ELISA检测AFP试验精密度评价

ELISA检测AFP试验的精密度评价

一、实验原理

用酶标仪在主波长为450nm，次波长为630nm下，10min内测定各孔吸光度（A）。

ELISA的精密度可用标准差（S）和变异系数（CV）间接反映.

精密度：是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度不能直接测定，但是可用标准差（S）和变异系数（CV）间接反映，标准差（S）和变异系数（CV）越小，说明测定结果越集中，实验的精密度越高。

S

AA

i1

n1

n2

AA/nii1i1

n1

一般情况下CV

二、试剂与仪器

1.试剂：抗AFP包被的微孔板、AFP阳性对照、AFP阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、终止液、封板膜、显色剂A、显色剂B、高浓度AFP血清、低浓度AFP血清、蒸馏水 2.仪器：加样枪、恒温水浴箱、酶标仪、洗板机、消毒缸、吸水纸、吸咀、记号笔、洗瓶

三、操作方法实验前准备

1）用前30分钟从冰箱中取出试剂盒和待测标本，恢复至室温（18~25℃）

2）将恒箱或恒温水箱调至反应温度37℃

实验步骤（采用双抗体夹心一步法）

四、结果判断：

1. 有效性判断：阳性对照孔A值错误！未找到引用源。0.8，阴性对照孔A值错误！未找到引用源。0.1。否则实验无效。

2. 阴阳性对照孔可用，则肉眼观察阳性对照孔为黄色，阴性对照孔无色，空白对照孔无色，样品孔为黄色。酶标仪样品孔为阳性。

3. 利用各样品孔A值对ELISA试验进行精密度评价。标准差越小，表示精密度好。变异系数越小，表示精密度越好，且变异系数须

分别计算出样品孔A值的平均值、标准差和变异系数并进行精密度的评价。平均值错误！未找到引用源。

标准差错误！未找到引用源。

变异系数CV=错误！未找到引用源。

六．质量控制 1 试剂来源

1.1 质控标准物质2ngPml AFP测定用标准血清( 卫生部临床检验中心) 。 1.2 所用AFP ELISA试剂盒及质控血清均在有效期内使用。 2 实验室设备校准

2.1自动酶标洗板机本室根据计量手册的要求, 严格按作业指导书操作规程进行自校准, 并详细填写原始记录, 有自校准报告。

2.2 恒温培养箱调节并控制温度在37摄氏度之间。微量加样器、酶标仪均经国家标准物质研究中心检定合格, 并在检定周期( 1 年) 内使用, 本室严格按计量手册中作业指导书的操作规程对微量加样器还要定期进行期间核查, 对酶标仪检测数据进行不确定度分析 3、操作

3.1试验应设立阳性对照，阴性对照和空白对照组，以减少误差。

3.2严格按计量手册中作业指导书的操作规程进行操作常规条件下, 对新购同一批准备用于下一阶段室内质量控制的2ngPml 标准血清, 连续测定20 次, 根据20 次测定结果的OD值计算出平均值( x ) 及标准差( S) 七、注意事项和影响因素：

1、严格控制每步反应温度和时间，操作应紧凑。 2、终止液为2M硫酸，使用时注意安全。

3、用酶标仪比色读数结果时，应擦干酶标板底部，且孔内不能有气泡。不要触

碰孔底部的外壁，指印或划痕可能影响A值。

4、加标本和液体试剂时必须用加液器加注，并经常校对其准确性，以保证加样品时，每个孔的剂量一致。

5、加入不同标本或不同试剂组分时，应更换加样器吸头，以防止交叉污染。每个微孔的样品试剂不能溅出到其他微孔 6、所用ELISA试剂必须为同一厂家、同一批次，不同厂家和不同批次的试剂不能混合使用。

7、显色剂的量必须准确，并且次序为先加显色剂A，再加显色剂B。

8、显色时应避光显色。显色后加入终止剂后最好立即（最好10min内）测定A值。

9、洗涤时，必须是彻底洗净，特别是加入酶标抗体后的洗涤，那是本实验的关键步骤。

10、每步加试剂后都应轻轻混匀，并且温育时间要适当，保证试剂之间的充分反映。

11、在最后结果判断和A的测定时，前提条件是阴阳性对照可用的情况，如果阴阳性不可用，即阴阳性对照无效，则本实验无效，不能用于ELISA精密度的评价。应另外选用ELISA试剂盒。