急性甲醛吸入对小鼠肝细胞DNA损伤作用

中国公共卫生２００６年６月第２２卷第６期ＣｈｉｎＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＪｕｎ

２００６Ｖ０１．２２Ｎｏ．６７０９

文章编号：１００１．０５８０（２００６）０６—０７０９．０２中图分类号：Ｒ

１２２，１

文献标识码：Ａ

【实验研究】

亚急性甲醛吸人对小鼠肝细胞ＤＮＡ损伤作用＊

王丽，乔琰，鲁志松，丁书茂，严彦，杨旭

摘要：目的检测亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞的损伤作用。并探讨用归一化处理方法解决单细胞凝胶电泳重复性差的可行性。方法将小鼠分别暴露于不同浓度的气态甲醛（０．５，１．０和３．０ｍｇ／ｍ３）中染毒１４ｄ，每天６ｈ，用单细胞凝胶电泳技术检测肝细胞ＤＮＡ的损伤程度。结果０．５和１．０ｍｇ／ｍ３的甲醛可造成ＤＮＡ的严重断裂（Ｐ＜０．００１），而３．０ｍｇ／ｍ３的甲醛则引起显著的交联作用，归一化的结果与之相符，并表明不同浓度的甲醛导致不同程度和类型的ＤＮＡ损伤。结论甲醛可造成机体内肝细胞ＤＮＡ的断裂和交联，该损伤可能是甲醛致癌机制之一；归一化可以弥补单细胞凝胶电泳实验重复性不佳的缺陷。

关键词：气态甲醛；肝细胞ＤＮＡ损伤；单细胞凝胶电泳；归一化

Ｄａｍａｇｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｂａｃｕｔｅｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ

ｏｎ

ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃＤＮＡｉｎ

ｍｉｃｅ

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ｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｅｎｔｒａｌＣ＾ｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗｕｈａｎ４３００７９，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

ｔｉｏｎｏｆ

ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＤＮＡｄａｍａｇｅａｆｔｅｒｓｕｂａｃｕｔｅｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅｅｘｐｏｓｕｒｅａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａ—ｓｔａｔｉｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ

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ＤＮＡ

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ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ

甲醛（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ＦＡ）已被列入确定的人类致癌物（１］。

由于甲醛致癌的原因还不甚清楚，故本文依据我国新颁布的职业卫生标准（２】，模拟甲醛在生产和生活中的实际暴露方式，建立亚急性染毒模型，检测气态甲醛对小鼠肝细胞的损伤作用。同时，单细胞凝胶电泳技术（ＳＣＧＥ）虽然应用广泛（３９，但是该技术受诸多因素影响，实验结果往往不能得到很好的重复。故本文引入归一化的数学处理方法，对单细胞凝胶电泳实验中可重复性差的问题加以探讨。以期使该技术得到更为广泛的应用和发展。１材料与方法

１．１仪器与试剂ＷＨ一２型小智能环境气候舱（武汉市宇信科技开发有限公司）；８．４Ｌ通气式干燥器；４１６０—２型甲醛测定仪（美国ＩＮＴＥＲＳＣＡＮ公司）；ＤＹＹ一Ⅲ型电泳槽（北京市六一仪器厂）；ＤＹＹ—ＩＩＢ型三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）；低温冷冻离心机（ＳＩＧＭ）；ＢＨ一２型荧光显微镜（ＯＬＹＭ—

ＰＵＳ）；０．６３５

ＣｌＴＩ

试剂均为分析纯。

１．２实验方法

１．２．１实验动物及染毒方案选用湖北省疾病预防控制中，Ｌ－提供的健康雄性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠（２０ｇ左右）２０只，随机分为４组，即１个空白对照组和３个染毒组。采用动态吸入染毒，在玻璃缸中进行（由８．４Ｌ通气式干燥器改制）。经ＷＨ一２型小型智能环境气侯舱配制后，持续稳定地输出浓度分别为０．５，１．０和３．０ｍｅ．／ｍ３的甲醛气体。甲醛浓度经１４６０—２型甲醛测定仪测定，灵敏度为０．０１２ｍｇ／ｍ３，准确度为０．０２４ｍｇ／ｍ３，染毒组每日染毒６ｈ，连续１４ｄ。对照组在同等条件下的玻璃缸内，吸入经过滤的新鲜空气在不同浓度下进行重复实验。染毒期间，实验动物可以自由进食、进水。１．２．２肝细胞悬液制备实验动物在染毒结束后禁食２４颈椎脱臼处死。迅速取出肝脏，用眼科剪剪成糜状（约１

ｈ，

ｍｍ３

的组织块），４层纱布过滤；将细胞滤液１０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，用ＰＢＳ重新悬浮离心管底的细胞，并调整细胞密度。台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率接近９０％，细胞密度为１０５～１０６个／ｍｌ。

１．２．３单细胞凝胶电泳实验按文献［４，５］方法操作并稍加改进。在完全磨毛的载玻片上辅３层凝胶，将三明治式凝胶

１５０万相素数码相机（日本Ｎｉｋｏｎ公司）。

１０％福尔马林溶液（美国Ｓｉｇｍａ公司）；正常熔点琼脂糖（Ｓｈａｎｇｈｍ）；低熔点琼脂糖（美国Ｐｒｅｍｅｇａ公司）；吖啶橙（Ａ）；

磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）（无Ｃａ２＋ＭＥ＋）；０．４％台盼蓝溶液；其他

＊基金项目：国家科技部“十五”科技攻关计划基金资助（２００１ＢＡ７０４

１３０１．２００４ＢＡ８０９８０６０４，２００４ＢＡ８０９８０６０５）

在４１２下于裂解液中裂解２ｈ后，在２０Ｖ、１９０ｍＡ碱性条件下电泳２０ｍｉｎ，再经０．４ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液（ｐＨ７．５）中和３０

ｍｉｎ

作者单位：华中师范大学生命科学学院环境科学实验室，武汉

４３００７９

作者简介：王丽（１９８３一），女，四川泸州人，学士，主要从事环境毒

理学和分子生物学研究。

通讯作者：杨旭

后，用吖啶橙（２０ｍｇ／Ｌ）染色５ｒａｉｎ，双蒸水洗掉表面的染料，

２４

ｈ内在荧光显微镜下观察。

分析不同浓度甲醛作用下单个细胞的拖尾

１．３统计分析

７１０中国公共卫生２００６年６月第２２卷第６期ＣｈｉｎＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＪｕｎ２００６Ｖ０１．２２Ｎｏ．６

率。通过荧光显微镜观察细胞，用ＣＡＳＰ彗星图象分析软件（从ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｐ．ｏｆ．ｐｌ／下载）自动分析。分析指标为尾部ＤＮＡ％和尾矩。实验测得的数据用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ９．０统计软件分析，作双尾ｔ检验。将各数据进行归一化处理时，按以下公式计算：

度最严重。当浓度进一步升高到３．０ｍｇ／ｍ３时，相对值已经低于１．０，表明细胞内产生了ＤＮＡ交联物。３讨论

本研究结果显示，不同浓度气态甲醛染毒１４ｄ后，可导致小鼠肝细胞核ＤＮＡ不同程度和类型的损伤。在０．５，１．０ｍｇ／ｍ３浓度下，核ＤＮＡ断裂程度明显高于对照组，在３．０ｍｇ／ｍ３浓度作用下，彗星细胞的拖尾程度明显减轻，表明甲醛诱导了ＤＮＡ交联物（ＤＮＡ—ＤＮＡ交联和／或ＤＮＡ一蛋白

相对Ｔａｉ，ＤＮＡ％＝萋蓬拿券告｝蓬莲基ｇ薹黜

（令空白组的尾矩和尾部ＤＮＡ％为１）。

当

２结果

２．１亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞的损伤作用（表１）

质交联）的产生，此结果与文献报道结果相吻合【５］。因此，根据本实验结果和其他相关报道（６］可以推测，甲醛引起的ＤＮＡ断裂的交联应可能是甲醛致癌作用的机制之一。

单细胞凝胶电泳（ＳｃＧＥ）技术是近年来发展起来的一项在单细胞水平上检测ＤＮＡ单双链断裂、碱性不稳定位点、ＤＮＡ交联和不完全切除修复位点等一系列ＤＮＡ损伤的技术。但ＳＣＧＥ操作过程中的诸多因素，如环境温度、裂解及电泳条件、中和时间、光照等，都会影响实验结果，致使实验的可重复性较差［３・７－８１。同一项实验在不同的实验室甚至在同一

甲醛浓度为０．５和１，０ｍｇ／ｍ３时，尾部ＤＮＡ％及尾距与空白对照组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。说明此浓度下甲醛诱导ＤＮＡ链的断裂。当甲醛浓度为３．０ｍｇ／ｍ３时，尾部ＤＮＡ％与空白组基本保持一致，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而尾矩显著下降且低于空白对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。说明在３．０ｍｇ／ｍ３时甲醛诱导核内ＤＮＡ交联物的形成，使ＤＮＡ在电泳中泳动受阻，迁移率降低，参数值下降。

表１不同浓度气态甲醛对小鼠肝细胞ＤＮＡ的损伤作用（ｉ±ｓ）

实验室的不同时间也会出现不同的结果。本实验采用归一化的统计方法，以对照组为尺，即统一设置为１，把各个剂量组与相应的对照组比对，用相对值表征ＤＮＡ的损伤程度，从丽探讨该方法的可行性。本研究结果证实了归一化的统计方法可以提高ＳＣＧＥ的可重复性，增加实验结果的准确性。因此，在实验过程中如果受实验条件限制，同一项研究不能在同一次实验中完成，或者由于实验本身的缺陷使实验的可重复性较差．建议采用归一化的处理方法弥补不可避免的环境因素或人为因素造成的实验误差。

（衷心感谢ＺｂｉｎｉｅｗＫｏｚａ，ＡｎｄｄｒｚｅｊＷｏｊｃｉｋ和Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ

Ｋｏｎｃａ

３位

注：＃检验，与同一组中的空白对照组相比，＊Ｐ＜０．０１，＊＊Ｐ＜

０．００１

博士为本实验提供了ＣＡＳＰ彗星分析软件）参考文献（１］

ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙ

２．２归一化的处理结果（图１）从图中可以看出甲醛浓度

ｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ

ｔｏ

ｏｎ

与ＤＮＡ损伤之间的效应趋势。在低浓度范围内，随甲醛浓度的升高，相对尾部ＤＮＡ％和相对尾矩呈上升趋势，在甲醛浓度升至１．０ｍｇ／ｍ３时２个值都达到顶点，此时的ＤＮＡ断裂程

Ｃａｎｃｅｒ［Ｒ］．ＩＡＲＣＣｌａｓｓｉｆｉｅｓ

Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ

ａｓ

Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ

Ｈｕｍａｎｓ，２００４：３０．

２，２００２．

［２］中华人民共和国国家职业卫生标准［Ｓ］．ＧＢＺ［３３

Ｔｉｃｅ

ＲＲ，Ａｇｕｒｅｌｌ

Ｅ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＤ，ｅｔ

ａ１．ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＧｄ／ＣｏｍｅｔＡｓ．

Ｔｅｓｔ—

ｓａｙ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ

ｆｏｒＩｎＶｉｔｒｏ

ａｎｄＩｎⅥ∞ＧｅｎｅｔｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ

ａ１．Ａｓｉｍｐｌｅ

ｉｎ

ｉｎｇ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｏｌＭｕａｇｅｎ，２０００，３５：２０６—２２１．

［４］

Ｓｉｎｇｈ

ＮＰ，ＭｃＣｏｙＭＴ，Ｔｉｃｅｏｆ

ｌｏｗ

ＲＲ。ｅｔ

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ

ｆｏｒ

ｑｕａｎ—

ｔｉｔａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＤＮＡ

ｄａｍａｇｅ

ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ

ｃｅ／ｌｓ［Ｊ］．ＥｘｐＣｅｌ／

Ｒｅｓ，１９８８，１７５：１８４—１９１．

（５３鲁志松，严彦，乔琰，等．气态甲醛对人体颓黏膜细胞遗传毒性的

研究［Ｊ］．中国环境科学，２００３，２３（６）：５６６—５６９．

［６］ＢｅａｌｌＪＲ，ＵｌｓａｍｅｒＡＧ．Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅａｎｄｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ａ

［Ｊ］．ＪＴｏｘｉｃｏｌＥｎｖｉｒｏｎＨｅａｌｔｈ，１９８４，１４（１）：１—２１．［７］［８］

０．０

０．５

１．０

ｔ．５

２，０

２．５

３．０

ｒｅｖｉｅｗ

鲁志松，乔琰，严彦，等．人体颊黏膜细胞彗星实验方法学研究［Ｊ】．环境科学研究，２００４，１７３（２３）：６６—７０．

Ｓｐｅｉｔｉｎｇ

Ｇ，ＴｒｅｎｚＫ。Ｓｃｈ５ＰＴ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｄｕｒ—

ｏｎ

ａｌｋａｌｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｒｅｓｕｌｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ

气态甲醛浓度（Ｉｎ∥ｍ’

图１归一化后的统计结果

ｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ［Ｊ］．ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１１０：７３—７８．

收稿日期：２００５—０９—１８（宋艳萍编辑刘铁校对）

亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞DNA损伤作用

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

王丽， 乔琰， 鲁志松， 丁书茂， 严彦， 杨旭

华中师范大学生命科学学院环境科学实验室,武汉,430079中国公共卫生

CHINESE JOURNAL OF PUBLIC HEALTH2006,22(6)3次

参考文献(8条)

1. 鲁志松;乔琰;严彦 人体颊黏膜细胞彗星实验方法学研究[期刊论文]-环境科学研究 2004(23)2. Beall JR;Ulsamer AG Formaldehyde and hepatotoxicity:a review 1984(01)

3. 鲁志松;严彦;乔琰 气态甲醛对人体颊黏膜细胞遗传毒性的研究[期刊论文]-中国环境科学 2003(06)

4. Speit G;Trenz K;Schü PT The influence of temperature during alkaline treatment and electrophoresison results obtained with the comet assay[外文期刊] 1999

5. Singh NP;McCoy MT;Tice RR A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage inindividual cells[外文期刊] 1988

6. Tice RR;Agurell E;Anderson D Single Cell Gel/Comet Assay:Guidelines for In Vitro and In VivoGenetic Toxicology Testing 2000

7. GBZ 2.中华人民共和国国家职业卫生标准 2002

8. International Agency for Research on Cancer IARC Classifies Formaldehyde as Carcinogenic to Humans 2004

引证文献(3条)

1. 牛凤兰. 宋德锋. 吕喆. 陈林 甲醛的毒性及预防研究进展[期刊论文]-现代预防医学 2010(12)

2. 徐晓宇. 肖国强. 刘凤想. 彭光银. 彭宇. 陈建. 杨旭 气态甲醛对卡氏毛园蛛细胞遗传毒性的研究[期刊论文]-生态毒理学报 2008(2)

3. 徐晓宇. 肖国强. 刘凤想. 彭光银. 彭宇. 陈建. 杨旭 气态甲醛对卡氏毛园蛛细胞遗传毒性的研究[期刊论文]-生态毒理学报 2008(2)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgggws200606038.aspx

中国公共卫生２００６年６月第２２卷第６期ＣｈｉｎＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＪｕｎ

２００６Ｖ０１．２２Ｎｏ．６７０９

文章编号：１００１．０５８０（２００６）０６—０７０９．０２中图分类号：Ｒ

１２２，１

文献标识码：Ａ

【实验研究】

亚急性甲醛吸人对小鼠肝细胞ＤＮＡ损伤作用＊

王丽，乔琰，鲁志松，丁书茂，严彦，杨旭

摘要：目的检测亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞的损伤作用。并探讨用归一化处理方法解决单细胞凝胶电泳重复性差的可行性。方法将小鼠分别暴露于不同浓度的气态甲醛（０．５，１．０和３．０ｍｇ／ｍ３）中染毒１４ｄ，每天６ｈ，用单细胞凝胶电泳技术检测肝细胞ＤＮＡ的损伤程度。结果０．５和１．０ｍｇ／ｍ３的甲醛可造成ＤＮＡ的严重断裂（Ｐ＜０．００１），而３．０ｍｇ／ｍ３的甲醛则引起显著的交联作用，归一化的结果与之相符，并表明不同浓度的甲醛导致不同程度和类型的ＤＮＡ损伤。结论甲醛可造成机体内肝细胞ＤＮＡ的断裂和交联，该损伤可能是甲醛致癌机制之一；归一化可以弥补单细胞凝胶电泳实验重复性不佳的缺陷。

关键词：气态甲醛；肝细胞ＤＮＡ损伤；单细胞凝胶电泳；归一化

Ｄａｍａｇｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｂａｃｕｔｅｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ

ｏｎ

ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃＤＮＡｉｎ

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Ｗ４ＮＧ以，Ｑ工Ａ０Ｙａｎ，ＬＵＺｈｉｓｏｎｇ，ｅｔａ１．Ｃｏｌｌｅｇｅ

ｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｅｎｔｒａｌＣ＾ｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗｕｈａｎ４３００７９，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

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ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＤＮＡｄａｍａｇｅａｆｔｅｒｓｕｂａｃｕｔｅｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅｅｘｐｏｓｕｒｅａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａ—ｓｔａｔｉｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ

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甲醛（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ＦＡ）已被列入确定的人类致癌物（１］。

由于甲醛致癌的原因还不甚清楚，故本文依据我国新颁布的职业卫生标准（２】，模拟甲醛在生产和生活中的实际暴露方式，建立亚急性染毒模型，检测气态甲醛对小鼠肝细胞的损伤作用。同时，单细胞凝胶电泳技术（ＳＣＧＥ）虽然应用广泛（３９，但是该技术受诸多因素影响，实验结果往往不能得到很好的重复。故本文引入归一化的数学处理方法，对单细胞凝胶电泳实验中可重复性差的问题加以探讨。以期使该技术得到更为广泛的应用和发展。１材料与方法

１．１仪器与试剂ＷＨ一２型小智能环境气候舱（武汉市宇信科技开发有限公司）；８．４Ｌ通气式干燥器；４１６０—２型甲醛测定仪（美国ＩＮＴＥＲＳＣＡＮ公司）；ＤＹＹ一Ⅲ型电泳槽（北京市六一仪器厂）；ＤＹＹ—ＩＩＢ型三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）；低温冷冻离心机（ＳＩＧＭ）；ＢＨ一２型荧光显微镜（ＯＬＹＭ—

ＰＵＳ）；０．６３５

ＣｌＴＩ

试剂均为分析纯。

１．２实验方法

１．２．１实验动物及染毒方案选用湖北省疾病预防控制中，Ｌ－提供的健康雄性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠（２０ｇ左右）２０只，随机分为４组，即１个空白对照组和３个染毒组。采用动态吸入染毒，在玻璃缸中进行（由８．４Ｌ通气式干燥器改制）。经ＷＨ一２型小型智能环境气侯舱配制后，持续稳定地输出浓度分别为０．５，１．０和３．０ｍｅ．／ｍ３的甲醛气体。甲醛浓度经１４６０—２型甲醛测定仪测定，灵敏度为０．０１２ｍｇ／ｍ３，准确度为０．０２４ｍｇ／ｍ３，染毒组每日染毒６ｈ，连续１４ｄ。对照组在同等条件下的玻璃缸内，吸入经过滤的新鲜空气在不同浓度下进行重复实验。染毒期间，实验动物可以自由进食、进水。１．２．２肝细胞悬液制备实验动物在染毒结束后禁食２４颈椎脱臼处死。迅速取出肝脏，用眼科剪剪成糜状（约１

ｈ，

ｍｍ３

的组织块），４层纱布过滤；将细胞滤液１０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，用ＰＢＳ重新悬浮离心管底的细胞，并调整细胞密度。台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率接近９０％，细胞密度为１０５～１０６个／ｍｌ。

１．２．３单细胞凝胶电泳实验按文献［４，５］方法操作并稍加改进。在完全磨毛的载玻片上辅３层凝胶，将三明治式凝胶

１５０万相素数码相机（日本Ｎｉｋｏｎ公司）。

１０％福尔马林溶液（美国Ｓｉｇｍａ公司）；正常熔点琼脂糖（Ｓｈａｎｇｈｍ）；低熔点琼脂糖（美国Ｐｒｅｍｅｇａ公司）；吖啶橙（Ａ）；

磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）（无Ｃａ２＋ＭＥ＋）；０．４％台盼蓝溶液；其他

＊基金项目：国家科技部“十五”科技攻关计划基金资助（２００１ＢＡ７０４

１３０１．２００４ＢＡ８０９８０６０４，２００４ＢＡ８０９８０６０５）

在４１２下于裂解液中裂解２ｈ后，在２０Ｖ、１９０ｍＡ碱性条件下电泳２０ｍｉｎ，再经０．４ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液（ｐＨ７．５）中和３０

ｍｉｎ

作者单位：华中师范大学生命科学学院环境科学实验室，武汉

４３００７９

作者简介：王丽（１９８３一），女，四川泸州人，学士，主要从事环境毒

理学和分子生物学研究。

通讯作者：杨旭

后，用吖啶橙（２０ｍｇ／Ｌ）染色５ｒａｉｎ，双蒸水洗掉表面的染料，

２４

ｈ内在荧光显微镜下观察。

分析不同浓度甲醛作用下单个细胞的拖尾

１．３统计分析

７１０中国公共卫生２００６年６月第２２卷第６期ＣｈｉｎＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＪｕｎ２００６Ｖ０１．２２Ｎｏ．６

率。通过荧光显微镜观察细胞，用ＣＡＳＰ彗星图象分析软件（从ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｐ．ｏｆ．ｐｌ／下载）自动分析。分析指标为尾部ＤＮＡ％和尾矩。实验测得的数据用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ９．０统计软件分析，作双尾ｔ检验。将各数据进行归一化处理时，按以下公式计算：

度最严重。当浓度进一步升高到３．０ｍｇ／ｍ３时，相对值已经低于１．０，表明细胞内产生了ＤＮＡ交联物。３讨论

本研究结果显示，不同浓度气态甲醛染毒１４ｄ后，可导致小鼠肝细胞核ＤＮＡ不同程度和类型的损伤。在０．５，１．０ｍｇ／ｍ３浓度下，核ＤＮＡ断裂程度明显高于对照组，在３．０ｍｇ／ｍ３浓度作用下，彗星细胞的拖尾程度明显减轻，表明甲醛诱导了ＤＮＡ交联物（ＤＮＡ—ＤＮＡ交联和／或ＤＮＡ一蛋白

相对Ｔａｉ，ＤＮＡ％＝萋蓬拿券告｝蓬莲基ｇ薹黜

（令空白组的尾矩和尾部ＤＮＡ％为１）。

当

２结果

２．１亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞的损伤作用（表１）

质交联）的产生，此结果与文献报道结果相吻合【５］。因此，根据本实验结果和其他相关报道（６］可以推测，甲醛引起的ＤＮＡ断裂的交联应可能是甲醛致癌作用的机制之一。

单细胞凝胶电泳（ＳｃＧＥ）技术是近年来发展起来的一项在单细胞水平上检测ＤＮＡ单双链断裂、碱性不稳定位点、ＤＮＡ交联和不完全切除修复位点等一系列ＤＮＡ损伤的技术。但ＳＣＧＥ操作过程中的诸多因素，如环境温度、裂解及电泳条件、中和时间、光照等，都会影响实验结果，致使实验的可重复性较差［３・７－８１。同一项实验在不同的实验室甚至在同一

甲醛浓度为０．５和１，０ｍｇ／ｍ３时，尾部ＤＮＡ％及尾距与空白对照组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。说明此浓度下甲醛诱导ＤＮＡ链的断裂。当甲醛浓度为３．０ｍｇ／ｍ３时，尾部ＤＮＡ％与空白组基本保持一致，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而尾矩显著下降且低于空白对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。说明在３．０ｍｇ／ｍ３时甲醛诱导核内ＤＮＡ交联物的形成，使ＤＮＡ在电泳中泳动受阻，迁移率降低，参数值下降。

表１不同浓度气态甲醛对小鼠肝细胞ＤＮＡ的损伤作用（ｉ±ｓ）

实验室的不同时间也会出现不同的结果。本实验采用归一化的统计方法，以对照组为尺，即统一设置为１，把各个剂量组与相应的对照组比对，用相对值表征ＤＮＡ的损伤程度，从丽探讨该方法的可行性。本研究结果证实了归一化的统计方法可以提高ＳＣＧＥ的可重复性，增加实验结果的准确性。因此，在实验过程中如果受实验条件限制，同一项研究不能在同一次实验中完成，或者由于实验本身的缺陷使实验的可重复性较差．建议采用归一化的处理方法弥补不可避免的环境因素或人为因素造成的实验误差。

（衷心感谢ＺｂｉｎｉｅｗＫｏｚａ，ＡｎｄｄｒｚｅｊＷｏｊｃｉｋ和Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ

Ｋｏｎｃａ

３位

注：＃检验，与同一组中的空白对照组相比，＊Ｐ＜０．０１，＊＊Ｐ＜

０．００１

博士为本实验提供了ＣＡＳＰ彗星分析软件）参考文献（１］

ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙ

２．２归一化的处理结果（图１）从图中可以看出甲醛浓度

ｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ

ｔｏ

ｏｎ

与ＤＮＡ损伤之间的效应趋势。在低浓度范围内，随甲醛浓度的升高，相对尾部ＤＮＡ％和相对尾矩呈上升趋势，在甲醛浓度升至１．０ｍｇ／ｍ３时２个值都达到顶点，此时的ＤＮＡ断裂程

Ｃａｎｃｅｒ［Ｒ］．ＩＡＲＣＣｌａｓｓｉｆｉｅｓ

Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ

ａｓ

Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ

Ｈｕｍａｎｓ，２００４：３０．

２，２００２．

［２］中华人民共和国国家职业卫生标准［Ｓ］．ＧＢＺ［３３

Ｔｉｃｅ

ＲＲ，Ａｇｕｒｅｌｌ

Ｅ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＤ，ｅｔ

ａ１．ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＧｄ／ＣｏｍｅｔＡｓ．

Ｔｅｓｔ—

ｓａｙ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ

ｆｏｒＩｎＶｉｔｒｏ

ａｎｄＩｎⅥ∞ＧｅｎｅｔｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ

ａ１．Ａｓｉｍｐｌｅ

ｉｎ

ｉｎｇ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｏｌＭｕａｇｅｎ，２０００，３５：２０６—２２１．

［４］

Ｓｉｎｇｈ

ＮＰ，ＭｃＣｏｙＭＴ，Ｔｉｃｅｏｆ

ｌｏｗ

ＲＲ。ｅｔ

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ

ｆｏｒ

ｑｕａｎ—

ｔｉｔａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＤＮＡ

ｄａｍａｇｅ

ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ

ｃｅ／ｌｓ［Ｊ］．ＥｘｐＣｅｌ／

Ｒｅｓ，１９８８，１７５：１８４—１９１．

（５３鲁志松，严彦，乔琰，等．气态甲醛对人体颓黏膜细胞遗传毒性的

研究［Ｊ］．中国环境科学，２００３，２３（６）：５６６—５６９．

［６］ＢｅａｌｌＪＲ，ＵｌｓａｍｅｒＡＧ．Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅａｎｄｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ａ

［Ｊ］．ＪＴｏｘｉｃｏｌＥｎｖｉｒｏｎＨｅａｌｔｈ，１９８４，１４（１）：１—２１．［７］［８］

０．０

０．５

１．０

ｔ．５

２，０

２．５

３．０

ｒｅｖｉｅｗ

鲁志松，乔琰，严彦，等．人体颊黏膜细胞彗星实验方法学研究［Ｊ】．环境科学研究，２００４，１７３（２３）：６６—７０．

Ｓｐｅｉｔｉｎｇ

Ｇ，ＴｒｅｎｚＫ。Ｓｃｈ５ＰＴ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｄｕｒ—

ｏｎ

ａｌｋａｌｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｒｅｓｕｌｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ

气态甲醛浓度（Ｉｎ∥ｍ’

图１归一化后的统计结果

ｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ［Ｊ］．ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１１０：７３—７８．

收稿日期：２００５—０９—１８（宋艳萍编辑刘铁校对）

亚急性甲醛吸入对小鼠肝细胞DNA损伤作用

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

王丽， 乔琰， 鲁志松， 丁书茂， 严彦， 杨旭

华中师范大学生命科学学院环境科学实验室,武汉,430079中国公共卫生

CHINESE JOURNAL OF PUBLIC HEALTH2006,22(6)3次

参考文献(8条)

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引证文献(3条)

1. 牛凤兰. 宋德锋. 吕喆. 陈林 甲醛的毒性及预防研究进展[期刊论文]-现代预防医学 2010(12)

2. 徐晓宇. 肖国强. 刘凤想. 彭光银. 彭宇. 陈建. 杨旭 气态甲醛对卡氏毛园蛛细胞遗传毒性的研究[期刊论文]-生态毒理学报 2008(2)

3. 徐晓宇. 肖国强. 刘凤想. 彭光银. 彭宇. 陈建. 杨旭 气态甲醛对卡氏毛园蛛细胞遗传毒性的研究[期刊论文]-生态毒理学报 2008(2)

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