第三代测序技术:单分子即时测序

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第三代测序技术：单分子即时测序

刘岩吴秉铨

ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。从人类基因组计划

（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划

（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ测序技术功不可没。特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进入了高通量、低成本的时代。目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。本文回顾了测序技术发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。

一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。在４个ＤＮＡ合成反应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测ＤＮＡ分子的序列。

２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。但用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。随后，平板电泳分离技术被毛细管电泳所取代，并且通过更高程度的并行化使得同时进行测序的样本数量成倍增加。目前应用最广泛的ＡＢＩ３７３０系列自动测序仪，即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的ＤＮＡ测序仪，在一次运行中可分析９６个样本。

第一代测序技术。在人类基因组计划ＤＮＡ测序的后期阶段起了关键作用，加速了人类基因组计划的完成。通过几十年的逐步改进，第一代测序仪的读长可以超过１０００ｂｐ，原

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－５８０７．２０１１．１０．０２２作者单位：１００１９１北京大学医学部病理学系通信作者：吴秉铨。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｑｗｍｄ＠ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃａ

万方数据

．综述．

始数据的准确率可以高达９９．９９９％，测定每千碱基长度序列的成本是０．５美元，每天的数据通量可以达到６０００００

ｂｐ。

尽管由于对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限，但因其久经考验的准确性和初具规模的市场占有率，第一代测序技术并不会很快退出历史舞台，它将与新的若干代测序平台并存，特别是在ＰＣＲ产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序以及短串联重复

（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ）基因分型方面继续发挥重要作用。

二、第二代ＤＮＡ测序（ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

随着人类基因组计划的完成，后基因组时代，即功能基因组时代已向我们走来。第一代测序方法已经不能满足深

度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序，又称下一代测序（ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）的诞生。

第二代测序方法，将基因组ＤＮＡ用限制性内切酶切割成一定长度范围的ＤＮＡ片段（即ＤＮＡ文库），然后在其两侧连上接头，用ＰＣＲ方法扩增出几百万个拷贝（克隆）并固定于平板基质上，每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成且可以被同时并行分析。测序过程根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序＂１和连接酶合成测序ＭＪ。前者使用修饰的ＤＮＡ聚合酶和标记了光学信号的某种ｄＮＴＰ混合试剂进行单碱基延伸测序反应，后者则是利用ＤＮＡ连接酶和荧光标记的寡核苷酸探针的混合试剂。每一次反应都包括混合试

剂掺入一合成链延伸一个碱基一光学信号采集一未反应试剂的洗涤４个步骤，经过这种重复的掺人一延伸一采集一洗

涤的过程，ｄＮＴＰ标记的光学信号能够通过显微设备观察成像并被不断记录下来，最后经过计算机分析就可以获得完整的ＤＮＡ序列信息，是一种边合成、边测序的技术。

第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条ＤＮＡ片段进行序列测定，使得对一个物种的转录组（ＲＮＡ）测序或基因组（ＤＮＡ）深度测序变得方便易行”Ｊ。该技术已逐步应用于多项人类基因研究，如单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ

ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ

ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）研究、小分子

ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）以及转录调控研究等。

第二代测序平台主要包括Ｒｏｃｈｅ４５４ＧＳ

ＦＬＸ测序平

台、Ｓｏｌｅｘａ

Ｇｅｎｏｍｅ

Ａｎａｌｙｚｅｒ测序平台和ＡＢＩＳＯＬＩＤ测序平

台【６４Ｊ，并于２００５年前后实现商业化，使用第一代Ｓａｎｇｅｒ等

的测序技术完成的人类基因组计划，花费了３０亿美元巨资，用了３年的时间；然而，使用第二代测序技术，完成一个人的基因组测序只需要１周左右的时间，费用降低到１０万美元

以下。

上述３种第二代测序技术平台各有所长，但亦各有所限。Ｒｏｃｈｅ４５４以焦磷酸测序为基础，主要优势是它的速度和读长（将近５００个碱基），但易出现同聚核苷酸导致的插入．缺失错误，如５＇－ＧＧＧＧ－３’被误读为５＇－ＧＧＧＧＧ－３’或５’－ＧＧＧ－３’。与Ｒｏｃｈｅ４５４相比，Ｓｏｌｅｘａ和ＳＯＬＩＤ拥有更高的通量和更低的成本，具有识别错误碱基的优点，但序列读长相对较短仍是主要的技术瓶颈，应运而生的第三代单分子测序技术是解决这一问题的一种方案。

三、第三代ＤＮＡ测序（ｔｈｉｒｄ・ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

第三代测序技术，也被称为“下、下一代测序（ｎｅｘｔ－ｎｅｘｔ—

ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）”，因其采用单分子读取技术，有着更快的数据读取速度和巨大的应用潜能。它不再需要ＰＣＲ扩增步骤，进一步降低了测序的成本。但在单分子水平上检测光学信号，必须降低非检测特异性背景（如游离的荧光标记ｄＮＴＰ）干扰。解决这一问题的基本原则是将检测局限在测序反应发生的实际位置附近，下面介绍一些已经开发或正在开发中的平台。

１．单分子即时ＤＮＡ测序（ｓｉｎｇｌｅ

ｍｏｌｅｃｕｌｅｒｅａｌｔｉｍｅＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）：简称ＳＭＲＴ，是在４种ｄＮＴＰ的１一磷酸上标记有不同发射光谱的荧光基团，当ＤＮＡ聚合酶催化ｄＮＴＰ掺入到合成链中时，使用显微镜可以检测到每个掺入ｄＮＴＰ所携带的荧光信号，经计算机分析转化为相应的碱基序列信息。这种荧光标记的ｄＮＴＰ不会影响ＤＮＡ聚合酶的活性，并且在掺入合成链后其荧光基团与＾ｙ－磷酸解离，合成的ＤＮＡ链和天然的ＤＮＡ链完全一样哺Ｊ。在显微镜即时记录ＤＮＡ链上的荧光的时候，ＤＮＡ链周围的众多游离的荧光标记ｄＮＴＰ形成了非常强大的荧光背景。单分子的荧光探测由一种被称为零级波导（ｚｅｒｏ

ｍｏｄｅｗａｖｅ

ｇｕｉｄｅ）的纳米结构来实现

ＤＮＡ聚合的即时观察和背景荧光干扰的消除一ｏ。该结构在一片薄金属膜上蚀刻出数以千计直径数十纳米的小孔，并将金属膜附着在透明的支持基质上，由于每个小孔的尺寸低于光的波长，所以当光线从透明的基质侧照射时无法透过小孔，而是在小孔底部形成指数衰减的消逝波，这样创造了一个很小体积的检测空间（ｚｅｐｔｏｌｉｔｅｒｓ，即１０。２１Ｌ）。在这么小的孔内，ＤＮＡ链周围游离的荧光标记ｄＮＴＰ有限，而且由于４种荧光标记ｄＮＴＰ非常快速进出于小孔，它们形成的是非常稳定的背景荧光信号。在每个小孔底部固定有一个ＤＮＡ聚合酶分子，当某一种荧光标记ｄＮＴＰ被掺入到ＤＮＡ合成链时，其携带的特定荧光会持续一小段时间（荧光光曝），直到荧光基团被ＤＮＡ聚合酶切除为止。荧光光曝的荧光颜色揭示了模板上的互补碱基，通过即时监控每个波导孔的荧光光曝，就能连续测定每一个孔内ＤＮＡ模板的序列，序列读取速度可达到每秒钟十个碱基，能在短短的几分钟内对长片段ＤＮＡ进行测序。从样本制备到测序完成，所需的时间还不到一天，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。

２．ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ单分子测序（ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ

ｓｉｎｇｌｅ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）：ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ单分子测序技术仍然基于合成测序

万方数据

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原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用ＰＣＲ扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。先将ＤＮＡ文库的单链片段密集固定排列在平面基板上形成阵列，在每个测序循环中，ＤＮＡ聚合酶和一种荧光标记ｄＮＴＰ流人，按照模板序列延伸ＤＮＡ链，阵列中发生了碱基延伸反应的ＤＮＡ链就会发出荧光，通过ＣＣＤ记录并转化为相应的碱基序列信息。经过洗涤，延伸了的ＤＮＡ链上的荧光物质被切除并被移走，便可以进行下一轮单个碱基的延伸、荧光标记的切除以及图像的获取。ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ利用精密的全内反射显微镜（ｔｏｔａｌ

ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）技术

降低荧光背景的同时，在测序结束后去掉延伸的合成链，将模板重置为最初的单链状态，从相反的方向再进行另一次测序，生成同一模板的第二个序列信息，重复的双向测序可以用于去除缺失错误，显著提高了原始数据准确度。利用ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ技术，Ｈａｒｒｉｓ等¨驯对Ｍ１３病毒全基因组分割而成的２８００００条ＤＮＡ链进行了同步测序和双向测序，并标记出所有的单碱基突变类型。ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ技术中每条合成链都是独立操作的，但亦面ｌ临着同聚核苷酸的误读问题，只能寄希望于通过动力学控制ＤＮＡ聚合酶活性，降低ＤＮＡ链延伸的速度。在ｄＮＴＰ被洗掉前减少两个连续碱基连接在链上的可能。

３．基于荧光共振能量转移的即时ＤＮＡ测序（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ

ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｒｅｓｏｎａｎｃｅ

ｅｎｅｒｇｙ

ｔｒａｎｓｆｅｒ）：

基于荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）的测序技术是在ＤＮＡ聚合酶上标记有荧光供体，在不同的ｄＮＴＰ上标记不同发射光谱的荧光受体，当掺人合成链时ｄＮＴＰ与ＤＮＡ聚合酶位置靠近而发生荧光共振能量转移，能量从聚合酶的荧光供体转移到ｄＮＴＰ的荧光受体，供体的荧光强度降低，受体的荧光强度升高，捕捉到的荧光信号被转化为相应的碱基序列信息¨“。此法被认为是ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ技术的改进，具有两大优势：首先，游离的ｄＮＴＰ不发光，只有其掺入到新合成的ＤＮＡＦＲＥＴ方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少ＤＮＡ聚合酶的光损伤作用，进一步延长了４．纳米孔单分子测序（ｎａｎｏｐｏｒｅ

ｓｉｎｇｌｅ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）：Ｓｔｏｄｄａｒｔ等¨２１在一个由生物分子（如Ｏｔ溶血素蛋白）组成的纳米孔内侧分别结合了一个核酸外切酶和一ｍｏｉｅｔｙ）分子，并将其置于一个类似细胞膜结构的脂质双分子层中。当ＤＮＡ模板进入纳米孔时，孔中的核酸外切酶会“抓住”ＤＮＡ分子，逐个剪切掉ＤＮＡ链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰；其次，因为用测序长度。

个环式糊精（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ分子的组成碱基，被切掉的单个碱基通过纳米孔时都会与环式糊精分子相互作用，产生一个特异性电流，根据这个电流就能推测出是哪一种碱基通过了纳米孔。每种碱基在通过纳米孔时引起的特异性电流均不同，很容易区分出不同的碱基信号并转化成ＤＮＡ序列信息。纳米孔测序的优势在于它不需要对ＤＮＡ进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和

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ＣＣＤ照相机。目前的甲基化研究都需利用重亚硫酸盐处理，将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，使其在后续分析中与甲基化胞嘧啶区分开来。纳米孔技术的另一优势就是能利用特异性电流的微小差异直接读出ＤＮＡ序列中的甲基化胞嘧啶，不再需要重亚硫酸盐转化，对表观基因组测序的研究人员来说意义非凡。新近，Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ等¨列利用耻垢分枝杆菌孔蛋白Ａ（Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ

ｓｍｅｇｍａｔｉｓｐｏｒｉｎ

Ａ）构建了一种纳米

孔，其特点是可以将单链ＤＮＡ的局部双链结构松解，使其顺利通过纳米孔，保证测序过程更加通畅。但是，纳米孔测序仪仍面临两个重要的技术问题：一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，确保每次只有一个碱基通过纳米孔，另一个是并行化问题，可能需要开发芯片来确保整个测序过程更快速。

５．离子流半导体测序（ｉｏｎ

ｔｏｒｒｅｎｔ

ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ

ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）：离子流半导体测序技术使用了一

种高密度半导体芯片，芯片上布满了小孔，这些小孔就是一个个的测序反应池，其内侧固定了一个ＤＮＡ聚合酶分子。小孔底部附有能感应ｐＨ变化的离子敏感层和离子感受器，当ＤＮＡ聚合酶在每一个ＤＮＡ模板链上滑动，合成链中每掺入一个核苷酸，离子敏感层和离子感受器就会检测到释放出的氢离子引起的ｐＨ值变化，并将其转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基，因此该技术被戏称为“测序的ｐＨ计”。与纳米孔技术一样，离子流半导体测序技术也同样不需要标记核苷酸和昂贵的光学探测设备。不久前问世的Ｉｏｎ

Ｔｏｒｒｅｎｔ

ＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅ

Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）测序仪只有微波炉大小，可

以在Ｉ～２ｈ内完成１００—２００个碱基的测序任务。

四、第三代测序技术的优势和应用前景

第二代测序仪刚刚问世几个年头，第三代测序技术就以高速测序、长序列产出和低成本方面的巨大潜力发起了挑战，让世人无不感慨生物技术发展之迅猛。首先，第三代测序技术实现了ＤＮＡ聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测１０个碱基，测序速度是第一代化学法测序的２万倍。其次，它实现了ＤＮＡ聚合酶内在自身的延续性，也就是ＤＮＡ聚合酶活性决定了一个反应就可以测几千个碱基的长序列，这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。再次，第三代测序技术的精度非常高（９９．９９９９％），又无需第二代测序必需的扩增过程，因此运行成本显著下降，实现千元基因组的目标已不再遥不可及。

在应用生物研究领域，第三代测序技术具有第二代测序所不具备的两个优势¨“。第一个是直接测ＲＮＡ序列。既然ＤＮＡ聚合酶能够即时观测，那么以ＲＮＡ为模板复制ＤＮＡ的逆转录酶也同样可以应用于第三代测序平台。ＲＮＡ的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的ＤＮＡ序列。除前面介绍的纳米孔技术通过电流振幅的差异识别甲基化胞嘧啶外，ＳＭＲＴ技术也可利用甲基化碱基特有的荧光信号来识别模板ＤＮＡ中的甲基化修饰，如Ｎ６・甲基腺苷、５．甲基胞嘧啶或５一羟甲基胞嘧啶¨“。

ＤＮＡ测序技术经过３０多年的发展，已经使生命研究的

万方数据

基本元素从单一、局部的基因或基因片段转变成整个基因组，同时这种转变又需要更加强大的测序技术来支持。虽然在未来的几年里可能会出现三代测序技术共存的局面，但低成本、高通量的第三代测序技术，将有力地推动基因组学及其分支乃至其他密切相关学科如比较基因组学、生物信息学、系统生物学以及合成生物学的创立与发展¨引。与此同时，继传统的望闻问切、影像学评价以及病理检验报告之后，基因组信息即将成为最海量却也是最微观的个人健康档案，其快速建立和科学解释为疾病易感性、治疗敏感性以及疾病预后推断，提供更加完整和精确的研究材料，是个体化医学赖以实现的技术基础。

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（收稿日期：２０１１－０３．１４）

（本文编辑：常秀青）

第三代测序技术：单分子即时测序

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

刘岩，吴秉铨

100191,北京大学医学部病理学系中华病理学杂志

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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhblx201110022.aspx