.654
中国抗生素杂志2010年9月第35卷第9期
文章编号:1001・8689(2010)09—0654-05
抗生素筛选方法
马寅姣I宋沁馨2,‘顾觉奋I
(1中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;2中国药科大学药学院,南京210009)
摘要:细菌耐药性发生率的升高,激励着人们去寻找更多的筛选抗生素的策略,进而发现了更多的抗生素作用机制。靶向策略、高通量筛选等方法已经被用于检测有潜力的抗生素。细菌的DNA复制、细胞分裂和蛋白合成的中间步骤已经成为了筛选的新靶点,双组分信号传递系统也成为了较为重要的药物新筛选靶点。微生物基因组学的发展,给新抗生素的发现带来了更大的希望,使人们可以发现更多的新作用靶点。
关键词:抗生素;抗生素筛选;基因组;靶向抗生素筛选中图分类号:R978.1
文献标识码:A
Methods
forthescreeningofantibiotics
MaYin-jia01.SongQin-xin2andGuJue-fenl
(1
SchoolofLifeScienceandTechnology',China
2
PharmaceuticalUniversity,Nanjing210009;
SchoolofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Na巧ing210009)
Abstract
Theincreasingincideneeofbacterialdrug.resistancehasstimulatedthedevelopmentofstrategies
forscreeningnewantibioticsmethodsandthusrevealedmanyunexploitedmechanismsabouttheactionofantibiotic.
screens
Target-directedstrategies.high.throughput
andothermethodswerebeingusedtodetectpotentialantibacterial
agents.BacterialDNAreplication.eelldivisionandsynthesisofproteinwerethetargetsofllewscreeningmethods;
two—componentsignalingsystemswerealsobeingtargeted.Thedevelopmentofgenomicshas
findingnewantibioticsandmore
broughtaprospectof
and
morenewactiontargetswillbediscovered.
Keywords
Antibiotic;Antibioticscreening;Genome;Target.directedantibioticscreening
目前,已经有许多结构各异、抗菌活性很好的抗生素被发现、发展及使用,但是这并非意味着人类已经在对抗细菌感染的战斗中取得了胜利。伴随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性日益严重。各类耐药菌,尤其是一些多重耐药菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)不断产生,引发严重的院内感染,危及患者的生命。筛选新抗生素是对抗耐药菌的有效途径之一,但在近30年里,仅有很少几类新抗生素[如嗯唑烷酮类的利奈
唑胺(1inezolid);脂肽类的达托霉素(daptomycin)【1】]被应用于抗多重耐药菌。因此,继续筛选抗菌活性好又具有应用前景的新的抗生素十分必要。
经典的抗生素筛选,被称为是抗生素产生菌与活性物质的双重筛选,其初筛样品为发酵液或粗提品,成分复杂,活性组分少,筛选过程耗时长,且效率较低。因此,急需建立一些抗生素筛选的新方法来更有效地筛选新抗生素。近年来已经出现了一些抗生素筛选新方法,如以细菌细胞分裂成为靶
收稿日期:2009.05.11
基金项目:江苏省基础研究计划(自然科学基金No.BK2008067):中央高校基本科研业务费专项资金青年项目t'No.JKQ2009027)
作者简介:马寅姣,女,/--I:-Y-1988匀z,在读硕士研究生。+通讯作者,E-mail:songqinxin@sina.tom
抗生素筛选方法马寅姣等
655
标,得到了很多非常有潜力的新活性物质。这些新的方法,随着微生物基因组信息的日渐丰富而变得明确可行。大量微生物全基因组DNA序列公布,产生了大量的基因组信息,对微生物的研究起了重大的影响f2】。本文对近年来出现的一些抗生素筛选方法进行简要综述。
l
乳动物有很微小的相似性,可以假定为抗生素干预的靶标。但是,很多公司针对这些靶位多年的药物筛选,并没有得到许多市场销路好的新抗生素。图l是大肠埃希菌细胞壁合成途径的示意图,步骤l和步骤2均发生在细胞质内,步骤2定位在细胞质膜的内壁,步骤3发生在细胞膜外,其他微生物细胞壁的合成基本与大肠埃希菌相似。值得注意的是,许多途径是受双或多基因控制的,例如革兰阳性细菌有两个murA(图1)基因,其中一个基因的删除对细胞壁合成的影响很小,所以寻找能够同时抑制多个同型基因的化合物非常重要。
表l是近年来发现的有效的抑制细菌细胞壁合成的抗生素。
以细菌细胞壁为靶标的抗生素筛选方法【,】青霉素作用机制的研究,也使得细菌细胞壁肽
聚糖的合成过程变得明确。细菌细胞壁的合成,作为较早途径的抗生素筛选靶标,已经从全细胞筛选到破细胞筛选、特异酶的体外筛选,发展到重组细胞壁合成途径基因的生化筛选。1.1细菌细胞壁合成途径
通过对细胞壁合成途径,基因和生理学的研究和发现,人们认识到该途径中的反应是非常重要的,而控制反应的目的基因大多是保守序列,与哺
1.2以细胞壁为靶点的全细胞抗生素筛选
20世纪60---90年代,Merck公司应用Lederberg等发现的原理:青霉素可以诱导细菌细胞原生质体在
,尿苷二磷酸_N.乙酰葡萄糖胺_N.乙酰葡萄糖胺烯醇式-N.乙酰胞壁酸
一L-丙氨酸-D.葡萄糖
-中问物胞壁酰三肽-D-丙氨酸
絮t聱
。r.\秽
一十一聚戊二烯磷酸
一法呢基焦磷酸一异戊二烯焦磷酸
’—秽刊掣酚啦彰卅
~影
圈
甬煳‰l
掣f
团转酶
^^^
—M
l
一嗣
^M
n^^
,糖链
卜
l(PBPs+]
l糖基转移l
l肽基转j
●交联肽臻
gBl
^M
^^
^~^一
E瞎^严
——v_一
图l大肠埃希菌细胞壁肽聚糖的合成的重要步骤【3】
Fig.1
TheessentialstepsofpeptidoglycansynthesisinE.coli
表1有效的细胞壁合成反应抑制剂
Tab.1
Validityantibacterialinhibitorsofcellwallreactions
等渗溶液中的形成,发明了原生质球筛选,并用此方法得到了一系列细胞壁合成抑制剂,女11MurA抑制剂磷霉素,Alr/Ddl抑制剂环丝氨酸,MraY抑制剂衣霉素(tunicamycin),肽基转移酶抑制剂,头霉素C,硫霉素(thienamycin),青霉素类,头孢菌素类和糖基转移酶默诺霉素(moenomycin)等。
意大利Lepetiff)T究中心则应用L.型筛选,来研究抑制野生型而不是L.型微生物的化合物,这个方法理论上可以得到细胞合成过程中各反应的抑制剂,现在已经得到了替考拉宁(脂肪糖肽类),Actagardine(硫醚抗生素)和雷莫拉宁(糖脂蛋白)。
靶标
murAair
酶抑制剂磷霉素
环丝氨酸,阿拉磷,O.氨甲酰基-D一丝氨酸,13.氯.丙氨酸,D.氟化丙氨酸
ddlA/BtaraY
环丝氨酸
衣霉素,杀绿霉素,那谱沙霉素,脂硫霉素,拇瑞霉素,胞质霉素,己尿啶霉素
肽基转移酶青霉素类,头孢菌素类,头霉素类,碳青霉烯类,单
环B.内酰胺类
糖基转移酶默诺霉素,大炭霉素,巴西诺霉素,马卡布霉素
.656
1.3可调型表达筛选
各种理论上的顺反子用来调节表达的反义RNA,可以在基因组范围内寻找细菌细胞壁合成的必须基因。葛莱素Glaxo(Collegeville等1和Elitra(Jolla等)已经将该方法应用于金黄色酿脓葡萄球菌,他们的论文中表示一个必须基因精确的减量调节,可以使该基因产物对其抑制剂敏感,可以用来筛选新的抑制剂。这两个研究组都发现了细胞壁合成的必须基因,这些基因将成为筛选的靶点,但是至今还没有新抑制剂的报道。布迈施BMS(Wilmington等)在靶基因上游插入一个严谨型调控的阿拉伯糖启动子,可以使细胞壁合成对抑制剂超敏化,如大肠埃希菌中的murA基因。5种murA的抑制物已经发现,这些抑制剂的抗菌活性表现在对murA的抑制。2以微生物细胞分裂为靶标的抗生素筛选方法
抑制细菌细胞增殖即抑制细菌的细胞分裂,这一过程有一系列蛋白和细胞因子调节和协调,包括一种Fts蛋白家族,FtsZ蛋白,参与细胞分裂的早期过程,并且可以被其他蛋I刍(SulA,MinD,MinC,
MinE和DicB)抑制。FtsZ蛋白的浓度可以调节细
胞分隔的频率,小幅度的浓度升高可以使得细胞结构发生微小变化,大幅度的浓度升高可以导致细胞丝化甚至菌体死亡。影响FtsZ蛋白作用机理或生成的化合物,将是很好的候选药物。FtsZ是一种重要的细菌鸟苷三磷酸酶,和哺乳动物的B.微管蛋白同源,可以聚合并装配成一种环状结构,这个结构可以起始细菌细胞的分裂。Haydon等【。】已经合成了一系列的FtsZ抑制剂,简写为PCI90723。这些抑制剂可以通过抑¥0FtsZ来抑制细菌细胞分裂。PC190723不仅在体外对葡萄球菌的杀菌力有效且有选择性,包括耐甲氧西林和多药耐药的金葡菌,而且对体内感染的模型也很有效,可以治疗感染了致死剂量金葡菌的小鼠,这使得FtsZ成为一个抗生素筛选的有效靶点。
3利用基因组寻找抗生素作用靶点【51
微生物基因组的发展给新抗生素的发现带来了希望,人们已经发现了几百个重要的微生物基因,和其他一些致病基因,这些基因都是很有潜力的药物作用靶点。但是直到现在,在微生物基因组的帮助下只发现了很少成功的候选药物【6】。
微生物基因组的揭示,为基于靶标的、有显著作用的抑制剂筛选提供了大量的、不同的并十分有效的作用靶标。在这个过程中,人们发现了一些新
中国抗生素杂志2010年9,9第35卷第9期
的靶标如双组分信号传导系统、辅酶代谢、细胞分裂、蛋白质分泌和新发现的DNA复制相关蛋白。但是迄今只有多肽去甲酰酶(polypeptidedeformylase,PDF)的抑制剂,进入了临床l期实验。
3.1
以微生物核糖体为靶标的抗生素筛选方法
核糖体是经典的抗生素作用靶标中较完美的一
个,已知抗生素中有超过半数是通过干扰微生物核糖体功能和抑制蛋白质合成来抑制细胞生长的。尽管有多种化学结果不同的抗生素可以影响核糖体大亚基的功能,但是这些药物都仅作用于几个已知的位点。Yassin等利用遗传学的方法来鉴定核糖体上决定其功能和结构的位点,这些位点可以作为药物作用的新靶标。他们利用随机突变rRNA基因的方法,绘制了一张rRNA位点图,这张图包括rRNA上一些突变后会损害核糖体功能的位点,和一些突变累积可以导致有害表型的多个位点。他们在23SrRNA上共绘制了77个有害突变的单个位点,并按其对表型的损害程度将这77个位点排列。其中许多位点与人们熟悉的核糖体功能位点相关,并已作为一些已知抗生素的作用靶标。但是一些突变位点存在于以前没有报道过的区域,突变位点在核糖体空间结构上的分布有很强的偏性,表现在影响较大的有害突变多出现在大亚基的分界面,而较温和的突变存在于溶剂面。已经发现5个有害突变位点可以作为有潜力的抗生素新作用靶标【6l。
3.2
以双组分系统为靶标的抗生素筛选方法
全局调节(例如多个分属不同代谢途径的操纵子
受控于同一调节物),特别是双组分细菌信号传导系统。双组分系统由两种名为传感器和调节器或换能器的蛋白组成,他们控制着细菌对外界环境刺激的反应,特别是来自宿主的刺激。传感器是一种跨膜蛋白,可以探测到细胞外的刺激,并产生类组氨酸蛋白激酶作用发生自身磷酸化,同时产生类磷酸转移酶作用而使调节器磷酸化。磷酸化的调节器可以结合到调节基因启动子上游的DNA识别单元,并使基因(如毒力基因)翻译发生。
许多细菌毒力基因被双组分调节系统控制,且在细菌中为高度保守型,和哺乳动物的调节系统有很大差别,铜绿假单胞菌中的双组分信号传导系统激活藻酸盐的细胞内表达,导致细菌外膜表多糖的合成,并在膀胱纤维化病变中起重要作用。探明双组分信号转导系统的机制,可为抑制剂的设计和寻找提供多个“靶标”,包括外界信号结合位点、蛋
抗生素筛选方法马寅姣等
白激酶的自身磷酸化位点,ATP结合的激酶功能区、磷酸基团从激酶向反应调节蛋白的转移过程、反应调节蛋白接受磷酸基团的位点等。经初步筛选人们得到了一些可能起作用的抑制剂,如水杨酰苯胺,卤苯异唑酮,三苯甲基等等。现正在检验这些化合物在生物体内的安全性、有效性、特异性等一系列指标,渴望不久的将来在抗微生物治疗领域能取得重大突破【71。
3.3
以氨酰tRNA合成酶为靶标的抗生素筛选方法【8】原核细胞的氨酰tRNA合成酶(ARSs)作为有潜
力的抗生素作用靶点,吸引着人们。ARSs是生物体中较普遍的一种酶,它可以催化氨基酸和tRNA的结合,继而参与蛋白质的翻译。据报道,许多氨基酸或氨酰腺苷酸类似物可以通过与活性位点的结合而抑制氨酰tRNA的形成,继而抑制ARSs的功能。其中莫匹罗星(mupirocin)系从萤光假单胞菌中发现的天然抗生素,可以选择性的抑制原核细胞的异亮氨酰tRNA合成酶,已经被广泛用于耐甲氧苯青霉素金葡菌的感染。其他类型的ARSs抑制剂,如甲硫氨酸tRNA合成酶,酪氨酰tRNA合成酶,苯丙氨酰tRNA合成酶,谷氨酰胺酰tRNA合成酶和天冬氨酰tRNA合成酶已经被列为抗感染的候选靶标。色氨酰tRNA合成酶(WRSl由于其结构在人类和原核细胞中有很大的差别,而成为重要的靶标,一种三.色氨酸结构类似物吲哚霉素,可以竞争性抑制细菌的wRS。
3.4
1)J,QseC为靶标的抗生素筛选方法
很多细菌性病原体,依赖于细胞膜上一种保守
的蛋白激酶QseC,以对宿主的肾上腺素能信号分子和细菌的信号作出反应,来提高毒力因子的表达。Rasko等【9】利用高通量筛选发现了一种小分子LED209可以抑制信号与QseC的结合,来抑制其自身磷酸化和抑制接下来的QseC介导的毒力因子基因的表达。LED209对细菌是无毒的,也并不抑制病原体的生长。但是这种化合物可以显著的抑制许多病原体在体内和体外的毒力。信号的抑制,为发展广谱的抗菌药物提供了新的策略。
4
基于竞争的抗生素筛选方法【10】
用来筛选新的抗生素的方法可以分为两大类方
法:生化法,及全细胞法。生化法利用分离并纯化的病原微生物蛋白来筛选抗生素,但这个方法要求比较高,需要知道药物的确切作用靶标,并很可能导致所筛选出的抗生素仅对靶标有效对病原微生物无效,例如许多化合物由于流出泵的存在不能透过
657.
细胞,或在细胞内不能持续存在,这样的化合物就无法作用于其作用靶标,不能成为新的抗生素。生化法的这一缺点可被全细胞法克服,在这个系统中,病原体的表型改变(如生长抑制)可被监测,并可用以筛选候选药物。
上述2种方法的共同缺点是筛选出的化合物可能对人体有害。因此,利用以上2种方法筛选出的化合物,通常还要进行第二轮的筛选,以除去一些安全性不高的化合物。
最近Lucia等建立了一种基于竞争的抗生素筛选方法,通过将病原微生物与人源细胞共同培养,用以筛选高效低毒的化合物。该方法的优点是筛选仅需一轮;并通过检测由人源细胞发出的信号(非微生物发出的信号),以监测化合物的作用效果,这意味着可以不需要对病原微生物进行基因修饰,简化繁琐的筛选步骤。理论上讲,这种方法可以不需要彻底了解检测的病原微生物,甚至不需要知道药物的作用靶点,即可筛选出需要的化合物。图2为这一筛选方法的简图。
图2中,左图为可在细胞表面展示HA标签及膜结合组织纤溶酶原活化因子(HA.tPA)的人源细胞,这种酶可将纤溶酶原(PG)转化为纤溶酶(PL),纤溶酶可将其底物(S)转化为一种荧光产物(P)。右图为人源细胞与细菌共同培养体系,在无有效抗生素存在下,细菌的生长抑制了人源细胞生长,则无荧光产生。若加入抗生素,则病原微生物数量减少人源细胞不断生长,产生较强的荧光信号。
5
以现有抗生素的衍生物为资源的抗生素筛选方;去【u】现在,大多数抗生素的化学骨架是在1930年中
期至1960年早期发现的,除1985年发现的碳青霉烯类,1960年至U2000年在临床上所应用的抗生素都是已有抗生素的衍生物。常用抗生素衍生物分别归属以下四类:碳青霉烯类、青霉素类、喹诺酮类及大环内酯类【12】。这说明,已有抗生素衍生物是新抗生素的重要资源库。通过人工修饰现有抗生素的骨
P
≯u
扬源指示细胞
细菌
人源指示细胞
淼子蔷螺
图2基于竞争的抗生素筛选方法110】
Fig.2
Acompetition-basedmetllodforthescreeningofantibiotics
.658.
中国抗生素杂志2010年9月第35卷第9期
架,并筛选新抗生素,是行之有效的一个方法,例如,对四环素骨架的改造得到了甘氨酰环素,这种新抗生素不再是细菌流出泵的底物,可以有效的抑制耐四环素类抗生素的病原微生物【13】。6结语
随着近年来耐药菌的增多和新的病原微生物的出现,传统低效率的抗生素筛选方法已经不能满足人们的需求,需要新的有效的筛选方法来替代传统的方法。基因组研究的深入,各种基因工程手段、分子细胞学方法的出现,为寻找大量新的抗生素筛选方法带来了可能。新的作用靶标、新的药物筛选方法,及各种病原微生物基因组的测序,为我们提供了许多抗生素筛选方法。但是,迄今为止这些方法仅得到了少数几个效果显著的化合物,且距临床应用还有一段距离,仍需更多的研究和发现。
参考文献
[1】
McDevittD,RosenbergM.Exploitinggenomicstodiscover
new
[5】5
ChanP
F'HolmesDJ,PayneDJ.Findingthegemsusing
drugdiscoverystrategies
Discovertoday
genomicdiscovery:antibacterial
-the
successes
and
the
challenges[J].Drug
砌%2004,1(4):519-527.
【6]
Yassin
A,MankinAA.Potentialnewantibioticsitesinthe
nl吣somerevealedbydeleteriousmutationsinRNAofthelarge
ribosomalsubuait[J].JBtol
Chem,2007。282(33):24329-24342.
[7】
秦智强,瞿涤.细菌双组分信号转导系统[J】.国外医学(微生物学分册),2003,26(05):16—17,37.
『818
WuYYuKQ,Xu
B,eta1.Potentandselectiveinhibitors
ofStaphylococcus
epidermidistryptophanyl—tRNA
Chemother,2007,60:502-509.
et
synthetase[j].JAntimicrob【9】9
RaskoD
A,MoreiraCG,LiDK
a1.Targeting
QseC
signalingandvirulenceforantibioticdevelopment[J].
Science,2008,321(5892):1078-1080.【10】Lucia
G,OliverJ
M,Andrew
DG,eta1.Acompetition-
basedassayforthescreeningofspecies-specific
antibiotics[J].JAntimicrob【ll】Michael
A
Chemother,2009,64:62-68.
antibiotics[J].TrendsMicrobiol,2001,9(12):611・617.
ofgenomics
F’ChristopherTw.Antibioticsforemerging
[2】PucciMJ.Use
Biochem
toselectantibacterialtargets[J].
pathogens[j].Science,2009,325(1089):1089-1093.【12】Newman
DJ,CraggG
over
Pharmacol,2006,7(1):1066-1072.
remain
a
M.Naturalproducts
assources
of
『31
SilverLL.Doesthecellwallofbacteria
source
viable
newdrugs461-477.
thelast25
years[j].JNatProd,2007,70(3):
oftargetsfornovelantibiotics[J】?Biochem
Pharmacol,2006,7(1):996—1005.【4】Haydon
DJ,Stokes
selective
【13】Gary
AN,RobertJ氏JeromeJS,eta1.National
trends
in
N心UreR.AninhibitorofFtsZwith
Staph>’lococcus
aul"日l,lSinfection
a
rotes:impact
oneconomic
potentand
anti-staphy7Iococcalactivity[J].Science,
burdenandmorUility
Clin
OVer
6-year
period(1998-2003)[J】.
2008,321(5896):1673-1675.
Infect
Dis,2007,45:l132—1140.
《中国抗生素杂志》2011年征订启事
【简介】《中国抗生素杂志》1976年创刊,是我国抗生素领域唯一的学术性核心期刊,中国科技论文统计源期刊。1997年第一批进入中国学术期刊光盘版,被美国生物学文摘(BA)、化学文摘(CA)、国际药学文摘(InternationalPharmaceuticalAbstracts,IPA)、荷兰ElsevierBibliographicDatabase、荷兰医学文摘数据库(EMBase)、NCBIMedline、万方数据库、中国科技统计源期刊(中国科技核心期刊)、中文核心期刊要目总览、中国生物学文摘、中国首席医学网和中文科技期刊数据库等收录收载。
【栏目】本刊设有论著:包含微生物药物筛选,遗传育种与生物合成,分离纯化与化学合成,分析质控与制剂,药理与临床等栏目,同时还设置了综述、研究简报等专栏。
【征订】《中国抗生素杂志》为月刊,每月25日出版,每期12.00元,全年144元,邮发代号62.193,欢迎广大读者积极到当地邮局订阅。
地址:成都市成华区龙潭都市工业集中发展区华冠路168号,中国抗生素杂志编辑部。邮编:610052,电话(传真):028.84216021,E.mail:siiacjap@126.corn。
抗生素筛选方法
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):
马寅姣, 宋沁馨, 顾觉奋, Ma Yin-jiao, Song Qin-xin, Gu Jue-fen
马寅姣,顾觉奋,Ma Yin-jiao,Gu Jue-fen(中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009), 宋沁馨,Song Qin-xin(中国药科大学药学院,南京,210009)中国抗生素杂志
CHINESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS2010,35(9)
参考文献(13条)
1. Pucci M J Use of genomics to select antibacterial targets 2006(01)
2. McDevitt D;Rosenberg M Exploiting genomics to discover new antibiotics[外文期刊] 2001(12)3. Silver L L Does the cell wall of bacteria remain a viable source of targets for novel antibiotics2006(01)
4. Gary A N;Robert J R;Jerome J S National trends in Staphylococcus aureus infection rates:impact oneconomic burden and mortálity over a 6-year period (1998-2003) 2007
5. Newman D J;Cragg G M Natural products as sources of new drugs over the last 25 years 2007(03)6. Michael A F;Christopher T W Antibiotics for emerging pathogens 2009(1089)
7. Lucia G;Oliver J M;Andrew D G A competitionbased assay for the screening of species-specificantibiotics 2009
8. Rasko D A;Moreira C G;Li D R Targeting QseC signaling and virulence for antibiotic development2008(5892)
9. Wu Y;Yu K Q;Xu B Potent and selective inhibitors of Staphylococcus epidermidis tryptophanyl-tRNAsynthetase 2007
10. 秦智强;瞿涤 细菌双组分信号转导系统[期刊论文]-国外医学(微生物学分册) 2003(05)
11. Yassin A;Mankin A A Potential new antibiotic sites in the ribosome revealed by deleteriousmutations in RNA of the large ribosomal subunit 2007(33)
12. Chan P F;Holmes D J;Payne D J Finding the gems using genomic discovery:antibacterial drugdiscovery strategies-the successes and the challenges 2004(04)
13. Haydon D J;Stokes N R;Ure R An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcalactivity 2008(5896)
本文读者也读过(1条)
1. 戈惠明. 谭仁祥 未来抗生素展望[期刊论文]-中国抗生素杂志2009,34(z1)
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgksszz201009003.aspx
.654
中国抗生素杂志2010年9月第35卷第9期
文章编号:1001・8689(2010)09—0654-05
抗生素筛选方法
马寅姣I宋沁馨2,‘顾觉奋I
(1中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;2中国药科大学药学院,南京210009)
摘要:细菌耐药性发生率的升高,激励着人们去寻找更多的筛选抗生素的策略,进而发现了更多的抗生素作用机制。靶向策略、高通量筛选等方法已经被用于检测有潜力的抗生素。细菌的DNA复制、细胞分裂和蛋白合成的中间步骤已经成为了筛选的新靶点,双组分信号传递系统也成为了较为重要的药物新筛选靶点。微生物基因组学的发展,给新抗生素的发现带来了更大的希望,使人们可以发现更多的新作用靶点。
关键词:抗生素;抗生素筛选;基因组;靶向抗生素筛选中图分类号:R978.1
文献标识码:A
Methods
forthescreeningofantibiotics
MaYin-jia01.SongQin-xin2andGuJue-fenl
(1
SchoolofLifeScienceandTechnology',China
2
PharmaceuticalUniversity,Nanjing210009;
SchoolofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Na巧ing210009)
Abstract
Theincreasingincideneeofbacterialdrug.resistancehasstimulatedthedevelopmentofstrategies
forscreeningnewantibioticsmethodsandthusrevealedmanyunexploitedmechanismsabouttheactionofantibiotic.
screens
Target-directedstrategies.high.throughput
andothermethodswerebeingusedtodetectpotentialantibacterial
agents.BacterialDNAreplication.eelldivisionandsynthesisofproteinwerethetargetsofllewscreeningmethods;
two—componentsignalingsystemswerealsobeingtargeted.Thedevelopmentofgenomicshas
findingnewantibioticsandmore
broughtaprospectof
and
morenewactiontargetswillbediscovered.
Keywords
Antibiotic;Antibioticscreening;Genome;Target.directedantibioticscreening
目前,已经有许多结构各异、抗菌活性很好的抗生素被发现、发展及使用,但是这并非意味着人类已经在对抗细菌感染的战斗中取得了胜利。伴随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性日益严重。各类耐药菌,尤其是一些多重耐药菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)不断产生,引发严重的院内感染,危及患者的生命。筛选新抗生素是对抗耐药菌的有效途径之一,但在近30年里,仅有很少几类新抗生素[如嗯唑烷酮类的利奈
唑胺(1inezolid);脂肽类的达托霉素(daptomycin)【1】]被应用于抗多重耐药菌。因此,继续筛选抗菌活性好又具有应用前景的新的抗生素十分必要。
经典的抗生素筛选,被称为是抗生素产生菌与活性物质的双重筛选,其初筛样品为发酵液或粗提品,成分复杂,活性组分少,筛选过程耗时长,且效率较低。因此,急需建立一些抗生素筛选的新方法来更有效地筛选新抗生素。近年来已经出现了一些抗生素筛选新方法,如以细菌细胞分裂成为靶
收稿日期:2009.05.11
基金项目:江苏省基础研究计划(自然科学基金No.BK2008067):中央高校基本科研业务费专项资金青年项目t'No.JKQ2009027)
作者简介:马寅姣,女,/--I:-Y-1988匀z,在读硕士研究生。+通讯作者,E-mail:songqinxin@sina.tom
抗生素筛选方法马寅姣等
655
标,得到了很多非常有潜力的新活性物质。这些新的方法,随着微生物基因组信息的日渐丰富而变得明确可行。大量微生物全基因组DNA序列公布,产生了大量的基因组信息,对微生物的研究起了重大的影响f2】。本文对近年来出现的一些抗生素筛选方法进行简要综述。
l
乳动物有很微小的相似性,可以假定为抗生素干预的靶标。但是,很多公司针对这些靶位多年的药物筛选,并没有得到许多市场销路好的新抗生素。图l是大肠埃希菌细胞壁合成途径的示意图,步骤l和步骤2均发生在细胞质内,步骤2定位在细胞质膜的内壁,步骤3发生在细胞膜外,其他微生物细胞壁的合成基本与大肠埃希菌相似。值得注意的是,许多途径是受双或多基因控制的,例如革兰阳性细菌有两个murA(图1)基因,其中一个基因的删除对细胞壁合成的影响很小,所以寻找能够同时抑制多个同型基因的化合物非常重要。
表l是近年来发现的有效的抑制细菌细胞壁合成的抗生素。
以细菌细胞壁为靶标的抗生素筛选方法【,】青霉素作用机制的研究,也使得细菌细胞壁肽
聚糖的合成过程变得明确。细菌细胞壁的合成,作为较早途径的抗生素筛选靶标,已经从全细胞筛选到破细胞筛选、特异酶的体外筛选,发展到重组细胞壁合成途径基因的生化筛选。1.1细菌细胞壁合成途径
通过对细胞壁合成途径,基因和生理学的研究和发现,人们认识到该途径中的反应是非常重要的,而控制反应的目的基因大多是保守序列,与哺
1.2以细胞壁为靶点的全细胞抗生素筛选
20世纪60---90年代,Merck公司应用Lederberg等发现的原理:青霉素可以诱导细菌细胞原生质体在
,尿苷二磷酸_N.乙酰葡萄糖胺_N.乙酰葡萄糖胺烯醇式-N.乙酰胞壁酸
一L-丙氨酸-D.葡萄糖
-中问物胞壁酰三肽-D-丙氨酸
絮t聱
。r.\秽
一十一聚戊二烯磷酸
一法呢基焦磷酸一异戊二烯焦磷酸
’—秽刊掣酚啦彰卅
~影
圈
甬煳‰l
掣f
团转酶
^^^
—M
l
一嗣
^M
n^^
,糖链
卜
l(PBPs+]
l糖基转移l
l肽基转j
●交联肽臻
gBl
^M
^^
^~^一
E瞎^严
——v_一
图l大肠埃希菌细胞壁肽聚糖的合成的重要步骤【3】
Fig.1
TheessentialstepsofpeptidoglycansynthesisinE.coli
表1有效的细胞壁合成反应抑制剂
Tab.1
Validityantibacterialinhibitorsofcellwallreactions
等渗溶液中的形成,发明了原生质球筛选,并用此方法得到了一系列细胞壁合成抑制剂,女11MurA抑制剂磷霉素,Alr/Ddl抑制剂环丝氨酸,MraY抑制剂衣霉素(tunicamycin),肽基转移酶抑制剂,头霉素C,硫霉素(thienamycin),青霉素类,头孢菌素类和糖基转移酶默诺霉素(moenomycin)等。
意大利Lepetiff)T究中心则应用L.型筛选,来研究抑制野生型而不是L.型微生物的化合物,这个方法理论上可以得到细胞合成过程中各反应的抑制剂,现在已经得到了替考拉宁(脂肪糖肽类),Actagardine(硫醚抗生素)和雷莫拉宁(糖脂蛋白)。
靶标
murAair
酶抑制剂磷霉素
环丝氨酸,阿拉磷,O.氨甲酰基-D一丝氨酸,13.氯.丙氨酸,D.氟化丙氨酸
ddlA/BtaraY
环丝氨酸
衣霉素,杀绿霉素,那谱沙霉素,脂硫霉素,拇瑞霉素,胞质霉素,己尿啶霉素
肽基转移酶青霉素类,头孢菌素类,头霉素类,碳青霉烯类,单
环B.内酰胺类
糖基转移酶默诺霉素,大炭霉素,巴西诺霉素,马卡布霉素
.656
1.3可调型表达筛选
各种理论上的顺反子用来调节表达的反义RNA,可以在基因组范围内寻找细菌细胞壁合成的必须基因。葛莱素Glaxo(Collegeville等1和Elitra(Jolla等)已经将该方法应用于金黄色酿脓葡萄球菌,他们的论文中表示一个必须基因精确的减量调节,可以使该基因产物对其抑制剂敏感,可以用来筛选新的抑制剂。这两个研究组都发现了细胞壁合成的必须基因,这些基因将成为筛选的靶点,但是至今还没有新抑制剂的报道。布迈施BMS(Wilmington等)在靶基因上游插入一个严谨型调控的阿拉伯糖启动子,可以使细胞壁合成对抑制剂超敏化,如大肠埃希菌中的murA基因。5种murA的抑制物已经发现,这些抑制剂的抗菌活性表现在对murA的抑制。2以微生物细胞分裂为靶标的抗生素筛选方法
抑制细菌细胞增殖即抑制细菌的细胞分裂,这一过程有一系列蛋白和细胞因子调节和协调,包括一种Fts蛋白家族,FtsZ蛋白,参与细胞分裂的早期过程,并且可以被其他蛋I刍(SulA,MinD,MinC,
MinE和DicB)抑制。FtsZ蛋白的浓度可以调节细
胞分隔的频率,小幅度的浓度升高可以使得细胞结构发生微小变化,大幅度的浓度升高可以导致细胞丝化甚至菌体死亡。影响FtsZ蛋白作用机理或生成的化合物,将是很好的候选药物。FtsZ是一种重要的细菌鸟苷三磷酸酶,和哺乳动物的B.微管蛋白同源,可以聚合并装配成一种环状结构,这个结构可以起始细菌细胞的分裂。Haydon等【。】已经合成了一系列的FtsZ抑制剂,简写为PCI90723。这些抑制剂可以通过抑¥0FtsZ来抑制细菌细胞分裂。PC190723不仅在体外对葡萄球菌的杀菌力有效且有选择性,包括耐甲氧西林和多药耐药的金葡菌,而且对体内感染的模型也很有效,可以治疗感染了致死剂量金葡菌的小鼠,这使得FtsZ成为一个抗生素筛选的有效靶点。
3利用基因组寻找抗生素作用靶点【51
微生物基因组的发展给新抗生素的发现带来了希望,人们已经发现了几百个重要的微生物基因,和其他一些致病基因,这些基因都是很有潜力的药物作用靶点。但是直到现在,在微生物基因组的帮助下只发现了很少成功的候选药物【6】。
微生物基因组的揭示,为基于靶标的、有显著作用的抑制剂筛选提供了大量的、不同的并十分有效的作用靶标。在这个过程中,人们发现了一些新
中国抗生素杂志2010年9,9第35卷第9期
的靶标如双组分信号传导系统、辅酶代谢、细胞分裂、蛋白质分泌和新发现的DNA复制相关蛋白。但是迄今只有多肽去甲酰酶(polypeptidedeformylase,PDF)的抑制剂,进入了临床l期实验。
3.1
以微生物核糖体为靶标的抗生素筛选方法
核糖体是经典的抗生素作用靶标中较完美的一
个,已知抗生素中有超过半数是通过干扰微生物核糖体功能和抑制蛋白质合成来抑制细胞生长的。尽管有多种化学结果不同的抗生素可以影响核糖体大亚基的功能,但是这些药物都仅作用于几个已知的位点。Yassin等利用遗传学的方法来鉴定核糖体上决定其功能和结构的位点,这些位点可以作为药物作用的新靶标。他们利用随机突变rRNA基因的方法,绘制了一张rRNA位点图,这张图包括rRNA上一些突变后会损害核糖体功能的位点,和一些突变累积可以导致有害表型的多个位点。他们在23SrRNA上共绘制了77个有害突变的单个位点,并按其对表型的损害程度将这77个位点排列。其中许多位点与人们熟悉的核糖体功能位点相关,并已作为一些已知抗生素的作用靶标。但是一些突变位点存在于以前没有报道过的区域,突变位点在核糖体空间结构上的分布有很强的偏性,表现在影响较大的有害突变多出现在大亚基的分界面,而较温和的突变存在于溶剂面。已经发现5个有害突变位点可以作为有潜力的抗生素新作用靶标【6l。
3.2
以双组分系统为靶标的抗生素筛选方法
全局调节(例如多个分属不同代谢途径的操纵子
受控于同一调节物),特别是双组分细菌信号传导系统。双组分系统由两种名为传感器和调节器或换能器的蛋白组成,他们控制着细菌对外界环境刺激的反应,特别是来自宿主的刺激。传感器是一种跨膜蛋白,可以探测到细胞外的刺激,并产生类组氨酸蛋白激酶作用发生自身磷酸化,同时产生类磷酸转移酶作用而使调节器磷酸化。磷酸化的调节器可以结合到调节基因启动子上游的DNA识别单元,并使基因(如毒力基因)翻译发生。
许多细菌毒力基因被双组分调节系统控制,且在细菌中为高度保守型,和哺乳动物的调节系统有很大差别,铜绿假单胞菌中的双组分信号传导系统激活藻酸盐的细胞内表达,导致细菌外膜表多糖的合成,并在膀胱纤维化病变中起重要作用。探明双组分信号转导系统的机制,可为抑制剂的设计和寻找提供多个“靶标”,包括外界信号结合位点、蛋
抗生素筛选方法马寅姣等
白激酶的自身磷酸化位点,ATP结合的激酶功能区、磷酸基团从激酶向反应调节蛋白的转移过程、反应调节蛋白接受磷酸基团的位点等。经初步筛选人们得到了一些可能起作用的抑制剂,如水杨酰苯胺,卤苯异唑酮,三苯甲基等等。现正在检验这些化合物在生物体内的安全性、有效性、特异性等一系列指标,渴望不久的将来在抗微生物治疗领域能取得重大突破【71。
3.3
以氨酰tRNA合成酶为靶标的抗生素筛选方法【8】原核细胞的氨酰tRNA合成酶(ARSs)作为有潜
力的抗生素作用靶点,吸引着人们。ARSs是生物体中较普遍的一种酶,它可以催化氨基酸和tRNA的结合,继而参与蛋白质的翻译。据报道,许多氨基酸或氨酰腺苷酸类似物可以通过与活性位点的结合而抑制氨酰tRNA的形成,继而抑制ARSs的功能。其中莫匹罗星(mupirocin)系从萤光假单胞菌中发现的天然抗生素,可以选择性的抑制原核细胞的异亮氨酰tRNA合成酶,已经被广泛用于耐甲氧苯青霉素金葡菌的感染。其他类型的ARSs抑制剂,如甲硫氨酸tRNA合成酶,酪氨酰tRNA合成酶,苯丙氨酰tRNA合成酶,谷氨酰胺酰tRNA合成酶和天冬氨酰tRNA合成酶已经被列为抗感染的候选靶标。色氨酰tRNA合成酶(WRSl由于其结构在人类和原核细胞中有很大的差别,而成为重要的靶标,一种三.色氨酸结构类似物吲哚霉素,可以竞争性抑制细菌的wRS。
3.4
1)J,QseC为靶标的抗生素筛选方法
很多细菌性病原体,依赖于细胞膜上一种保守
的蛋白激酶QseC,以对宿主的肾上腺素能信号分子和细菌的信号作出反应,来提高毒力因子的表达。Rasko等【9】利用高通量筛选发现了一种小分子LED209可以抑制信号与QseC的结合,来抑制其自身磷酸化和抑制接下来的QseC介导的毒力因子基因的表达。LED209对细菌是无毒的,也并不抑制病原体的生长。但是这种化合物可以显著的抑制许多病原体在体内和体外的毒力。信号的抑制,为发展广谱的抗菌药物提供了新的策略。
4
基于竞争的抗生素筛选方法【10】
用来筛选新的抗生素的方法可以分为两大类方
法:生化法,及全细胞法。生化法利用分离并纯化的病原微生物蛋白来筛选抗生素,但这个方法要求比较高,需要知道药物的确切作用靶标,并很可能导致所筛选出的抗生素仅对靶标有效对病原微生物无效,例如许多化合物由于流出泵的存在不能透过
657.
细胞,或在细胞内不能持续存在,这样的化合物就无法作用于其作用靶标,不能成为新的抗生素。生化法的这一缺点可被全细胞法克服,在这个系统中,病原体的表型改变(如生长抑制)可被监测,并可用以筛选候选药物。
上述2种方法的共同缺点是筛选出的化合物可能对人体有害。因此,利用以上2种方法筛选出的化合物,通常还要进行第二轮的筛选,以除去一些安全性不高的化合物。
最近Lucia等建立了一种基于竞争的抗生素筛选方法,通过将病原微生物与人源细胞共同培养,用以筛选高效低毒的化合物。该方法的优点是筛选仅需一轮;并通过检测由人源细胞发出的信号(非微生物发出的信号),以监测化合物的作用效果,这意味着可以不需要对病原微生物进行基因修饰,简化繁琐的筛选步骤。理论上讲,这种方法可以不需要彻底了解检测的病原微生物,甚至不需要知道药物的作用靶点,即可筛选出需要的化合物。图2为这一筛选方法的简图。
图2中,左图为可在细胞表面展示HA标签及膜结合组织纤溶酶原活化因子(HA.tPA)的人源细胞,这种酶可将纤溶酶原(PG)转化为纤溶酶(PL),纤溶酶可将其底物(S)转化为一种荧光产物(P)。右图为人源细胞与细菌共同培养体系,在无有效抗生素存在下,细菌的生长抑制了人源细胞生长,则无荧光产生。若加入抗生素,则病原微生物数量减少人源细胞不断生长,产生较强的荧光信号。
5
以现有抗生素的衍生物为资源的抗生素筛选方;去【u】现在,大多数抗生素的化学骨架是在1930年中
期至1960年早期发现的,除1985年发现的碳青霉烯类,1960年至U2000年在临床上所应用的抗生素都是已有抗生素的衍生物。常用抗生素衍生物分别归属以下四类:碳青霉烯类、青霉素类、喹诺酮类及大环内酯类【12】。这说明,已有抗生素衍生物是新抗生素的重要资源库。通过人工修饰现有抗生素的骨
P
≯u
扬源指示细胞
细菌
人源指示细胞
淼子蔷螺
图2基于竞争的抗生素筛选方法110】
Fig.2
Acompetition-basedmetllodforthescreeningofantibiotics
.658.
中国抗生素杂志2010年9月第35卷第9期
架,并筛选新抗生素,是行之有效的一个方法,例如,对四环素骨架的改造得到了甘氨酰环素,这种新抗生素不再是细菌流出泵的底物,可以有效的抑制耐四环素类抗生素的病原微生物【13】。6结语
随着近年来耐药菌的增多和新的病原微生物的出现,传统低效率的抗生素筛选方法已经不能满足人们的需求,需要新的有效的筛选方法来替代传统的方法。基因组研究的深入,各种基因工程手段、分子细胞学方法的出现,为寻找大量新的抗生素筛选方法带来了可能。新的作用靶标、新的药物筛选方法,及各种病原微生物基因组的测序,为我们提供了许多抗生素筛选方法。但是,迄今为止这些方法仅得到了少数几个效果显著的化合物,且距临床应用还有一段距离,仍需更多的研究和发现。
参考文献
[1】
McDevittD,RosenbergM.Exploitinggenomicstodiscover
new
[5】5
ChanP
F'HolmesDJ,PayneDJ.Findingthegemsusing
drugdiscoverystrategies
Discovertoday
genomicdiscovery:antibacterial
-the
successes
and
the
challenges[J].Drug
砌%2004,1(4):519-527.
【6]
Yassin
A,MankinAA.Potentialnewantibioticsitesinthe
nl吣somerevealedbydeleteriousmutationsinRNAofthelarge
ribosomalsubuait[J].JBtol
Chem,2007。282(33):24329-24342.
[7】
秦智强,瞿涤.细菌双组分信号转导系统[J】.国外医学(微生物学分册),2003,26(05):16—17,37.
『818
WuYYuKQ,Xu
B,eta1.Potentandselectiveinhibitors
ofStaphylococcus
epidermidistryptophanyl—tRNA
Chemother,2007,60:502-509.
et
synthetase[j].JAntimicrob【9】9
RaskoD
A,MoreiraCG,LiDK
a1.Targeting
QseC
signalingandvirulenceforantibioticdevelopment[J].
Science,2008,321(5892):1078-1080.【10】Lucia
G,OliverJ
M,Andrew
DG,eta1.Acompetition-
basedassayforthescreeningofspecies-specific
antibiotics[J].JAntimicrob【ll】Michael
A
Chemother,2009,64:62-68.
antibiotics[J].TrendsMicrobiol,2001,9(12):611・617.
ofgenomics
F’ChristopherTw.Antibioticsforemerging
[2】PucciMJ.Use
Biochem
toselectantibacterialtargets[J].
pathogens[j].Science,2009,325(1089):1089-1093.【12】Newman
DJ,CraggG
over
Pharmacol,2006,7(1):1066-1072.
remain
a
M.Naturalproducts
assources
of
『31
SilverLL.Doesthecellwallofbacteria
source
viable
newdrugs461-477.
thelast25
years[j].JNatProd,2007,70(3):
oftargetsfornovelantibiotics[J】?Biochem
Pharmacol,2006,7(1):996—1005.【4】Haydon
DJ,Stokes
selective
【13】Gary
AN,RobertJ氏JeromeJS,eta1.National
trends
in
N心UreR.AninhibitorofFtsZwith
Staph>’lococcus
aul"日l,lSinfection
a
rotes:impact
oneconomic
potentand
anti-staphy7Iococcalactivity[J].Science,
burdenandmorUility
Clin
OVer
6-year
period(1998-2003)[J】.
2008,321(5896):1673-1675.
Infect
Dis,2007,45:l132—1140.
《中国抗生素杂志》2011年征订启事
【简介】《中国抗生素杂志》1976年创刊,是我国抗生素领域唯一的学术性核心期刊,中国科技论文统计源期刊。1997年第一批进入中国学术期刊光盘版,被美国生物学文摘(BA)、化学文摘(CA)、国际药学文摘(InternationalPharmaceuticalAbstracts,IPA)、荷兰ElsevierBibliographicDatabase、荷兰医学文摘数据库(EMBase)、NCBIMedline、万方数据库、中国科技统计源期刊(中国科技核心期刊)、中文核心期刊要目总览、中国生物学文摘、中国首席医学网和中文科技期刊数据库等收录收载。
【栏目】本刊设有论著:包含微生物药物筛选,遗传育种与生物合成,分离纯化与化学合成,分析质控与制剂,药理与临床等栏目,同时还设置了综述、研究简报等专栏。
【征订】《中国抗生素杂志》为月刊,每月25日出版,每期12.00元,全年144元,邮发代号62.193,欢迎广大读者积极到当地邮局订阅。
地址:成都市成华区龙潭都市工业集中发展区华冠路168号,中国抗生素杂志编辑部。邮编:610052,电话(传真):028.84216021,E.mail:siiacjap@126.corn。
抗生素筛选方法
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):
马寅姣, 宋沁馨, 顾觉奋, Ma Yin-jiao, Song Qin-xin, Gu Jue-fen
马寅姣,顾觉奋,Ma Yin-jiao,Gu Jue-fen(中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009), 宋沁馨,Song Qin-xin(中国药科大学药学院,南京,210009)中国抗生素杂志
CHINESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS2010,35(9)
参考文献(13条)
1. Pucci M J Use of genomics to select antibacterial targets 2006(01)
2. McDevitt D;Rosenberg M Exploiting genomics to discover new antibiotics[外文期刊] 2001(12)3. Silver L L Does the cell wall of bacteria remain a viable source of targets for novel antibiotics2006(01)
4. Gary A N;Robert J R;Jerome J S National trends in Staphylococcus aureus infection rates:impact oneconomic burden and mortálity over a 6-year period (1998-2003) 2007
5. Newman D J;Cragg G M Natural products as sources of new drugs over the last 25 years 2007(03)6. Michael A F;Christopher T W Antibiotics for emerging pathogens 2009(1089)
7. Lucia G;Oliver J M;Andrew D G A competitionbased assay for the screening of species-specificantibiotics 2009
8. Rasko D A;Moreira C G;Li D R Targeting QseC signaling and virulence for antibiotic development2008(5892)
9. Wu Y;Yu K Q;Xu B Potent and selective inhibitors of Staphylococcus epidermidis tryptophanyl-tRNAsynthetase 2007
10. 秦智强;瞿涤 细菌双组分信号转导系统[期刊论文]-国外医学(微生物学分册) 2003(05)
11. Yassin A;Mankin A A Potential new antibiotic sites in the ribosome revealed by deleteriousmutations in RNA of the large ribosomal subunit 2007(33)
12. Chan P F;Holmes D J;Payne D J Finding the gems using genomic discovery:antibacterial drugdiscovery strategies-the successes and the challenges 2004(04)
13. Haydon D J;Stokes N R;Ure R An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcalactivity 2008(5896)
本文读者也读过(1条)
1. 戈惠明. 谭仁祥 未来抗生素展望[期刊论文]-中国抗生素杂志2009,34(z1)
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgksszz201009003.aspx