应用三种以上抗体的染色法，如PAP 法，ABC 法，可按上表求得第二、第三抗体的最佳配伍滴度。之后可按商品说明选择第一抗体滴度，或按优选法求得高稀释度，逐步缩小优选范围，选中最佳滴度。
稀释中，一般常微量加样品。最常用者为10μl 、20μl 、50μl 、100μl 、和200μl 。抗体稀释后应充分混匀。
4．抗体的孵育时间
一般说，抗体稀释度愈高则孵育时间愈长，标本染色对比度愈大。使用高滴度抗体，可将切片置于4度冰箱内过夜(约18小时) ，以增强特异性着色而减少非特异染色，提高对比。为节省时间，加强反应亦可于室温下孵育20分钟，37度下孵育5-10分钟。若标本中抗原很强，可适当延长孵育时间。孵育应在湿盒中进行。
5．其它
注意滴加抗体时应适量。以抗体充分覆盖组织片为准，不可过多或过少。PBS 洗涤抗体时应充分，且应防止使用同一PBS 容器导致交叉反应。最终标本显色时，应用光镜控制和观察最佳显色反应和时间。一般显色时间约为5—15分钟。以阳性反应着色最强而背景开始着色为度。
免疫细胞化学染色的注意事项
① 反应的pH 值应以接近体液环境为宜，即组织片与各种标记抗体液应处于同 一酸碱度（pH7.0-7.2）
② 为避免非特异沉着和交叉反应，各标记抗体液要在染色前经离心去沉淀
③ 要特别注意载玻片是否处于水平位置（滴染时），确保染色液覆盖整个切面。
④ 染色反应要在保湿容器内进行，以防止染色液的蒸发干涸。
⑤ 染色的抗原抗体反应要在37度或室温下进行。但对耐热能力差的抗原，要 在4度低温下延长反应的时间。
四． 免疫组化有关技术
（一） 抗体的保存
抗体的保存40C 保存一年。稀释后40C 保存1－3天、7天后效价显著降低。
（二）增强特异性染色的方法
1． 蛋白酶消化法
①0.1％胰蛋白酶
最常用。用前370C 水浴。消化5－30分钟。
②0．4％胃蛋白酶
370C 消化5－30分钟。
2． 抗原修复
高温高压组织抗原修复
①适用范围：大量常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复，效果优于微波法和直接煮沸法。
②仪器设备：普通家用压力锅。
③缓冲液：0.01M 柠檬酸缓冲液，PH6.0。
④方法：切片水化。缓冲液置于压力锅内加热至沸腾，放入切片，继续加热至喷汽（扣阀至喷汽以4－6分钟为最佳）、1－2分钟后，压力锅离开热源、1分钟后，自来水淋压力锅至室温，开盖，取出切片，蒸馏水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
⑤注意事项：用过的缓冲液弃去。加热时间不宜太长，否则背景加深。
组织抗原微波修复
①适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。 ②仪器设备：家用微波炉，进口微波炉置“DEFROST ”档。 ③方法：去除内源性酶的切片置入盛有已煮沸缓冲液的耐热容器中，继续加热至98－1000C ，持续8－10分钟。取出容器至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
④注意事项：不可将切片从缓冲液中取出冷却。
组织抗原直接煮沸修复
①适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。 ②方法：切片水化。置入盛有已煮沸缓冲液的烧杯中继续加热10分钟。加入蒸馏水补充水分损失。烧杯离开热源，置流水槽内冷却至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS 冲洗3分钟x2次。
注：
一般，对于不太熟悉的一抗染色石蜡切片时，应比较一下抗原修复、胰酶消化和不做预处理的染色效果。如果石蜡切片无法作出满意的结果，则应考虑用冰冻切片。
3． 合适的抗体稀释度
抗体效价越高，工作液稀释度越高。抗体稀释度越大，孵
育时间越长。
只有高稀释度时才能防止非特异性背景产生。
尽量使用单克隆抗体（MAB ）。
4． 孵育时间
370C ，30－60分钟。40C 过夜（约18小时）或室温。
5． 去污剂
0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%Triton X-100处理切片，去除脂类，促进抗体进入细胞中。但是浓度过高会破坏细胞抗原和细胞膜结构。
6． 显色增敏剂
过氧化物酶底物中加入氯化镍、0.1N 异吡唑、氯化铵、硫酸镍铵等可增强显色敏感度。
（三）非特异染色和内源性过氧化物酶的消除法
在免疫细胞化学染色中，常在非抗原部位出现阳性反应（非抗原抗体反应出现的阳性反应），称为非特异性染色，致背景着色过深。
非特异性染色，背景色过深其可能原因有：
1．粘片剂使用不当。
2．固定(如可因液中残存的游离醛基所引起)
3．切片或涂片太厚。
4．脱蜡不彻底。
5．未用酶消化处理切片或进行抗原修复。
6．内源性酶未阻断。
7．标记抗体、I 抗的不纯；抗体浓度过高，抗体的稀释度不够，反应后冲洗不充
分。
8．血清封闭不够或血清溶血。
9．洗涤不彻底。
10．底物呈色时间过久。
11．细胞或组织与血清或酶之间由于静电吸引所致的吸附作用造成。
去除非特异染色的方法：
1． 血清封闭
加一抗前，用与二抗同种动物非免疫血清封闭组织上带电荷基团，去除其与一抗的非特异性结合。必要时加入2－5％牛血清白蛋白。也可用除制备一抗以外其他动物非免疫血清。室温或37度，30分钟。
2． 缓冲液
洗涤用缓冲液加入0.9%NaCL成为高盐溶液，充分洗涤切片。
3． 尽可能高地稀释一抗。
在组织中的红细胞、粒细胞含有较多的内源性过氧化物酶，
其它细胞和组织中也有少量。为此，实验中设法消除或抑制内源性过氧化物酶。
去除内源性过氧化物酶的常用方法：
3％H 2O 2蒸馏水或PBS ，或3％H 2O 2甲醇， 室温30min 处理切片。
去除内源性生物素的常用方法：
生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC 法，LSAB 法，SP 法SABC 法染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如冰冻切片和肝、肾、脑等组织的石蜡切片，在应用上述染色方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min 左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS 洗5min ，更换3次。
内源性生物素封闭试剂： Avidin Biotin Blocking Reagent (ABB) (市售)
（四）显色时间的控制
①着色太深可减少反应时间。
②过氧化物酶显色时，H 2O 2浓度较大使显色反应过快而致背景加深，过量H 2O 2又抑制酶的活性，故H 2O 2浓度要适中。
五。免疫细胞化学染色结果判定
阳性细胞
①阳性细胞染色分布类型：
胞浆
细胞核
细胞膜
②阳性细胞分布呈现灶性/弥漫性。
③阳性细胞染色强度不一。若细胞间染色强度相同，常常提示为非特异性反应。
④阳性反应定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布。而非特异性反应常常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
⑤切片边缘、刀痕、皱折处或坏死挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常常表现为相同的阳性染色强度，但不能用于判断阳性。 染色失败的原因
假阴性
①固定方法不对，抗原在石蜡切片中遭到破坏，尤其是不规范的石蜡标本。
②未加一抗，或一抗与试剂盒中二抗不配对，或抗体失效，或抗体的浓度过低。
③抗体孵育时间太短。
④染色过程中切片干燥，或未严格按照步骤操作如抗原修复和消化等预处理不当。
⑤酶底物中H 2O 2量少或失效。
⑥复染或脱水剂使用不当。
假阳性
①粘片剂太厚。
②部分多克隆抗体特异性差。
③抗体浓度太高。或抗体孵育时间太长。
④PBS 中未加NaCl ，PH 值不准，洗涤不彻底。
⑤切片在染色过程中干燥。
⑥使用已经变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长，或H 2O 2浓度过高，呈色速度过快。
第四章 免疫细胞化学染色的应用
1． 免疫细胞化学在FCM （Flow Cytometry）中的应用 关键是对细胞进行免疫荧光染色。
方法： 直接染色法
间接染色法
检测对象：细胞膜、细胞质、细胞核
荧光染料：FITC (异硫氰酸荧光素， 需激发光波长488nm ，黄绿色)
PE （藻红蛋白，需激发光波长575 nm ，
红色）
2． 肿瘤免疫细胞化学
判断肿瘤的组织来源
判断肿瘤的恶性程度
判断肿瘤的治疗效果及预后
3． 免疫细胞化学在神经科学中的应用
确定神经递质的性质、定位和分布
追踪神经束的行经
区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞 神经递质共存的研究
4． 消化器官免疫细胞化学
消化管： IEL; 各种抗体形成细胞。
消化腺: 肝炎（肝细胞内病毒抗原的定位及分布） 肝硬化（FN ）
肝癌
5． 肾脏疾病的免疫细胞化学
荧光或酶标抗体检测免疫复合物的分布、形式。发病机制的探讨。
6． 自身抗体的免疫细胞化学检测
抗核抗体---------------SLE
类风湿因子-----------类风湿关节炎
7． 免疫细胞化学在皮肤病学中的应用
抗表皮细胞膜多糖（桥粒）抗体---- 天疱疮
附件：
1．10％中性缓冲福尔马林
甲醛 10毫升
0.01mol/L PH7.4PBS 90ml
2．4%多聚甲醛磷酸缓冲液
多聚甲醛 40克
0.1mmol/LPH7.4PBS 1000ml
3．Bouin , s 液
饱和苦味酸 750ml
4％甲醛 250ml
冰醋酸 50ml （最好用前加）
4．Zamboni , s 液
多聚甲醛 40g
饱和苦味酸 150ml
60 0C 溶解，过滤，冷却
Karasson-Schwit,s PB至1000ml
Karasson-Schwit , s PB:
NaH2PO4.H 2O 3.31g
Na 2HPO4.7H 2O 33.77g
双蒸水 1000ml
5．铬明矾明胶
明胶 5g
蒸水 800ml,70 0C溶解
加铬矾 0.5g
6．甲醛明胶
明胶0.5g
40％甲醛2.5ml
蒸水100ml
7．专用抗体稀释液。
0．5MPH7.4TBS100ml,600C , 优质明胶100g ，溶解，冷却，加入1g 牛血清白蛋白、200mgNaN 3，溶解，过滤，40C 保存。 8．0.1％胰蛋白酶
胰蛋白酶 0.1mg, 1%CaCL2(PH7.8,0.1MNaCL调节)100ml 。 9．0．4％胃蛋白酶
胃蛋白酶 0.4mg 0.1MHCL100ml