肠肝菌科产碳青霉烯酶类细菌的表型研究
李林峰
肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等是医院感染的主要条件致病菌，而碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌感染特别是肠杆菌科细菌最强效的β－内酰胺类药物［１］，目前产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌已在很多国家出现和被报道，产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行，使临床抗感染治疗面临严峻挑战。 微生物学实验室，需要快速的检测方法检测产碳青霉烯酶菌株，及时检测并报告给临床医生，为合理使用抗生素、控制医院感染和流行病学提供实验室依据。
肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的耐药机制：研究［2］表示耐药机制有四大类：1.AMPC酶的过度表达联合OMP丢失；2.PBP对碳青霉烯类亲和力的改变；3.药物靶位改变；4.碳青霉烯酶的产生；在这些机制中最突出的是产碳青霉烯酶。碳青霉烯酶表型又分为：A、B、D三种。A.D两类相似都是丝氨酸酶，而B类则是金属酶。ＫＰＣ酶、ＩＭＩ酶、ＳＭＥ酶、ＮＭＣ－Ａ酶等属于Ａ类碳青霉烯酶，以 ＫＰＣ酶最常，能水解几乎所有β－内酰胺类抗生素和氨曲南，可被克拉维酸和他唑巴坦抑制，不能被乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）抑制；常见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等。Ｂ类碳青霉烯酶包括ＩＭＰ酶、ＶＩＭ 酶、ＧＩＭ 酶、ＳＰＭ 酶、ＮＤＭ－１酶、ＳＩＭ 酶等，能水解所有β－内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类，不能水解氨曲南，能被ＥＤＴＡ抑制，同时不被克拉维酸和他唑巴坦抑制，
主要存在于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等。Ｄ类碳青霉烯酶包括ＯＸＡ－４８酶，能水解青霉素、碳青霉烯类、窄谱头孢菌素，不能水解氨曲南、广谱头孢菌素，可受克拉维酸和ＥＤＴＡ的轻度抑制，主要存在于奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等。
一.检测方法：
1.KB法表型初步筛选试验：将碳青霉烯类抗生素敏感性降低的菌株，采用Ｋ－Ｂ纸片扩散法，挑一定量的细菌配成浊度为０．５麦氏单位的菌液，均匀涂布于ＭＨ 琼脂平板上，室温干燥３～５ｍｉｎ。贴亚胺培南、美罗培南和厄他培南三种纸片，各纸片中心大于２４ｍｍ，纸片距离平板边缘应大于１５ｍｍ。置３５℃孵育１６～１８ｈ后读取结果，判断标准参照临床实验室标准化协会（ＣＬＳＩ）２０１０年标准。阳性结果表示该菌株对碳青霉烯类抗生素不敏感，可能产生碳青霉烯酶。
2.MHT（改良HODGE试验）表型筛选试验：使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２菌悬液浊度调至０．５麦氏单位，并进行１∶１０稀释，将菌液接种在ＭＨ琼脂平板上，干燥３～１０ｍｉｎ，在平板中心贴１０μｇ厄他培南纸片，用１０μＬ接种环挑取３～５个待测分离菌株从纸片的边缘画线到平板的边缘，过夜培养，若出现苜蓿叶状抑菌环则为碳青霉烯酶表型阳性，改良HODGE阳性即产碳青霉烯酶。（当然不排除假阳性的存在：产ESBL或AmpC酶合并孔蛋白缺失 ）
3.双纸片协同试验（金属酶的筛选）：过夜培养待测菌落用无菌生理盐水调至０．５麦氏浊度的悬液，菌液均匀涂布于ＭＨ 琼脂平皿上。将美罗培南和亚胺培南纸片置于琼脂平皿表面，距其１ ｃｍ 处贴ＥＤＴＡ（含有０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ１０μＬ）纸片。３５ ℃孵育１６～１８ ｈ。美罗培南和亚胺培南抑菌圈在靠近ＥＤＴＡ纸片侧明显扩大者，判断为产金属酶。
4. 碳青霉烯酶基因型ＰＣＲ检测：PCR检测是碳青霉烯酶表型鉴定的金标准。
临床治疗：目前临床有关产碳青霉烯酶菌株引起感染的治疗数据不多，临床可供选择的有效抗菌药物也非常有限。而经验性用药实际上取决于监测室内细菌感染的流行病学调查，病原菌的种类及其对抗菌药物敏感性的监测，以及临床医师对患者感染的判断，并且不同地区、不同医院、不同病室细菌的流行情况不同，耐药谱也存在一定差异。因此，掌握耐药性的变化及其耐药性监测资料，制订临床抗感染方案，合理使用抗菌药物，对降低细菌耐药性和提高药物疗效有着重要的意义。
综上所述：近年来相继发现了对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌，肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶是其对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制，ＣＬＳＩ推荐用改良Ｈｏｄｇｅ试验（ＭＨＴ）来检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶［3］。该方法操作简便，敏感性高，能同时检测ＫＰＣ型碳青霉烯酶菌株对各种抗生素的敏感性，并能根据ＣＬＳＩ新标准判读结果，适合一般实验室用于肠杆菌科细菌中碳青
霉烯酶的常规筛查；双纸片协同法将Ｂ类金属酶不同于ＫＰＣ型等Ａ 类碳青霉烯酶区分开来，此原理检测金属β内酰胺酶表型简单、有效的方法；ＰＣＲ作为检测碳青霉烯酶基因的金标准，是研究碳青霉烯酶表型的方向。
参考文献：
［１］ 叶素娟，杨青，俞云松．２００５年中国ＣＨＩＮＥＴ大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性分析［Ｊ］．中国感染与化疗杂志，２００７，７（４）：２８３－２８６。 ［2］肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的耐药机制及临床治疗进展（李渊婷，金凤玲） ［3］改良Ｈｏｄｇｅ试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的诊断价值的系统评价（张成宪，金凤玲）
肠肝菌科产碳青霉烯酶类细菌的表型研究
李林峰
肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等是医院感染的主要条件致病菌，而碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌感染特别是肠杆菌科细菌最强效的β－内酰胺类药物［１］，目前产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌已在很多国家出现和被报道，产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行，使临床抗感染治疗面临严峻挑战。 微生物学实验室，需要快速的检测方法检测产碳青霉烯酶菌株，及时检测并报告给临床医生，为合理使用抗生素、控制医院感染和流行病学提供实验室依据。
肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的耐药机制：研究［2］表示耐药机制有四大类：1.AMPC酶的过度表达联合OMP丢失；2.PBP对碳青霉烯类亲和力的改变；3.药物靶位改变；4.碳青霉烯酶的产生；在这些机制中最突出的是产碳青霉烯酶。碳青霉烯酶表型又分为：A、B、D三种。A.D两类相似都是丝氨酸酶，而B类则是金属酶。ＫＰＣ酶、ＩＭＩ酶、ＳＭＥ酶、ＮＭＣ－Ａ酶等属于Ａ类碳青霉烯酶，以 ＫＰＣ酶最常，能水解几乎所有β－内酰胺类抗生素和氨曲南，可被克拉维酸和他唑巴坦抑制，不能被乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）抑制；常见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等。Ｂ类碳青霉烯酶包括ＩＭＰ酶、ＶＩＭ 酶、ＧＩＭ 酶、ＳＰＭ 酶、ＮＤＭ－１酶、ＳＩＭ 酶等，能水解所有β－内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类，不能水解氨曲南，能被ＥＤＴＡ抑制，同时不被克拉维酸和他唑巴坦抑制，
主要存在于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等。Ｄ类碳青霉烯酶包括ＯＸＡ－４８酶，能水解青霉素、碳青霉烯类、窄谱头孢菌素，不能水解氨曲南、广谱头孢菌素，可受克拉维酸和ＥＤＴＡ的轻度抑制，主要存在于奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等。
一.检测方法：
1.KB法表型初步筛选试验：将碳青霉烯类抗生素敏感性降低的菌株，采用Ｋ－Ｂ纸片扩散法，挑一定量的细菌配成浊度为０．５麦氏单位的菌液，均匀涂布于ＭＨ 琼脂平板上，室温干燥３～５ｍｉｎ。贴亚胺培南、美罗培南和厄他培南三种纸片，各纸片中心大于２４ｍｍ，纸片距离平板边缘应大于１５ｍｍ。置３５℃孵育１６～１８ｈ后读取结果，判断标准参照临床实验室标准化协会（ＣＬＳＩ）２０１０年标准。阳性结果表示该菌株对碳青霉烯类抗生素不敏感，可能产生碳青霉烯酶。
2.MHT（改良HODGE试验）表型筛选试验：使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２菌悬液浊度调至０．５麦氏单位，并进行１∶１０稀释，将菌液接种在ＭＨ琼脂平板上，干燥３～１０ｍｉｎ，在平板中心贴１０μｇ厄他培南纸片，用１０μＬ接种环挑取３～５个待测分离菌株从纸片的边缘画线到平板的边缘，过夜培养，若出现苜蓿叶状抑菌环则为碳青霉烯酶表型阳性，改良HODGE阳性即产碳青霉烯酶。（当然不排除假阳性的存在：产ESBL或AmpC酶合并孔蛋白缺失 ）
3.双纸片协同试验（金属酶的筛选）：过夜培养待测菌落用无菌生理盐水调至０．５麦氏浊度的悬液，菌液均匀涂布于ＭＨ 琼脂平皿上。将美罗培南和亚胺培南纸片置于琼脂平皿表面，距其１ ｃｍ 处贴ＥＤＴＡ（含有０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ１０μＬ）纸片。３５ ℃孵育１６～１８ ｈ。美罗培南和亚胺培南抑菌圈在靠近ＥＤＴＡ纸片侧明显扩大者，判断为产金属酶。
4. 碳青霉烯酶基因型ＰＣＲ检测：PCR检测是碳青霉烯酶表型鉴定的金标准。
临床治疗：目前临床有关产碳青霉烯酶菌株引起感染的治疗数据不多，临床可供选择的有效抗菌药物也非常有限。而经验性用药实际上取决于监测室内细菌感染的流行病学调查，病原菌的种类及其对抗菌药物敏感性的监测，以及临床医师对患者感染的判断，并且不同地区、不同医院、不同病室细菌的流行情况不同，耐药谱也存在一定差异。因此，掌握耐药性的变化及其耐药性监测资料，制订临床抗感染方案，合理使用抗菌药物，对降低细菌耐药性和提高药物疗效有着重要的意义。
综上所述：近年来相继发现了对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌，肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶是其对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制，ＣＬＳＩ推荐用改良Ｈｏｄｇｅ试验（ＭＨＴ）来检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶［3］。该方法操作简便，敏感性高，能同时检测ＫＰＣ型碳青霉烯酶菌株对各种抗生素的敏感性，并能根据ＣＬＳＩ新标准判读结果，适合一般实验室用于肠杆菌科细菌中碳青
霉烯酶的常规筛查；双纸片协同法将Ｂ类金属酶不同于ＫＰＣ型等Ａ 类碳青霉烯酶区分开来，此原理检测金属β内酰胺酶表型简单、有效的方法；ＰＣＲ作为检测碳青霉烯酶基因的金标准，是研究碳青霉烯酶表型的方向。
参考文献：
［１］ 叶素娟，杨青，俞云松．２００５年中国ＣＨＩＮＥＴ大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性分析［Ｊ］．中国感染与化疗杂志，２００７，７（４）：２８３－２８６。 ［2］肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的耐药机制及临床治疗进展（李渊婷，金凤玲） ［3］改良Ｈｏｄｇｅ试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的诊断价值的系统评价（张成宪，金凤玲）