中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
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ＣＲ结果的影响Ｐ３种死菌悬液制备方法对ＰＭＡ－ｑ
王慧党１，温书香１，王慧勤２，曹旭东３，陈创夫１
（石河子大学动物科学学院，新疆石河子 ８石河子大学生命科学学院，新疆石河子 ８１．３２００３；２．３２００３；
）石河子大学医学院，新疆石河子 ８３．３２００３
摘要：本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法３种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法，比较不同灭菌方法制备的死菌对ＰＭＡ选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结ＣＲ偶联技术结果的影响，Ｐ－ｑ核分支杆菌死菌；探索ＰＭＡ热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆ＰＣＲ偶联技术的适用范围和局限性。结果表明，－ｑ菌死菌悬液影响ＰＭＡ紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对ＰＭＡＣＲ检测的Ｃｔ值的变化；ＣＲ检测的Ｃｔ值没ＰＰ－－ｑｑ有影响；热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法；ＰＭＡＰＣＲ偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的－ｑ检测。
关键词：热灭活；超声；紫外线照射ＣＲ偶联技术；ＰＭＡＰ－ｑ
（）中图分类号：Ｑ７００７８ 文献标识码：６７１２３６２０１４１２０１５５Ａ 文章编号：１－－－
它对ＤＮＡ分子 ＰＭＡ是一种叠氮类核酸染料，具有高度亲和力，在６５０Ｗ卤素灯照射条件下交联产物不能作为ＮＡ分子共价交联，ＰＭＡ与Ｄ
ＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增。ＰＭＡ不能穿透具有完Ｄ
整细胞膜的细胞，因此被阻隔在细胞膜外，在光照条件下形成没有活性的惰性物质（ｏｃｋｅｒ等，２００６；Ｎ
收稿日期：０３０１４６０２－－
，作者简介：女，河南人，王慧党（硕士生，研究方向：畜禽９８７－）１
病原分子生物学。
：通信作者：陈创夫。Ｅ－ｍｘａｉｌｃｃｆｂ６３．ｃｏｍ－＠１
）。基金项目：国家科技重大专项（０ＺＸ１０００３００３０２２０１３－
），而该惰性物质并不影响后续ＰＧｕ等，２００７ＣＲ的
扩增。在细胞膜受损的条件下ＰＭＡ能穿透细胞膜并与Ｄ在曝光条件下与ＤＮＡ分子结合，ＮＡ分子共价交联从而抑制ＤＮＡ分子扩增。ｑＣＲ技术是近Ｐ几年来新兴起的一门用于ＰＣＲ初始模板量定量检测的技术，研究表明其检测的灵敏度达／ＰＣＲ结合技术能选择性检５ＣＦＵｍＬ。ＰＭＡ与ｑ２
，，蒋志国等，并被广泛测活菌（ｈａｉｒｏ２００１；００８）２Ｓｐ应用于食源性病原菌和其他病原菌中活菌的检测。ＰＣＲ偶联技术虽能从所得样品中选择性检ＰＭＡ－ｑ，是指具有完整细胞但这里所说的“测“活菌”活菌”
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
（，Ｙ；，Ｙ１．Ｃａｎｚｈｏｕ２２５００９，ＣｈｉｎａｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔ ｇｇｙｇｇｙ
，，，ＲｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｎｏｆＪｉａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＢｒｅｅｄｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒ２．Ｋｅ ｐｇｇｙｇｙ
），，Ｎ；３．ＪＣｏ．Ｌｔｄ．ａｎｔｏｎ２２６１０３，ＣｈｉｎａＧｒｏｕＹａｎｚｈｏｕ２２５００９，ＣｈｉｎａｉａｎｓｕＪｉｎｈａｉＰｏｕｌｔｒ ｇｇｇｇｙｐ
：ｎＲＨＲｇｎｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｔｈｅａｒｏｒｉａｔｅｅｘｏｅｎｏｕｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎｅＧＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ ｐｐｐｇｐｏｎｌｉｎｅｔｏｏｌｓＣＵＳＰ，ＣＨＩＰＳａｎｄＣｏｄｏｎＷｓｏｆｔｗａｒｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｚｅｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｓｔｅｍ，ｎＲＨＲｇｎｅ．ｎ－ｅＧＧ ｙｙ，ｍｅｅＲＨＲｇＧｎｅｗａｓｃｏｍａｒｅｄｔｏｏｔｈｅｒｅｎｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎｏｄｅｌａｎｉｍａｌｅｎｏｍｅｓａｎｄｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｔｈｅｒｓｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ｐｇｇｐ，ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＮｃｖａｌｕｅｏｆｎＲＨＲｇｎｅｉｎＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎｗａｓｓｍａｌｌｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｔｒｏｎｃｏｄｏｎｂｉａｓ．ｎＲＨＲｇｎｅｅｅＧＧ ｇｇ ｗａｓｂｉａｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｓｎｏｎｍｏｕｓｃｏｄｏｎｓｗｉｔｈＧａｎｄＣａｔｔｈｅｔｈｉｒｄｃｏｄｏｎｏｓｉｔｉｏｎ．ＧＣｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｒｅａｔｅｒｔｈａｎＡＴｃｏｎｔｅｎｔｉｎ ｙｙｐｇ，ＣＤＳｒｅｉｏｎｏｆｅｅＧＧｎＲＨＲｇｎｅ．ＡｎａｌｓｉｓｂＣｏｄｏｎＷｓｏｆｔｗａｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｎｃｏｄｏｎｓｏｆｎＲＨＲｇｎｅｉｎＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎ ｇｙｙｇ ／ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＡＧＣ，ＴＣＣａｎｄＧＴＧｗｅｒｅｏｆｓｔｒｏｎｂｉａｓａｎｄｅｎｄｗｉｔｈＧＣ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１２ｂｉａｓｃｏｄｏｎｓ ｇ ／ｗｉｔｈＧＣａｔｔｈｅｔｈｉｒｄｃｏｄｏｎｏｓｉｔｉｏｎｉｎ３１ｇｅｎｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎ．Ｃｏｄｏｎｂｉａｓｃｏｍａｒｉｓｏｎｔｏｏｔｈｅｒｓｅｃｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅ －ｐｐｐ，ｗｅｅｗｅｅｎｎＲＨＲｇｎｅａｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅｓｅｃｉｅｓｗｅｒｅｖｅｒｌａｒｅｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｎＲＨＲｇｎｅｗａｓｎｏｔｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｅｘｏｅｎｏｕｓｔＧＧ ｐｙｇｇ ／／ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｕｌｔｒｂｉａｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｓｎｏｎｍｏｕｓｃｏｄｏｎｓｃｏｎｔａｉｎｅｄＧＣｏｒｅｎｄｗｉｔｈＧＣ．ｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｕｒｅｅＧＧ ｐｐｙｙｙ ｓｅｃｉｅｓｈａｄｎｏｓｔｒｏｎｃｏｄｏｎｂｉａｓ．ＲｅｓｕｌｔｏｆｃｌｕｓｔｅｒｉｎｂａｓｅｄｏｎＲＳＣＵｖａｌｕｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｅｃｉｅｓｗｉｔｈｃｌｏｓｅｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ ｐｇｇｐｇｐ ｔｅｎｄｔｏｈａｖｅｓｉｍｉｌａｒｃｏｄｏｎｂｉａｓ．
：；；ＫｅｗｏｒｄｓＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎｎＲＨＲｇｎｅｃｏｄｏｎｂｉａｓｅＧ ｇｙ
（责任编辑 晋大鹏）
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生物技术
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期
膜的细菌。如果有些细菌已死亡，细胞膜仍然完整或通透性并没有改变，ＰＭＡ便不能进入这些死细胞内与Ｄ从而抑制死菌的扩增（刘艳艳ＮＡ结合，）。因此，细胞膜的完整与否或通透性是否等，２０１４改变与ＰＭＡ能否有效区分活菌和死菌密切相关。
改变细胞膜的完整性或通透性的方法主要有超声裂解、研磨、高压匀浆、冻融、低渗裂解、酸碱处理、有机溶剂处理、表面活性剂处理等（曲艳玲等，），这些杀菌消毒方法大多只适用于真核细胞和２００７
。结革兰氏阴性菌细胞膜的破坏（岳洪霞等，２０１０）细胞壁脂质含量核分支杆菌是一种革兰氏阳性菌，
可占自身重量的６脂质层在结核分支杆菌细胞０％，膜外构成一个致密且非常厚的网状结构。另外，在这种菌酸可阻止染肽聚糖的外面有一层分支菌酸，
料的入侵。因此，改变结核分支杆菌细胞膜的完整且这种改变的效果如何尚不性或通透性非常困难，
本研究选择了３种常用的结核分支杆清楚。为此，
菌致死方法，即热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法，利用ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对这３种死－ｑ
菌制备方法的效果进行评价，用以分析结核分支杆菌死菌悬液的不同致死方式对ＰＭＡＰＣＲ偶联技－ｑ术检测结果的影响；探索ＰＭＡＰＣＲ作为活菌检－ｑ测技术的适用范围和局限性；为后续试验选取有效的结核分支杆菌死菌悬液制备方式做铺垫。１ 材料与方法１．１ 材料 本研究所用菌种为结核分支杆菌标准，菌株（培养基为改良ＬＨ３ＡＴＣＣ２７２９４）Ｊ培 －７ＲＶ，，养基，叠氮溴化丙锭（美国Ｂ荧４００１３，ｉｏｔｉｕｍ公司），光定量Ｐ瑞士罗氏公司）ＣＲ仪（ＬｉｈｔＣｃｌｅｒ４８０， ｇｙ德国Ｏ６５０Ｗ卤素灯（６４５４０６５０Ｗ２４０Ｖ，ＳＲＡＭ
。公司）１．２ 方法
１．２．１ 引物设计与合成 根据结核分支杆菌１６ＳｒＲＮＡ基因设计１对用于ＰＣＲ和ｑＰＣＲ试验的引物。引物序列为：ＭＴＢＦ：５′ＣＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴ－－Ａ－；ＣＴＴＣＧ３′ＭＴＢ５′ＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＣＧＴＣＡＣ－－Ｒ：－－。引物由华大基因公司合成。３′
１．２．２ 结核分支杆菌单菌悬液的制备 将生长在７Ｈ９液体培养基中的结核分支杆菌收集到１５ｍＬ离心管中，向离心管中加入５～６粒玻璃珠，涡旋振，分装到２个Ｅ荡器上振荡２０ｍｉｎＰ管中，
／，离心５ｍ１２０００ｒｍｉｎｉｎＰＢＳ清洗３次。用无菌蒸馏水将结核分支杆菌稀释并调整到１个麦氏浓度，最后再将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液
备用。１∶１００稀释，
１．２．３ ＰＭＡ和样品的处理过程 将ＰＭＡ溶解于
／中，配制成０２０％的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）．５ｍｍＬｇ于－２０℃保存。取５００μＬ制备好的结ＰＭＡ原液，
核分支杆菌单菌悬液加入一定浓度的ＰＭＡ，避光１０ｍｉｎ后将样品置于冰上，６５０Ｗ卤素灯１５ｃｍ处
／曝光１５ｍｉｎ，１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ。ＰＢＳ清洗３
／次，所得沉淀加入２００μＬ无菌蒸馏水，１２０００ｒｍｉｎ离心３ｍ取上清备用。ｉｎ，
１．２．４ ＤＮＡ样品的制备 将１个麦氏浓度的结核
／分支杆菌单菌悬液１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ后收集／沉淀，用４００μＬ内含１０ｍｍｏｌＬＴｒｉｓｌ和 －ＨＣ
／１ｍｍｏｌＬＥＤＴＡ的ＴＥ缓冲液吹打悬浮起来，
。室温冷却后加入溶菌酶使其终８５℃灭活４０ｍｉｎ／浓度为５ｍ充分混匀后，静置１ｈ。向混合液ｍＬ，ｇ／充分中加入２ｍｍＬ蛋白酶Ｋ和１％ＳＤＳ溶液，ｇ
混匀后，５０℃条件下孵育过夜。向上述溶液中加／／充分５ｍｏｌＬＮａＣｌ和ＣＴＡＢＮａＣｌ溶液各１００μＬ，
混匀至乳白色，加入等体积的氯６５℃孵育１０ｍｉｎ，／，仿／异戊醇，缓慢混匀，吸１２０００ｒｍｉｎ离心２０ｍｉｎ取上清并放在另一灭菌的大号离心管中。向上清中／加５ｍｏｌＬＮａＣｌ和２倍体积的异丙醇以沉淀核酸， ／１２０００ｒｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。用７０％乙醇漂洗沉淀，室温干燥后，将Ｄ于ＮＡ溶于ＴＥ缓冲溶液中，－２０℃保存备用。
１．２．５ ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制效果的评估 将提
／取的Ｄ分装到各ＮＡ用去离子水稀释到２００ｎＬ，ｇμＥＰ管中。向各管加入ＰＭＡ使其终浓度分别为
／将充分混０．１、０．５、１、２μｍＬ。按１．２．３处理后，ｇ匀后的ＤＮＡ悬液作为模板进行普通ＰＣＲ。ＰＣＲ
反应体系２去离子水５μ上、０μＬ：Ｍｉｘ１２．５μＬ，Ｌ， 下游引物各０模板２μ．２５μＬ，Ｌ。ＰＣＲ反应条件：
，，９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ３０个循环；７２℃再延伸５ｍｉｎ。将ＰＭＡ与ＤＮＡ共价交联后的ＰＣＲ产物进行琼脂糖
凝胶电泳。
１．２．６ ＰＭＡＰＣＲ与热灭活致死法制备的死菌悬－ｑ液相互作用 将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液８热灭活时间分别为０、５℃热灭活，５、１０、１５、灭活后立刻放在冰上冷冻５ｍ２０、２５、３０、３５ｍｉｎ，ｉｎ，
／如此反复３～４次，１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，调整１个麦氏浓度，用去离子水１∶１００稀释备用。向不同灭活时间点的结核分支杆菌单菌悬／液中加入ＰＭＡ，使其终浓度为３μ按１ｍＬ，．２．３ｇ
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
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处理，上清用作ｑＰＣＲ模板。ｑＰＣＲ反应体系
ＰＣＲ ２５μＬ：２×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭｉｘｔｕｒｅ１２．５μＬ， ｑ
／下游引物各０ＰＣＲ模板２５μｍｏｌＬ上、．２５μＬ，ｑ去离子水７μ５μＬ，Ｌ。ｑ９５℃预变ＰＣＲ反应条件：；，，性５ｍｉｎ９５℃变性３０ｓ５５℃退火３０ｓ７２℃延伸，求出平均３０ｓ４０个循环。每个样品重复３次，Ｃｔ值。
ＰＣＲ与超声裂解致死法制备的死菌１．２．７ ＰＭＡ－ｑ悬液相互作用 将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液置于１５ｍＬ离心管中并将离心管放在冰水、超声间歇比浴中经过２０ｋＨｚ６００Ｗ超声仪超声，为１超声处理时间分别为０、０∶１０，５、１０、１５、２０、２５、。将不同超声时间点的结核分支杆菌单３０、３５ｍｉｎ
／用Ｐ菌悬液１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＢＳ清洗３～５次后重新调整到１个麦氏浓度，１∶１００稀释备用，最后将ＰＭＡ与不同超声时间点的菌悬液相互作方法同１用，．２．６。
１．２．８ ＰＭＡＰＣＲ与紫外线照射法制备的死菌悬－ｑ液相互作用 将１个麦氏浓度结核分支杆菌单菌悬液置于玻璃器皿中，菌悬液的量刚刚掩盖器皿底部将玻璃器皿放在距离紫外灯１最好，０ｃｍ处垂直照射，照射时间分别为０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、
，照射过程中不断晃动菌悬液保证结核分支９０ｍｉｎ杆菌单菌悬液充分接受紫外线。在各个时间点取出１ｍＬ结核分支杆菌单菌悬液放在１．５ｍＬＥＰ管
之后将不同照射时间点的结核分支杆菌单菌悬中，
／液１调整１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，个麦氏浓度，用去离子水１∶１００稀释备用。最后将ＰＭＡ与不同时间点的结核分支杆菌单菌悬液相互方法同１作用，．２．６。１．２．９ 统计学分析 使用ＳＰＳＳ１７．０软件对试验 数据进行统计学分析。
２ 结果与分析２．１ ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制效果的评估 ＰＭＡ与ＤＮＡ共价交联后再进行ＰＣＲ，ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图１。由图１可知，随着ＰＭＡ浓度的增加，ＰＭＡ与ＤＮＡ形成的交联产物的量越来越多，用于ＰＣＲ有效扩增的模板量越来越少，ＰＣＲ产物越来越少，因此电泳条带越来越不清晰。当／ＰＭＡ浓度达到２μｍＬ时，ＰＭＡ已完全抑制了ｇ
在电泳图上几乎看不到ＰＤＮＡ分子的扩增，ＣＲ产物，从而证实了ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增有抑制作用。２．２ 热灭活致死法对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响 －ｑ热灭活致死法不同灭活时间所得死菌悬液Ｃｔ
值的
图２ 不同热灭活致死时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
；注：肩标不同字母表示差异显著（肩标相同字母Ｐ＜０．０５）
）。下同。或无字母标注表示差异不显著（Ｐ＞０．０５
图１ 不同浓度ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制的电泳图
注：阳性对照；１，２～５，ＰＭＡ浓度分别为０．１、０．５、１、／。２μｍＬ；Ｍ，ＤＬ５００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒｇ
变化结果见图２。由图２可知，随着热灭活时间的延长，当热灭活时ＰＭＡｔ值逐渐升高，ＰＣＲ所得Ｃ－ｑ间≤１０ｍｉｎ时各时间点上的Ｃｔ值间差异显著（Ｐ＜）；当热灭活时间≥１各个时间点上的０．０５０ｍｉｎ时，
，表明热灭活致死Ｃｔ值之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）法制备死菌悬液的时间在１且该法通过５ｍｉｎ以上，改变膜的完整性或通透性影响ＰＭＡＰＣＲ检测结－ｑ果的Ｃｔ值变化
。
２．３ 超声裂解致死法对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑＰＣＲ技术对不同超声致死时间点制备的 ＰＭＡ－ｑ
死菌悬液Ｃ随着ｔ值检测结果见图３。由图３可知，超声致死时间的延长，各个超声致死时间点的Ｃｔ值不断升高。当超声致死时间超过１各个超０ｍｉｎ时，声致死时间点的Ｃ且各组间ｔ值只有较小的增加，，当超声时间超过Ｃｔ值无显著差异（Ｐ＞０．０５）
这表明绝大多数结核３０ｍｉｎ时，Ｃｔ值便不再增加，分支杆菌细胞膜已被破坏，ＰＭＡ穿过膜受损的结核分支杆菌细胞膜，与ＤＮＡ共价交联从而抑制死菌扩增。超声裂解致死法通过改变膜的完整性或通透性影响ＰＭＡｔ值变化。ＰＣＲ的Ｃ－ｑ
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生物技术
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期
备死菌悬液时，易在探头周围形成结核分支杆菌气溶胶，危害工作人员的健康。因此，本试验选择热灭活致死法作为后续试验中死菌的制备方法。３ 讨论
ＰＭＡＰＣＲ偶联技术是集合ＰＭＡ能选择性－ｑ检测活菌和ｑＰＣＲ检测的高度灵敏性于一身的新兴。但该技现代分子生物学诊断技术（Ｌｅｅ等，２００９）术也有自身的缺陷，如ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对细－ｑ胞膜依然完好的死菌ＤＮＡ扩增不产生抑制作用。
图３ 不同超声致死时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
为此本试验选择３种结核分支杆菌致死方式，再用ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对不同致死方式制备的死菌－ｑ
进行检测，比较不同死菌制备方法对ＰＭＡＰＣＲ－ｑ结果的影响，探索该技术的适用范围和本身的局限为后续试验筛选真实可行的死菌单菌悬液的致性，
死方法做铺垫。
在结核分支杆菌３种致死方式对ＰＭＡＰＣＲ－ｑ结果的影响试验中，作者发现热灭活致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测－ｑ结果。随着热灭活致死时间的延长，ｔＰＣＲ所得Ｃｑ值逐渐增高。当Ｃｔ值稳定在一个固定值不再增高时就说明结核分支杆菌单菌悬液中已有绝大多数单个菌落的细胞膜被破坏，ＰＭＡ与暴露的核酸进行有效的相互作用从而抑制核酸的扩增。这说明ＰＭＡＰＣＲ偶联技术能实现对热灭活致死法制备－ｑ
）死菌悬液进行有效检测。这与张晶等（研究的２００３ＰＭＡ能有效抑制热灭活致死法制备的创伤弧菌死
菌扩增的结果一致。
超声裂解致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测结果。随着超声致死时－ｑ
当超声时间间的延长，ｔ值逐渐增高，ＰＣＲ所得Ｃｑ超过１５ｍｉｎ后，Ｃｔ值不再随着超声时间的延长而这说明ＰＭＡ已完全抑制死菌暴露Ｄ增加，ＮＡ的扩增。ＰＭＡＰＣＲ偶联技术可用于超声裂解致死法－ｑ）制备死菌的检测。这与李聪聪等（用该技术对２０１２超声裂解制备的大肠杆菌死菌扩增效率的评价结果相一致。
在紫外线照射法制备的死菌检测试验中，随着紫外照射时间的延长，ｔ值之间差异并ＰＣＲ所得Ｃｑ，不显著（这表明紫外照射法制备的死菌Ｐ＞０．０５）悬液对ＰＭＡＰＣＲ检测结果没有影响。这可能是－ｑ因为紫外照射法在杀菌的同时并没有改变细胞膜对ＰＭＡ的通透性，ＰＭＡ不能穿透结核分支杆菌细胞
膜与Ｄ而是被阻隔在结核分支杆菌ＮＡ相互作用，细胞外。因此，ＰＭＡＰＣＲ偶联技术难以实现对紫－ｑ
２．４ 紫外线照射法对ＰＭＡＰＣＲ检测结果的影－ｑ响 ＰＭＡＰＣＲ技术对紫外线照射致死法制备的－ｑ死菌悬液检测结果显示，随着紫外线照射时间的延长，各个时间点之间的Ｃｔ值并没有显著差异（Ｐ＞）（），图４表明ＰＭＡ并没有与紫外线照射处理０．０５
过的结核分支杆菌Ｄ生成不可扩增ＮＡ共价交联，产物。紫外线照射法不能改变细胞膜对ＰＭＡ的通透性，因此对ＰＭＡｔ值没有影响或ＰＣＲ检测的Ｃ－ｑ影响很小
。
图４ 不同紫外线照射时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
２．５ ３种制备死菌方法的比较 随着死菌处理时间的延长，热灭活法和超声裂解致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测的Ｃｔ－ｑ值，且Ｃ表明ＰＭＡｔ值呈上升趋势，ＰＣＲ可以实现－ｑ对热灭活致死法和超声裂解致死法制备死菌的检紫外线照射法制备测。然而随着处理时间的延长，
即ＰＭＡ的死菌悬液的Ｃｔ值之间没有明显的差异，难以实现对紫外线照射法制备的死菌扩增产生抑制这提示ＰＭＡ作用，ＰＣＲ偶联技术不适用于对具－ｑ
有完整细胞膜的死菌进行检测。３种方法相比，ＰＣＲ偶联技术不适用于紫外线照射法制备ＰＭＡ－ｑ
的死菌悬液检测，适用于热灭活致死法和超声裂解致死法制备的死菌悬液检测。但超声裂解致死法制
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
］（）：中国人兽共患病学报，立［Ｊ．２００３，２９１５４～５８．
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外线照射致死法制备死菌悬液的检测。这与罗剑飞）等（在ＰＭＡＰＣＲ检测紫外线照射法制备的２０１０－ｑ大肠杆菌死菌的研究结果一致。３种结核分支杆菌死菌致死方法相比，ＰＭＡＰＣＲ技术可以实现对热－ｑ灭活致死法和超声裂解致死法制备死菌悬液的检测，难以实现对紫外线照射法制备死菌悬液的检测。与热灭活致死法相比，超声裂解致死法在制备死菌悬液的过程中，易在超声仪周围形成结核分支杆菌气溶胶，引起生物安全隐患。因此，在后续试验中，选择热灭活法作为死菌悬液的制备方法。
参
考
文
献
林炜铁，郭勇．５ 罗剑飞，ＰＭＡ与ＰＣＲ结合的细菌活细胞检测方
］，（）：法［华南理工大学学报（自然科学版）Ｊ．２０１０，３８９１４２～１４５．田延军，等．细胞破碎方法对几丁质脱乙酰酶活６ 岳洪霞，赵祥颖，
］（）：力的影响［山东食品发酵，Ｊ．２０１０，１５６１３～８．
］杜琪珍．食品病原微生物快速检测技术研究进展［食Ｊ．７ 蒋志国，
（）：品研究与开发，２００８，２９３１６５～１７０．
ｕ Ｗ，ＬｅｖｉｎＲＥ．ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉａｂｌｅＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓｓｈｉ８ Ｇ ｇ－
ｅｌｌｏｉｄｅｓｉｎａｍｉｘｔｕｒｅｏｆｖｉａｂｌｅａｎｄｄｅａｄｃｅｌｌｓｕｓｉｎｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏ －ｇ
］，ｍｉｄｅｍｏｎｏａｚｉｄｅａｎｄｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲ［Ｊ．ＦｏｏｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ（）：２００７，２１２１４５～１５９．
ｅｅＪＬ，ＬｅｖｉｎＲＥ．ＡｃｏｍａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｏｆｔｈｅａｂｉｌｉｔｏｆＥＭＡ９ Ｌ ｐｙｙ
ａｎｄＰＭＡｔｏｄｉｓｔｉｎｕｉｓｈｖｉａｂｌｅｆｒｏｍｈｅａｔｋｉｌｌｅｄｍｉｘｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇ］，ｆｒｏｍｆｉｓｈｆｉｌｌｅｔｓ［Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｆｌｏｒａ ｇ（）：２００９，７６１９３～９６．
１０ＮｏｃｋｅｒＡ，ＣｈｅｕｎＣＹ，ＣａｍｅｒＡ Ｋ．Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｒｏｉｄｉｕｍ ｇｐｐｐｐ
ｍｏｎｏａｚｉｄｅｗｉｔｈｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｅａｎｄ ］ｄｅａｄｂａｃｔｅｒｉａｂｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｍｏｖａｌｏｆＤＮＡｆｒｏｍｄｅａｄｃｅｌｌｓ［Ｊ． ｙ ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２００６，６７：３１０～３２０． ｇ
：Ｈ Ｍ．ＭｕｌｔｉａｒａｍｅｔｅｒｆｌｏｗｃｔｏｍｅｔｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａＩｍｌｉ１１Ｓｈａｉｒｏ －ｐｙｙｐｐ
］，ｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｄｉａｎｏｓｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｓ［Ｊ．Ｃｔｏｍｅｔｒ２００１， ｇｐｙｙ（）：４３３２２３～２２６．
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ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴｈｒｅｅＫｉｎｄｓｏｆＤｅａｄＢａｃｔｅｒｉａｌＳｕｓｅｎｓｉｏｎＰｒｅａｒａｔｉｏｎ ｐｐ
ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓｏｎｔｈｅＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＭＡ －ｑ
１１２３１
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（责任编辑 吴 艳）
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
·１５·
ＣＲ结果的影响Ｐ３种死菌悬液制备方法对ＰＭＡ－ｑ
王慧党１，温书香１，王慧勤２，曹旭东３，陈创夫１
（石河子大学动物科学学院，新疆石河子 ８石河子大学生命科学学院，新疆石河子 ８１．３２００３；２．３２００３；
）石河子大学医学院，新疆石河子 ８３．３２００３
摘要：本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法３种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法，比较不同灭菌方法制备的死菌对ＰＭＡ选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结ＣＲ偶联技术结果的影响，Ｐ－ｑ核分支杆菌死菌；探索ＰＭＡ热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆ＰＣＲ偶联技术的适用范围和局限性。结果表明，－ｑ菌死菌悬液影响ＰＭＡ紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对ＰＭＡＣＲ检测的Ｃｔ值的变化；ＣＲ检测的Ｃｔ值没ＰＰ－－ｑｑ有影响；热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法；ＰＭＡＰＣＲ偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的－ｑ检测。
关键词：热灭活；超声；紫外线照射ＣＲ偶联技术；ＰＭＡＰ－ｑ
（）中图分类号：Ｑ７００７８ 文献标识码：６７１２３６２０１４１２０１５５Ａ 文章编号：１－－－
它对ＤＮＡ分子 ＰＭＡ是一种叠氮类核酸染料，具有高度亲和力，在６５０Ｗ卤素灯照射条件下交联产物不能作为ＮＡ分子共价交联，ＰＭＡ与Ｄ
ＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增。ＰＭＡ不能穿透具有完Ｄ
整细胞膜的细胞，因此被阻隔在细胞膜外，在光照条件下形成没有活性的惰性物质（ｏｃｋｅｒ等，２００６；Ｎ
收稿日期：０３０１４６０２－－
，作者简介：女，河南人，王慧党（硕士生，研究方向：畜禽９８７－）１
病原分子生物学。
：通信作者：陈创夫。Ｅ－ｍｘａｉｌｃｃｆｂ６３．ｃｏｍ－＠１
）。基金项目：国家科技重大专项（０ＺＸ１０００３００３０２２０１３－
），而该惰性物质并不影响后续ＰＧｕ等，２００７ＣＲ的
扩增。在细胞膜受损的条件下ＰＭＡ能穿透细胞膜并与Ｄ在曝光条件下与ＤＮＡ分子结合，ＮＡ分子共价交联从而抑制ＤＮＡ分子扩增。ｑＣＲ技术是近Ｐ几年来新兴起的一门用于ＰＣＲ初始模板量定量检测的技术，研究表明其检测的灵敏度达／ＰＣＲ结合技术能选择性检５ＣＦＵｍＬ。ＰＭＡ与ｑ２
，，蒋志国等，并被广泛测活菌（ｈａｉｒｏ２００１；００８）２Ｓｐ应用于食源性病原菌和其他病原菌中活菌的检测。ＰＣＲ偶联技术虽能从所得样品中选择性检ＰＭＡ－ｑ，是指具有完整细胞但这里所说的“测“活菌”活菌”
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
（，Ｙ；，Ｙ１．Ｃａｎｚｈｏｕ２２５００９，ＣｈｉｎａｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔ ｇｇｙｇｇｙ
，，，ＲｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｎｏｆＪｉａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＢｒｅｅｄｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒ２．Ｋｅ ｐｇｇｙｇｙ
），，Ｎ；３．ＪＣｏ．Ｌｔｄ．ａｎｔｏｎ２２６１０３，ＣｈｉｎａＧｒｏｕＹａｎｚｈｏｕ２２５００９，ＣｈｉｎａｉａｎｓｕＪｉｎｈａｉＰｏｕｌｔｒ ｇｇｇｇｙｐ
：ｎＲＨＲｇｎｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｔｈｅａｒｏｒｉａｔｅｅｘｏｅｎｏｕｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎｅＧＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ ｐｐｐｇｐｏｎｌｉｎｅｔｏｏｌｓＣＵＳＰ，ＣＨＩＰＳａｎｄＣｏｄｏｎＷｓｏｆｔｗａｒｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｚｅｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｓｔｅｍ，ｎＲＨＲｇｎｅ．ｎ－ｅＧＧ ｙｙ，ｍｅｅＲＨＲｇＧｎｅｗａｓｃｏｍａｒｅｄｔｏｏｔｈｅｒｅｎｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎｏｄｅｌａｎｉｍａｌｅｎｏｍｅｓａｎｄｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｔｈｅｒｓｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ｐｇｇｐ，ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＮｃｖａｌｕｅｏｆｎＲＨＲｇｎｅｉｎＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎｗａｓｓｍａｌｌｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｔｒｏｎｃｏｄｏｎｂｉａｓ．ｎＲＨＲｇｎｅｅｅＧＧ ｇｇ ｗａｓｂｉａｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｓｎｏｎｍｏｕｓｃｏｄｏｎｓｗｉｔｈＧａｎｄＣａｔｔｈｅｔｈｉｒｄｃｏｄｏｎｏｓｉｔｉｏｎ．ＧＣｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｒｅａｔｅｒｔｈａｎＡＴｃｏｎｔｅｎｔｉｎ ｙｙｐｇ，ＣＤＳｒｅｉｏｎｏｆｅｅＧＧｎＲＨＲｇｎｅ．ＡｎａｌｓｉｓｂＣｏｄｏｎＷｓｏｆｔｗａｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｎｃｏｄｏｎｓｏｆｎＲＨＲｇｎｅｉｎＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎ ｇｙｙｇ ／ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＡＧＣ，ＴＣＣａｎｄＧＴＧｗｅｒｅｏｆｓｔｒｏｎｂｉａｓａｎｄｅｎｄｗｉｔｈＧＣ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１２ｂｉａｓｃｏｄｏｎｓ ｇ ／ｗｉｔｈＧＣａｔｔｈｅｔｈｉｒｄｃｏｄｏｎｏｓｉｔｉｏｎｉｎ３１ｇｅｎｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎ．Ｃｏｄｏｎｂｉａｓｃｏｍａｒｉｓｏｎｔｏｏｔｈｅｒｓｅｃｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅ －ｐｐｐ，ｗｅｅｗｅｅｎｎＲＨＲｇｎｅａｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅｓｅｃｉｅｓｗｅｒｅｖｅｒｌａｒｅｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｎＲＨＲｇｎｅｗａｓｎｏｔｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｅｘｏｅｎｏｕｓｔＧＧ ｐｙｇｇ ／／ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｕｌｔｒｂｉａｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｓｎｏｎｍｏｕｓｃｏｄｏｎｓｃｏｎｔａｉｎｅｄＧＣｏｒｅｎｄｗｉｔｈＧＣ．ｎＲＨＲｇｎｅｏｆｏｕｒｅｅＧＧ ｐｐｙｙｙ ｓｅｃｉｅｓｈａｄｎｏｓｔｒｏｎｃｏｄｏｎｂｉａｓ．ＲｅｓｕｌｔｏｆｃｌｕｓｔｅｒｉｎｂａｓｅｄｏｎＲＳＣＵｖａｌｕｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｅｃｉｅｓｗｉｔｈｃｌｏｓｅｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ ｐｇｇｐｇｐ ｔｅｎｄｔｏｈａｖｅｓｉｍｉｌａｒｃｏｄｏｎｂｉａｓ．
：；；ＫｅｗｏｒｄｓＪｉｎｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎｎＲＨＲｇｎｅｃｏｄｏｎｂｉａｓｅＧ ｇｙ
（责任编辑 晋大鹏）
·１６·
生物技术
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期
膜的细菌。如果有些细菌已死亡，细胞膜仍然完整或通透性并没有改变，ＰＭＡ便不能进入这些死细胞内与Ｄ从而抑制死菌的扩增（刘艳艳ＮＡ结合，）。因此，细胞膜的完整与否或通透性是否等，２０１４改变与ＰＭＡ能否有效区分活菌和死菌密切相关。
改变细胞膜的完整性或通透性的方法主要有超声裂解、研磨、高压匀浆、冻融、低渗裂解、酸碱处理、有机溶剂处理、表面活性剂处理等（曲艳玲等，），这些杀菌消毒方法大多只适用于真核细胞和２００７
。结革兰氏阴性菌细胞膜的破坏（岳洪霞等，２０１０）细胞壁脂质含量核分支杆菌是一种革兰氏阳性菌，
可占自身重量的６脂质层在结核分支杆菌细胞０％，膜外构成一个致密且非常厚的网状结构。另外，在这种菌酸可阻止染肽聚糖的外面有一层分支菌酸，
料的入侵。因此，改变结核分支杆菌细胞膜的完整且这种改变的效果如何尚不性或通透性非常困难，
本研究选择了３种常用的结核分支杆清楚。为此，
菌致死方法，即热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法，利用ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对这３种死－ｑ
菌制备方法的效果进行评价，用以分析结核分支杆菌死菌悬液的不同致死方式对ＰＭＡＰＣＲ偶联技－ｑ术检测结果的影响；探索ＰＭＡＰＣＲ作为活菌检－ｑ测技术的适用范围和局限性；为后续试验选取有效的结核分支杆菌死菌悬液制备方式做铺垫。１ 材料与方法１．１ 材料 本研究所用菌种为结核分支杆菌标准，菌株（培养基为改良ＬＨ３ＡＴＣＣ２７２９４）Ｊ培 －７ＲＶ，，养基，叠氮溴化丙锭（美国Ｂ荧４００１３，ｉｏｔｉｕｍ公司），光定量Ｐ瑞士罗氏公司）ＣＲ仪（ＬｉｈｔＣｃｌｅｒ４８０， ｇｙ德国Ｏ６５０Ｗ卤素灯（６４５４０６５０Ｗ２４０Ｖ，ＳＲＡＭ
。公司）１．２ 方法
１．２．１ 引物设计与合成 根据结核分支杆菌１６ＳｒＲＮＡ基因设计１对用于ＰＣＲ和ｑＰＣＲ试验的引物。引物序列为：ＭＴＢＦ：５′ＣＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴ－－Ａ－；ＣＴＴＣＧ３′ＭＴＢ５′ＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＣＧＴＣＡＣ－－Ｒ：－－。引物由华大基因公司合成。３′
１．２．２ 结核分支杆菌单菌悬液的制备 将生长在７Ｈ９液体培养基中的结核分支杆菌收集到１５ｍＬ离心管中，向离心管中加入５～６粒玻璃珠，涡旋振，分装到２个Ｅ荡器上振荡２０ｍｉｎＰ管中，
／，离心５ｍ１２０００ｒｍｉｎｉｎＰＢＳ清洗３次。用无菌蒸馏水将结核分支杆菌稀释并调整到１个麦氏浓度，最后再将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液
备用。１∶１００稀释，
１．２．３ ＰＭＡ和样品的处理过程 将ＰＭＡ溶解于
／中，配制成０２０％的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）．５ｍｍＬｇ于－２０℃保存。取５００μＬ制备好的结ＰＭＡ原液，
核分支杆菌单菌悬液加入一定浓度的ＰＭＡ，避光１０ｍｉｎ后将样品置于冰上，６５０Ｗ卤素灯１５ｃｍ处
／曝光１５ｍｉｎ，１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ。ＰＢＳ清洗３
／次，所得沉淀加入２００μＬ无菌蒸馏水，１２０００ｒｍｉｎ离心３ｍ取上清备用。ｉｎ，
１．２．４ ＤＮＡ样品的制备 将１个麦氏浓度的结核
／分支杆菌单菌悬液１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ后收集／沉淀，用４００μＬ内含１０ｍｍｏｌＬＴｒｉｓｌ和 －ＨＣ
／１ｍｍｏｌＬＥＤＴＡ的ＴＥ缓冲液吹打悬浮起来，
。室温冷却后加入溶菌酶使其终８５℃灭活４０ｍｉｎ／浓度为５ｍ充分混匀后，静置１ｈ。向混合液ｍＬ，ｇ／充分中加入２ｍｍＬ蛋白酶Ｋ和１％ＳＤＳ溶液，ｇ
混匀后，５０℃条件下孵育过夜。向上述溶液中加／／充分５ｍｏｌＬＮａＣｌ和ＣＴＡＢＮａＣｌ溶液各１００μＬ，
混匀至乳白色，加入等体积的氯６５℃孵育１０ｍｉｎ，／，仿／异戊醇，缓慢混匀，吸１２０００ｒｍｉｎ离心２０ｍｉｎ取上清并放在另一灭菌的大号离心管中。向上清中／加５ｍｏｌＬＮａＣｌ和２倍体积的异丙醇以沉淀核酸， ／１２０００ｒｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。用７０％乙醇漂洗沉淀，室温干燥后，将Ｄ于ＮＡ溶于ＴＥ缓冲溶液中，－２０℃保存备用。
１．２．５ ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制效果的评估 将提
／取的Ｄ分装到各ＮＡ用去离子水稀释到２００ｎＬ，ｇμＥＰ管中。向各管加入ＰＭＡ使其终浓度分别为
／将充分混０．１、０．５、１、２μｍＬ。按１．２．３处理后，ｇ匀后的ＤＮＡ悬液作为模板进行普通ＰＣＲ。ＰＣＲ
反应体系２去离子水５μ上、０μＬ：Ｍｉｘ１２．５μＬ，Ｌ， 下游引物各０模板２μ．２５μＬ，Ｌ。ＰＣＲ反应条件：
，，９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ３０个循环；７２℃再延伸５ｍｉｎ。将ＰＭＡ与ＤＮＡ共价交联后的ＰＣＲ产物进行琼脂糖
凝胶电泳。
１．２．６ ＰＭＡＰＣＲ与热灭活致死法制备的死菌悬－ｑ液相互作用 将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液８热灭活时间分别为０、５℃热灭活，５、１０、１５、灭活后立刻放在冰上冷冻５ｍ２０、２５、３０、３５ｍｉｎ，ｉｎ，
／如此反复３～４次，１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，调整１个麦氏浓度，用去离子水１∶１００稀释备用。向不同灭活时间点的结核分支杆菌单菌悬／液中加入ＰＭＡ，使其终浓度为３μ按１ｍＬ，．２．３ｇ
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
·１７·
处理，上清用作ｑＰＣＲ模板。ｑＰＣＲ反应体系
ＰＣＲ ２５μＬ：２×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭｉｘｔｕｒｅ１２．５μＬ， ｑ
／下游引物各０ＰＣＲ模板２５μｍｏｌＬ上、．２５μＬ，ｑ去离子水７μ５μＬ，Ｌ。ｑ９５℃预变ＰＣＲ反应条件：；，，性５ｍｉｎ９５℃变性３０ｓ５５℃退火３０ｓ７２℃延伸，求出平均３０ｓ４０个循环。每个样品重复３次，Ｃｔ值。
ＰＣＲ与超声裂解致死法制备的死菌１．２．７ ＰＭＡ－ｑ悬液相互作用 将１个麦氏浓度的结核分支杆菌单菌悬液置于１５ｍＬ离心管中并将离心管放在冰水、超声间歇比浴中经过２０ｋＨｚ６００Ｗ超声仪超声，为１超声处理时间分别为０、０∶１０，５、１０、１５、２０、２５、。将不同超声时间点的结核分支杆菌单３０、３５ｍｉｎ
／用Ｐ菌悬液１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＢＳ清洗３～５次后重新调整到１个麦氏浓度，１∶１００稀释备用，最后将ＰＭＡ与不同超声时间点的菌悬液相互作方法同１用，．２．６。
１．２．８ ＰＭＡＰＣＲ与紫外线照射法制备的死菌悬－ｑ液相互作用 将１个麦氏浓度结核分支杆菌单菌悬液置于玻璃器皿中，菌悬液的量刚刚掩盖器皿底部将玻璃器皿放在距离紫外灯１最好，０ｃｍ处垂直照射，照射时间分别为０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、
，照射过程中不断晃动菌悬液保证结核分支９０ｍｉｎ杆菌单菌悬液充分接受紫外线。在各个时间点取出１ｍＬ结核分支杆菌单菌悬液放在１．５ｍＬＥＰ管
之后将不同照射时间点的结核分支杆菌单菌悬中，
／液１调整１２０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，个麦氏浓度，用去离子水１∶１００稀释备用。最后将ＰＭＡ与不同时间点的结核分支杆菌单菌悬液相互方法同１作用，．２．６。１．２．９ 统计学分析 使用ＳＰＳＳ１７．０软件对试验 数据进行统计学分析。
２ 结果与分析２．１ ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制效果的评估 ＰＭＡ与ＤＮＡ共价交联后再进行ＰＣＲ，ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图１。由图１可知，随着ＰＭＡ浓度的增加，ＰＭＡ与ＤＮＡ形成的交联产物的量越来越多，用于ＰＣＲ有效扩增的模板量越来越少，ＰＣＲ产物越来越少，因此电泳条带越来越不清晰。当／ＰＭＡ浓度达到２μｍＬ时，ＰＭＡ已完全抑制了ｇ
在电泳图上几乎看不到ＰＤＮＡ分子的扩增，ＣＲ产物，从而证实了ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增有抑制作用。２．２ 热灭活致死法对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响 －ｑ热灭活致死法不同灭活时间所得死菌悬液Ｃｔ
值的
图２ 不同热灭活致死时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
；注：肩标不同字母表示差异显著（肩标相同字母Ｐ＜０．０５）
）。下同。或无字母标注表示差异不显著（Ｐ＞０．０５
图１ 不同浓度ＰＭＡ对ＤＮＡ扩增抑制的电泳图
注：阳性对照；１，２～５，ＰＭＡ浓度分别为０．１、０．５、１、／。２μｍＬ；Ｍ，ＤＬ５００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒｇ
变化结果见图２。由图２可知，随着热灭活时间的延长，当热灭活时ＰＭＡｔ值逐渐升高，ＰＣＲ所得Ｃ－ｑ间≤１０ｍｉｎ时各时间点上的Ｃｔ值间差异显著（Ｐ＜）；当热灭活时间≥１各个时间点上的０．０５０ｍｉｎ时，
，表明热灭活致死Ｃｔ值之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）法制备死菌悬液的时间在１且该法通过５ｍｉｎ以上，改变膜的完整性或通透性影响ＰＭＡＰＣＲ检测结－ｑ果的Ｃｔ值变化
。
２．３ 超声裂解致死法对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑＰＣＲ技术对不同超声致死时间点制备的 ＰＭＡ－ｑ
死菌悬液Ｃ随着ｔ值检测结果见图３。由图３可知，超声致死时间的延长，各个超声致死时间点的Ｃｔ值不断升高。当超声致死时间超过１各个超０ｍｉｎ时，声致死时间点的Ｃ且各组间ｔ值只有较小的增加，，当超声时间超过Ｃｔ值无显著差异（Ｐ＞０．０５）
这表明绝大多数结核３０ｍｉｎ时，Ｃｔ值便不再增加，分支杆菌细胞膜已被破坏，ＰＭＡ穿过膜受损的结核分支杆菌细胞膜，与ＤＮＡ共价交联从而抑制死菌扩增。超声裂解致死法通过改变膜的完整性或通透性影响ＰＭＡｔ值变化。ＰＣＲ的Ｃ－ｑ
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生物技术
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期
备死菌悬液时，易在探头周围形成结核分支杆菌气溶胶，危害工作人员的健康。因此，本试验选择热灭活致死法作为后续试验中死菌的制备方法。３ 讨论
ＰＭＡＰＣＲ偶联技术是集合ＰＭＡ能选择性－ｑ检测活菌和ｑＰＣＲ检测的高度灵敏性于一身的新兴。但该技现代分子生物学诊断技术（Ｌｅｅ等，２００９）术也有自身的缺陷，如ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对细－ｑ胞膜依然完好的死菌ＤＮＡ扩增不产生抑制作用。
图３ 不同超声致死时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
为此本试验选择３种结核分支杆菌致死方式，再用ＰＭＡＰＣＲ偶联技术对不同致死方式制备的死菌－ｑ
进行检测，比较不同死菌制备方法对ＰＭＡＰＣＲ－ｑ结果的影响，探索该技术的适用范围和本身的局限为后续试验筛选真实可行的死菌单菌悬液的致性，
死方法做铺垫。
在结核分支杆菌３种致死方式对ＰＭＡＰＣＲ－ｑ结果的影响试验中，作者发现热灭活致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测－ｑ结果。随着热灭活致死时间的延长，ｔＰＣＲ所得Ｃｑ值逐渐增高。当Ｃｔ值稳定在一个固定值不再增高时就说明结核分支杆菌单菌悬液中已有绝大多数单个菌落的细胞膜被破坏，ＰＭＡ与暴露的核酸进行有效的相互作用从而抑制核酸的扩增。这说明ＰＭＡＰＣＲ偶联技术能实现对热灭活致死法制备－ｑ
）死菌悬液进行有效检测。这与张晶等（研究的２００３ＰＭＡ能有效抑制热灭活致死法制备的创伤弧菌死
菌扩增的结果一致。
超声裂解致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测结果。随着超声致死时－ｑ
当超声时间间的延长，ｔ值逐渐增高，ＰＣＲ所得Ｃｑ超过１５ｍｉｎ后，Ｃｔ值不再随着超声时间的延长而这说明ＰＭＡ已完全抑制死菌暴露Ｄ增加，ＮＡ的扩增。ＰＭＡＰＣＲ偶联技术可用于超声裂解致死法－ｑ）制备死菌的检测。这与李聪聪等（用该技术对２０１２超声裂解制备的大肠杆菌死菌扩增效率的评价结果相一致。
在紫外线照射法制备的死菌检测试验中，随着紫外照射时间的延长，ｔ值之间差异并ＰＣＲ所得Ｃｑ，不显著（这表明紫外照射法制备的死菌Ｐ＞０．０５）悬液对ＰＭＡＰＣＲ检测结果没有影响。这可能是－ｑ因为紫外照射法在杀菌的同时并没有改变细胞膜对ＰＭＡ的通透性，ＰＭＡ不能穿透结核分支杆菌细胞
膜与Ｄ而是被阻隔在结核分支杆菌ＮＡ相互作用，细胞外。因此，ＰＭＡＰＣＲ偶联技术难以实现对紫－ｑ
２．４ 紫外线照射法对ＰＭＡＰＣＲ检测结果的影－ｑ响 ＰＭＡＰＣＲ技术对紫外线照射致死法制备的－ｑ死菌悬液检测结果显示，随着紫外线照射时间的延长，各个时间点之间的Ｃｔ值并没有显著差异（Ｐ＞）（），图４表明ＰＭＡ并没有与紫外线照射处理０．０５
过的结核分支杆菌Ｄ生成不可扩增ＮＡ共价交联，产物。紫外线照射法不能改变细胞膜对ＰＭＡ的通透性，因此对ＰＭＡｔ值没有影响或ＰＣＲ检测的Ｃ－ｑ影响很小
。
图４ 不同紫外线照射时间对ＰＭＡＰＣＲ结果的影响－ｑ
２．５ ３种制备死菌方法的比较 随着死菌处理时间的延长，热灭活法和超声裂解致死法通过改变细胞膜的通透性或完整性影响ＰＭＡＰＣＲ检测的Ｃｔ－ｑ值，且Ｃ表明ＰＭＡｔ值呈上升趋势，ＰＣＲ可以实现－ｑ对热灭活致死法和超声裂解致死法制备死菌的检紫外线照射法制备测。然而随着处理时间的延长，
即ＰＭＡ的死菌悬液的Ｃｔ值之间没有明显的差异，难以实现对紫外线照射法制备的死菌扩增产生抑制这提示ＰＭＡ作用，ＰＣＲ偶联技术不适用于对具－ｑ
有完整细胞膜的死菌进行检测。３种方法相比，ＰＣＲ偶联技术不适用于紫外线照射法制备ＰＭＡ－ｑ
的死菌悬液检测，适用于热灭活致死法和超声裂解致死法制备的死菌悬液检测。但超声裂解致死法制
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷第１２期生物技术
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外线照射致死法制备死菌悬液的检测。这与罗剑飞）等（在ＰＭＡＰＣＲ检测紫外线照射法制备的２０１０－ｑ大肠杆菌死菌的研究结果一致。３种结核分支杆菌死菌致死方法相比，ＰＭＡＰＣＲ技术可以实现对热－ｑ灭活致死法和超声裂解致死法制备死菌悬液的检测，难以实现对紫外线照射法制备死菌悬液的检测。与热灭活致死法相比，超声裂解致死法在制备死菌悬液的过程中，易在超声仪周围形成结核分支杆菌气溶胶，引起生物安全隐患。因此，在后续试验中，选择热灭活法作为死菌悬液的制备方法。
参
考
文
献
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（责任编辑 吴 艳）