生物工程学报 Chin J Biotech 2008, September 25; 24(9): 1545-1549 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 [email protected] 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved
KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化
刘春平, 张洋, 李元
中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所, 卫生部抗生素生物工程重点实验室, 北京 100050
摘 要: VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分裂原, 通过与内皮细胞表面特定受体结合, 从而导致新生血管的形成, 其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用, 因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)。采用RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA, 获得KDR-CD的编码基因, 将其克隆至pET-30a载体, 在E. coli BL21(DE3)中进行了成功表达, 采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化, Western blotting结果显示表达的KDR-CD蛋白自身磷酸化, 重组KDR-CD蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。
关键词: 血管生成, KDR酪氨酸激酶, 大肠杆菌, 酪氨酸激酶活性
Cloning, Expression and Purification of KDR Tyrosine Kinase
Chunping Liu, Yang Zhang, and Yuan Li
Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Ministry of Health, Institute of Medicinal Biotechnology; Chinese Academy of Medical Science and Perking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: The catalytic domain of KDR kinase (KDR-CD) was amplified from RNA of HUVCEs cells with RT-PCR and expressed
in E. coli BL21(DE3) by plasmid pET30a as vector. The recombinant protein was purified with affinity chromatography (Ni-NTA). Western blotting showed that the recombinant KDR-CD was phosphorylated in E. coli BL21(DE3). The recombinant KDR-CD was identified to have kinase activity catalyzing the substrate phosphorylated with ATP in the enzymatic reaction. Keywords: angiogenesis, KDR tyrosine kinase, E. coli, kinase activity.
血管生成(Angiogenesis)是毛细血管从已构建的毛细血管网中以出芽方式新生的过程, 参与许多生理和病理过程如胚胎发育、伤口愈合、糖尿病、关节炎、慢性炎症和肿瘤的发生及转移[1]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原, 直接参与血管形成, 促进内皮细胞分裂增殖, 促使新生血管形成, 同时还能有效提高血管的通透性[2−5]。VEGF是
通过和其特异性受体结合发挥作用的, 其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在调节内皮细胞增殖、分化反应中最为重要, 是内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者。KDR主要在内皮细胞表达, 由胞外7个Ig样结构域, 一个跨膜域和胞内域组成[6]。VEGF与KDR结合后受体二聚体化, 进一步激发KDR酪氨酸发生磷酸化, 导致自身酶活性和下游信号相关酶的激活, 从而调节血管内皮细胞相关反应[6−8]。新生
Received: January 14, 2008; Accepted: March 27, 2008
Supported by: the Chinese National 863 High Technology Program (No. 2004AA2Z3784). Corresponding author: Yuan Li. Tel: +86-10-63153320; E-mail: [email protected] 国家高科技研究与发展计划项目(No. 2004AA2Z3784)资助。
1546 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech September 25, 2008 Vol.24 No.9
血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素, 因此以KDR为靶位进行药物设计和筛选已成为肿瘤治疗的有效途径之一。
本研究将具酪氨酸激酶活性的人源KDR酪氨酸激酶催化域 (KDR-CD)在E. coli BL21(DE3)中成功进行了表达, 采用Ni-NTA亲和层析对蛋白进行了纯化, 并对KDR-CD蛋白的酪氨酸激酶活性进行了研究, 为进一步以其为靶点进行酶抑制剂筛选, 获得抗肿瘤新药奠定了一定基础。
1.2.2 重组菌的诱导表达
将重组菌E. coli BL21[pET-30a/KDR-CD]接种至5 mL含卡那霉素(25 g/mL)的LB培养基, 37oC培养过夜, 按1%的接种量转种至含卡那霉素(25 g/mL)的LB培养基, 37oC培养至OD600 为0.6~0.8, 以不同浓度IPTG (0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.6和0.8 mmol/L)和不同时间(1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和8 h) 对重组菌E. coli BL21[pET-30a/KDR-CD]进行了诱导培养, 以确定最佳诱导表达蛋白条件。 1.2.3 重组蛋白KDR-CD的纯化
将上述菌体悬浮于预冷的结合缓冲液(1×binding buffer: 5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)中, 置冰浴进行超声波破碎, 10 000 r/min离心15 min弃上清。按100 mg包涵体湿重加入10 mL包涵体洗涤液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 5 mmol/L EDTA, 1 mol/L NaCl )洗涤后, 4oC 10 000 r/min离心15 min弃上清, 重复上述步骤3次。加入10 mL包涵体裂解液(20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 5 mmol/L咪唑, 8 mmol/L尿素, pH 8.0), 4oC过夜。包涵体溶解后, 离心(15 000 r/min) 20 min, 取上清液用4oC预冷的复性液(20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 1 mol/L尿素, 5 mmol/L EDTA, 0.2 mmol/L氧化型谷胱苷肽, 2 mmol /L还原型谷胱苷肽, 0.5 mol/L精氨酸, pH 8.0)复性4oC 48 h。然后在4oC以50倍体积透析液A(20 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L尿素, pH 8.0), 透析液B(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)和透析液C(去离子水)依次透析3次, 每次6 h。透析后4oC 10 000 r/min离心15 min去沉淀, 进行冷冻干燥备用。样品溶于适量结合缓冲液中, 经0.45 μmol/L滤膜过滤后将样品溶液加至
1 材料和方法
1.1 实验材料
质粒及菌种: 质粒pET-30a及大肠杆菌BL21(DE3)由中国医学科学院基础医学研究所陈松森教授馈赠。
酶与主要试剂: 限制性内切酶, T4 DNA连接酶, Taq DNA聚合酶购自Promega 或 TaKaRa公司; 磷酸化的酪氨酸单克隆抗体购于Santa Cruz公司; 山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二抗购自中杉金桥试剂公司; Hepes, 合成二肽底物poly(Glu, Tyr)4:1和Na3VO4购自Sigma公司; TRIzol为Invitrogen公司产品; NBT/BCIP购自Promega公司; IPTG购自MERCK公司。
1.2 实验方法
1.2.1 KDR-CD基因的获得和重组质粒pET-30a/ KDR-CD的构建
采用TRIzol试剂从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)提取总RNA。使用两步法RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa), 以Oligo(dT)-adaptor 为引物进行反转录。根据已知
的KDR-CD基因序列设计引物, 引物1为5′-GT 以结合缓冲液预平衡过的Ni-NTA亲和层析柱, 依次′, 引以15 mL洗涤缓冲液 (Washing buffer: 60 mmol/L咪唑, 物2为5′CTG-3′(下划线分别示BamH I和Hind III酶切位点)。采用上述引物, 以反转录获得的cDNA为模版进行PCR反应。扩增的KDR-CD基因片段用Blue Tank (ISCO, USA)回收, 以BamH I-Hind III双酶切该片段, 克隆至BamH I-Hind III酶切的pET-30a, 转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞, 从转化子(Kar)分离获得重组质粒pET-30a/KDR-CD, 酶切检定并进行序列测定。
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0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、5 mL洗脱缓冲液 (Eluting buffer: 1 mol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)进行洗脱, 流速为8 min/mL。分管收集洗脱液体, 进行SDS-PAGE分析。合并含有目的蛋白的洗脱液, 4oC用蒸馏水进行透析, 冷冻干燥, −20oC保存。 1.2.4 Western blotting分析
样品进行SDS-PAGE后, 凝胶置于转移缓冲液(39 mmol/L 甘氨酸, 48 mmol/L Tris-HCl, 0.0375%
刘春平等: KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化
1547
SDS, 20%甲醇)中漂洗, 采用转膜仪(Bio-Rad SEMI- DRY TRANSFER)进行蛋白印迹转移, 将蛋白电转移(0.65 mA/cm2) 至硝酸纤维素膜, 转移进行2 h, 然后将膜置于丽春红S溶液(0.1%丽春红, 5% HAc)浸泡5 min, 确定标准蛋白分子量条带位置, 再以蒸馏水漂洗脱色, 将膜置入杂交袋, 加入含5%脱脂牛奶的TBS缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, pH 7.5), 4oC封闭过夜。弃溶液后加入小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体(用含5%脱脂牛奶的TBS Tween-20的TBS) 洗膜3次, 加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠多克隆抗体 (用含5%脱脂牛奶的TBS 1:1000稀释), 室温缓振2 h将膜取出, 经TBS-T漂洗3次, 置于NBT/BCIP显色液中显色, 室温下避光轻摇, 待染色蛋白条带清晰出现时, 将膜取出置蒸馏水中终止显色。
1.2.5 酪氨酸激酶活性测定(ELISA法)[9]
于96孔培养板每孔加入1.5 μg酪氨酸激酶反应弃包被液后用底物poly(Glu, Tyr)4:1, 37oC保温过夜。
PBS(0.024% KH2PO4, 0.144% Na2HPO4, 0.02% KCl,
0.8% NaCl, pH 7.4)洗板3次, 晾干。在50 μL TK缓冲液(50 mmol/L Hepes pH7.4, 20 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L MnCl2, 0.2 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L 二硫苏糖醇)中加入终浓度为10 μmol/L的ATP和 2 μL KDR-CD, 于37oC保温1 h进行激酶反应。弃上述激酶反应液后, 用PBS-T(含0.1% Tween-20的PBS)洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入200 μL含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液进行封闭, 室温放置1 h。弃封闭液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入100 μL小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体(1:1000稀释), 室温放置2 h。弃上述反应液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)多克隆抗体(1:2000稀释), 室温放置2 h。弃上述反应液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2各50 μL, 室温放置1 h后, 加入100 μL 1 mol/L HCl终止反应, 使用酶标比色计在450 nm检测样品光密度值(OD),本实验中设立样品空白对照。
基于上述方法, 对KDR-CD、底物 poly
(Glu,Tyr)4:1、ATP、Mg2+及Mn2+浓度对酶反应影响进行了研究。
2 结果
2.1 KDR-CD表达载体的构建和鉴定
以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)提取的总RNA为模板, 经RT-PCR扩增获得KDR-CD编码基因, 将其克隆至pET-30a并转化至E. coli BL21(DE3), 从转化子提取重组质粒pET-30a/KDR-CD, 采用BamH I- 证, 均获得1.1 kb的基因片段, 说明KDR-CD成功插入pET-30a载体中(图 1)。核苷酸测序结果显示插入的KDR-CD与已知序列完全一致(GenBank Accession No. AF063658)。
1:1000稀释), 室温缓振2 h, 以TBS-T(含0.5% Hind III双酶切该质粒, 及以其为模板进行PCR验
图1 重组质粒pET30a/KDR-CD的酶切分析
Fig. 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid
pET30a/KDR-CD
1: pET-30a/KDR-CD digested by BamH I -Hind III;
2: PCR product; 3: molecular weight marker
2.2 重组的KDR-CD蛋白的表达及纯化
KDR-CD基因克隆至pET-30a并转化至E. coli BL21 (DE3), 结果表明, 重组菌E. coli BL21[pET- 30a/KDR-CD]在0.1 mmol/L IPTG诱导下, 37oC培养4 h表达重组KDR-CD最佳, 蛋白主要以包涵体的形式存在, 分子量为41 kD与预期值相符。重组KDR-CD包涵体经复性后, 采用 Ni-NTA亲和柱层析柱进行了纯化(图2), HPLC分析纯度为95.72%。
2.3 蛋白质印迹(Western blotting)
采用磷酸化酪氨酸的抗体对纯化的重组KDR-CD进行了Western blotting, 结果显示在没有
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图2 大肠杆菌表达蛋白和纯化重组蛋白的SDS-PAGE
分析
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the protein expressed by E.
coli and the purified sample
1: E. coli [pET-30a]; 2: molecular weight marker; 3: E. coli
[pET-30a/KDR-CD]; 4: inclusion body of E. coli
[pET-30a/KDR-CD]; 5: purified KDR-CD from inclusion body
图3 重组KDR-CD蛋白的Western blotting分析
Fig. 3 Western blotting analysis for recombinant KDR-CD
1: E. coli [pET-30a /KDR-CD]; 2: E. coli [pET-30a]
2.4 重组KDR-CD的酪氨酸激酶活性测定
根据前述方法对重组KDR-CD进行酪氨酸激酶活性测定, 图4A显示不同浓度的KDR-CD在ATP存在的条件下, 能使底物 poly(Glu, Tyr)4:1的酪氨酸发生磷酸化反应, 如图所示其活性与酶浓度呈剂量效应, 当KDR-CD酶量达到2 μL/孔时酪氨酸激酶活性最高。
加入外源ATP的情况下, 重组蛋白在41 kD处出现单一杂交带, 这表明重组KDR-CD能使底物 poly (Glu, Tyr)4:1酪氨酸磷酸化, 从而能和磷酸化酪氨酸的抗体结合, 说明表达的蛋白是自身磷酸化的酪氨酸激酶(图3)。
图4 酶浓度(A)、ATP(B)、多肽底物(C)、Mg2+浓度(D)和Mn2+(E)对重组KDR-CD催化激酶反应的影响
Fig. 4 Effects of concentrations of the enzyme(A), ATP(B), substrate peptide (C), Mg2+(D) and Mn2+(E) on kinase reaction
catalyzing by the recombinant KDR-CD
为了优化重组KDR-CD酪氨酸激酶活性测定的条件、分别对底物poly(Glu,Tyr)4:1浓度、ATP对ATP浓度、Mg2+及Mn2+的反应浓度进行了研究。和poly (Glu,Tyr)4:1, 分别固定其一浓度不变, 改变另一底物的浓度, 结果表明poly (Glu,Tyr) 4:1最
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适浓度为1.5 μg/孔(图4B), ATP的最适浓度为25 μmol/L (图4C)。研究还表明Mg2+和Mn2+的最佳浓度分别为12.5 mmol/L和0.5 mmol/L (图4D, 图4E), 当二价离子Mg2+和Mn2+浓度超过上述值时激酶反应受到抑制。
刘春平等: KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化
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3 讨论
大量研究表明VEGF及其受体在血管形成(Angiogenesis)中起重要作用, 其中KDR是主要的信号传导者, 通过与VEGF结合从而激活磷酸化级联反应[2,3]。被认为是许多疾病特别是癌症治疗的潜在靶点, 因此KDR酪氨酸激酶抑制剂可能成为研究治疗肿瘤新药的有效途径之一。
研究表明KDR酪氨酸激酶催化域有6个自磷酸化位点[6, 10]: Tyr 951, Tyr 996, Tyr 1054, Tyr 1059, Tyr 1175 和Tyr 1214, 自磷酸化位点参与调节受体的激酶活性。本文研究的KDR-CD催化域包括816至1175位的氨基酸, 采用载体pET-30a在E.coli BL21(DE3)进行了表达, 蛋白质印迹 (Western blotting)结果显示重组蛋白KDR-CD能使底物 poly(Glu, Tyr)4:1 酪氨酸磷酸化, 从而能和酪氨酸磷酸化的抗体结合出现单一的蛋白杂交带, 这表明在没有加入外源ATP条件下, 重组KDR-CD可以利用E. coli BL21菌体内源的ATP发生自身磷酸化反应, 与文献报道相符[6]。这说明本文表达的酪氨酸激酶催化域足以保证酪氨酸激酶能自磷酸化, 表明分子间的自磷酸化是催化域所固有的, 独立于其他结构域而存在。
酪氨酸激酶受体的研究表明典型的自磷酸化位点需要有一个或两个酸性氨基酸残基结合至磷酸化酪氨酸的残基端。由于KDR受体的天然底物至今尚未确定, 因此根据相关报道[10]本实验采用了[poly(Glu, Tyr)4:1]二肽作为反应底物, 尽管poly(Glu, Tyr)4:1是一种合成肽, 但在本实验中, 重组KDR对poly(Glu, Tyr)4:1的磷酸化效果好, 显示了重组KDR的酪氨酸激酶活性, 因此该底物可进一步用于构建酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的研究。
目前国内外研究者主要采用真核细胞特别是SF9昆虫细胞表达KDR的催化区域 [9, 11, 12 ], 并以此为基础建立了筛选酪氨酸激酶抑制剂的模型, 其表达的重组蛋白既有自身磷酸化的也有非磷酸化的, Parast等[11]研究显示磷酸化的KDR-CD要比非磷酸化的形式稳定。和真核表达系统相比较, KDR在大肠杆菌表达较方便易行, 表达量高且表达产物分离纯化相对简单, 本研究拟以上述重组KDR-CD为靶点, 构建酪氨酸激酶抑制剂筛选模型, 为获得酪氨
酸激酶的抑制剂创造良好条件。由于未获得商品KDR-CD酪氨酸激酶, 因此在酶活性研究未设定阳性对照。
REFERENCES
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通过和其特异性受体结合发挥作用的, 其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在调节内皮细胞增殖、分化反应中最为重要, 是内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者。KDR主要在内皮细胞表达, 由胞外7个Ig样结构域, 一个跨膜域和胞内域组成[6]。VEGF与KDR结合后受体二聚体化, 进一步激发KDR酪氨酸发生磷酸化, 导致自身酶活性和下游信号相关酶的激活, 从而调节血管内皮细胞相关反应[6−8]。新生
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血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素, 因此以KDR为靶位进行药物设计和筛选已成为肿瘤治疗的有效途径之一。
本研究将具酪氨酸激酶活性的人源KDR酪氨酸激酶催化域 (KDR-CD)在E. coli BL21(DE3)中成功进行了表达, 采用Ni-NTA亲和层析对蛋白进行了纯化, 并对KDR-CD蛋白的酪氨酸激酶活性进行了研究, 为进一步以其为靶点进行酶抑制剂筛选, 获得抗肿瘤新药奠定了一定基础。
1.2.2 重组菌的诱导表达
将重组菌E. coli BL21[pET-30a/KDR-CD]接种至5 mL含卡那霉素(25 g/mL)的LB培养基, 37oC培养过夜, 按1%的接种量转种至含卡那霉素(25 g/mL)的LB培养基, 37oC培养至OD600 为0.6~0.8, 以不同浓度IPTG (0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.6和0.8 mmol/L)和不同时间(1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和8 h) 对重组菌E. coli BL21[pET-30a/KDR-CD]进行了诱导培养, 以确定最佳诱导表达蛋白条件。 1.2.3 重组蛋白KDR-CD的纯化
将上述菌体悬浮于预冷的结合缓冲液(1×binding buffer: 5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)中, 置冰浴进行超声波破碎, 10 000 r/min离心15 min弃上清。按100 mg包涵体湿重加入10 mL包涵体洗涤液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 5 mmol/L EDTA, 1 mol/L NaCl )洗涤后, 4oC 10 000 r/min离心15 min弃上清, 重复上述步骤3次。加入10 mL包涵体裂解液(20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 5 mmol/L咪唑, 8 mmol/L尿素, pH 8.0), 4oC过夜。包涵体溶解后, 离心(15 000 r/min) 20 min, 取上清液用4oC预冷的复性液(20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 1 mol/L尿素, 5 mmol/L EDTA, 0.2 mmol/L氧化型谷胱苷肽, 2 mmol /L还原型谷胱苷肽, 0.5 mol/L精氨酸, pH 8.0)复性4oC 48 h。然后在4oC以50倍体积透析液A(20 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L尿素, pH 8.0), 透析液B(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)和透析液C(去离子水)依次透析3次, 每次6 h。透析后4oC 10 000 r/min离心15 min去沉淀, 进行冷冻干燥备用。样品溶于适量结合缓冲液中, 经0.45 μmol/L滤膜过滤后将样品溶液加至
1 材料和方法
1.1 实验材料
质粒及菌种: 质粒pET-30a及大肠杆菌BL21(DE3)由中国医学科学院基础医学研究所陈松森教授馈赠。
酶与主要试剂: 限制性内切酶, T4 DNA连接酶, Taq DNA聚合酶购自Promega 或 TaKaRa公司; 磷酸化的酪氨酸单克隆抗体购于Santa Cruz公司; 山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二抗购自中杉金桥试剂公司; Hepes, 合成二肽底物poly(Glu, Tyr)4:1和Na3VO4购自Sigma公司; TRIzol为Invitrogen公司产品; NBT/BCIP购自Promega公司; IPTG购自MERCK公司。
1.2 实验方法
1.2.1 KDR-CD基因的获得和重组质粒pET-30a/ KDR-CD的构建
采用TRIzol试剂从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)提取总RNA。使用两步法RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa), 以Oligo(dT)-adaptor 为引物进行反转录。根据已知
的KDR-CD基因序列设计引物, 引物1为5′-GT 以结合缓冲液预平衡过的Ni-NTA亲和层析柱, 依次′, 引以15 mL洗涤缓冲液 (Washing buffer: 60 mmol/L咪唑, 物2为5′CTG-3′(下划线分别示BamH I和Hind III酶切位点)。采用上述引物, 以反转录获得的cDNA为模版进行PCR反应。扩增的KDR-CD基因片段用Blue Tank (ISCO, USA)回收, 以BamH I-Hind III双酶切该片段, 克隆至BamH I-Hind III酶切的pET-30a, 转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞, 从转化子(Kar)分离获得重组质粒pET-30a/KDR-CD, 酶切检定并进行序列测定。
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0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、5 mL洗脱缓冲液 (Eluting buffer: 1 mol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)进行洗脱, 流速为8 min/mL。分管收集洗脱液体, 进行SDS-PAGE分析。合并含有目的蛋白的洗脱液, 4oC用蒸馏水进行透析, 冷冻干燥, −20oC保存。 1.2.4 Western blotting分析
样品进行SDS-PAGE后, 凝胶置于转移缓冲液(39 mmol/L 甘氨酸, 48 mmol/L Tris-HCl, 0.0375%
刘春平等: KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化
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SDS, 20%甲醇)中漂洗, 采用转膜仪(Bio-Rad SEMI- DRY TRANSFER)进行蛋白印迹转移, 将蛋白电转移(0.65 mA/cm2) 至硝酸纤维素膜, 转移进行2 h, 然后将膜置于丽春红S溶液(0.1%丽春红, 5% HAc)浸泡5 min, 确定标准蛋白分子量条带位置, 再以蒸馏水漂洗脱色, 将膜置入杂交袋, 加入含5%脱脂牛奶的TBS缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, pH 7.5), 4oC封闭过夜。弃溶液后加入小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体(用含5%脱脂牛奶的TBS Tween-20的TBS) 洗膜3次, 加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠多克隆抗体 (用含5%脱脂牛奶的TBS 1:1000稀释), 室温缓振2 h将膜取出, 经TBS-T漂洗3次, 置于NBT/BCIP显色液中显色, 室温下避光轻摇, 待染色蛋白条带清晰出现时, 将膜取出置蒸馏水中终止显色。
1.2.5 酪氨酸激酶活性测定(ELISA法)[9]
于96孔培养板每孔加入1.5 μg酪氨酸激酶反应弃包被液后用底物poly(Glu, Tyr)4:1, 37oC保温过夜。
PBS(0.024% KH2PO4, 0.144% Na2HPO4, 0.02% KCl,
0.8% NaCl, pH 7.4)洗板3次, 晾干。在50 μL TK缓冲液(50 mmol/L Hepes pH7.4, 20 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L MnCl2, 0.2 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L 二硫苏糖醇)中加入终浓度为10 μmol/L的ATP和 2 μL KDR-CD, 于37oC保温1 h进行激酶反应。弃上述激酶反应液后, 用PBS-T(含0.1% Tween-20的PBS)洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入200 μL含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液进行封闭, 室温放置1 h。弃封闭液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入100 μL小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体(1:1000稀释), 室温放置2 h。弃上述反应液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)多克隆抗体(1:2000稀释), 室温放置2 h。弃上述反应液, 用PBS-T洗板3次, 再用PBS洗板3次, 晾干。每孔加入3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2各50 μL, 室温放置1 h后, 加入100 μL 1 mol/L HCl终止反应, 使用酶标比色计在450 nm检测样品光密度值(OD),本实验中设立样品空白对照。
基于上述方法, 对KDR-CD、底物 poly
(Glu,Tyr)4:1、ATP、Mg2+及Mn2+浓度对酶反应影响进行了研究。
2 结果
2.1 KDR-CD表达载体的构建和鉴定
以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)提取的总RNA为模板, 经RT-PCR扩增获得KDR-CD编码基因, 将其克隆至pET-30a并转化至E. coli BL21(DE3), 从转化子提取重组质粒pET-30a/KDR-CD, 采用BamH I- 证, 均获得1.1 kb的基因片段, 说明KDR-CD成功插入pET-30a载体中(图 1)。核苷酸测序结果显示插入的KDR-CD与已知序列完全一致(GenBank Accession No. AF063658)。
1:1000稀释), 室温缓振2 h, 以TBS-T(含0.5% Hind III双酶切该质粒, 及以其为模板进行PCR验
图1 重组质粒pET30a/KDR-CD的酶切分析
Fig. 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid
pET30a/KDR-CD
1: pET-30a/KDR-CD digested by BamH I -Hind III;
2: PCR product; 3: molecular weight marker
2.2 重组的KDR-CD蛋白的表达及纯化
KDR-CD基因克隆至pET-30a并转化至E. coli BL21 (DE3), 结果表明, 重组菌E. coli BL21[pET- 30a/KDR-CD]在0.1 mmol/L IPTG诱导下, 37oC培养4 h表达重组KDR-CD最佳, 蛋白主要以包涵体的形式存在, 分子量为41 kD与预期值相符。重组KDR-CD包涵体经复性后, 采用 Ni-NTA亲和柱层析柱进行了纯化(图2), HPLC分析纯度为95.72%。
2.3 蛋白质印迹(Western blotting)
采用磷酸化酪氨酸的抗体对纯化的重组KDR-CD进行了Western blotting, 结果显示在没有
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1548 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech September 25, 2008 Vol.24 No.9
图2 大肠杆菌表达蛋白和纯化重组蛋白的SDS-PAGE
分析
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the protein expressed by E.
coli and the purified sample
1: E. coli [pET-30a]; 2: molecular weight marker; 3: E. coli
[pET-30a/KDR-CD]; 4: inclusion body of E. coli
[pET-30a/KDR-CD]; 5: purified KDR-CD from inclusion body
图3 重组KDR-CD蛋白的Western blotting分析
Fig. 3 Western blotting analysis for recombinant KDR-CD
1: E. coli [pET-30a /KDR-CD]; 2: E. coli [pET-30a]
2.4 重组KDR-CD的酪氨酸激酶活性测定
根据前述方法对重组KDR-CD进行酪氨酸激酶活性测定, 图4A显示不同浓度的KDR-CD在ATP存在的条件下, 能使底物 poly(Glu, Tyr)4:1的酪氨酸发生磷酸化反应, 如图所示其活性与酶浓度呈剂量效应, 当KDR-CD酶量达到2 μL/孔时酪氨酸激酶活性最高。
加入外源ATP的情况下, 重组蛋白在41 kD处出现单一杂交带, 这表明重组KDR-CD能使底物 poly (Glu, Tyr)4:1酪氨酸磷酸化, 从而能和磷酸化酪氨酸的抗体结合, 说明表达的蛋白是自身磷酸化的酪氨酸激酶(图3)。
图4 酶浓度(A)、ATP(B)、多肽底物(C)、Mg2+浓度(D)和Mn2+(E)对重组KDR-CD催化激酶反应的影响
Fig. 4 Effects of concentrations of the enzyme(A), ATP(B), substrate peptide (C), Mg2+(D) and Mn2+(E) on kinase reaction
catalyzing by the recombinant KDR-CD
为了优化重组KDR-CD酪氨酸激酶活性测定的条件、分别对底物poly(Glu,Tyr)4:1浓度、ATP对ATP浓度、Mg2+及Mn2+的反应浓度进行了研究。和poly (Glu,Tyr)4:1, 分别固定其一浓度不变, 改变另一底物的浓度, 结果表明poly (Glu,Tyr) 4:1最
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适浓度为1.5 μg/孔(图4B), ATP的最适浓度为25 μmol/L (图4C)。研究还表明Mg2+和Mn2+的最佳浓度分别为12.5 mmol/L和0.5 mmol/L (图4D, 图4E), 当二价离子Mg2+和Mn2+浓度超过上述值时激酶反应受到抑制。
刘春平等: KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化
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3 讨论
大量研究表明VEGF及其受体在血管形成(Angiogenesis)中起重要作用, 其中KDR是主要的信号传导者, 通过与VEGF结合从而激活磷酸化级联反应[2,3]。被认为是许多疾病特别是癌症治疗的潜在靶点, 因此KDR酪氨酸激酶抑制剂可能成为研究治疗肿瘤新药的有效途径之一。
研究表明KDR酪氨酸激酶催化域有6个自磷酸化位点[6, 10]: Tyr 951, Tyr 996, Tyr 1054, Tyr 1059, Tyr 1175 和Tyr 1214, 自磷酸化位点参与调节受体的激酶活性。本文研究的KDR-CD催化域包括816至1175位的氨基酸, 采用载体pET-30a在E.coli BL21(DE3)进行了表达, 蛋白质印迹 (Western blotting)结果显示重组蛋白KDR-CD能使底物 poly(Glu, Tyr)4:1 酪氨酸磷酸化, 从而能和酪氨酸磷酸化的抗体结合出现单一的蛋白杂交带, 这表明在没有加入外源ATP条件下, 重组KDR-CD可以利用E. coli BL21菌体内源的ATP发生自身磷酸化反应, 与文献报道相符[6]。这说明本文表达的酪氨酸激酶催化域足以保证酪氨酸激酶能自磷酸化, 表明分子间的自磷酸化是催化域所固有的, 独立于其他结构域而存在。
酪氨酸激酶受体的研究表明典型的自磷酸化位点需要有一个或两个酸性氨基酸残基结合至磷酸化酪氨酸的残基端。由于KDR受体的天然底物至今尚未确定, 因此根据相关报道[10]本实验采用了[poly(Glu, Tyr)4:1]二肽作为反应底物, 尽管poly(Glu, Tyr)4:1是一种合成肽, 但在本实验中, 重组KDR对poly(Glu, Tyr)4:1的磷酸化效果好, 显示了重组KDR的酪氨酸激酶活性, 因此该底物可进一步用于构建酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的研究。
目前国内外研究者主要采用真核细胞特别是SF9昆虫细胞表达KDR的催化区域 [9, 11, 12 ], 并以此为基础建立了筛选酪氨酸激酶抑制剂的模型, 其表达的重组蛋白既有自身磷酸化的也有非磷酸化的, Parast等[11]研究显示磷酸化的KDR-CD要比非磷酸化的形式稳定。和真核表达系统相比较, KDR在大肠杆菌表达较方便易行, 表达量高且表达产物分离纯化相对简单, 本研究拟以上述重组KDR-CD为靶点, 构建酪氨酸激酶抑制剂筛选模型, 为获得酪氨
酸激酶的抑制剂创造良好条件。由于未获得商品KDR-CD酪氨酸激酶, 因此在酶活性研究未设定阳性对照。
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