国家自然科学基金
申请书
项目名称：鳄鱼血实验的持续研究
申 请 人：赵庆荣 电话： [1**********]
依托单位：海南大学
通讯地址：海南省海口市人民大道58号
邮政编码：570028 单位电话：
电子邮箱：[email protected]
申报日期： 2015年1月1日
国家自然科学基金委员会
报告正文
（一）立项依据与研究内容
1 项目的立项依据
据国外媒体报道，美国研究人员在美国化学学会会议上表示，从鳄鱼血液中提取的蛋白质可用于研制消灭金黄色葡萄球菌(MRSA)等“超级病菌”的新抗生素上，将有助于治疗重度烧伤和溃疡患者。
鳄鱼在激烈的领土争夺战中会遭受重伤。尽管伤口会感染细菌、病毒和真菌，但依然能很快愈合。抗生素的抗性仍在增强，但现在仍然没有新的对付抗性增强的方法。
人在接触了具有感染能力的有机体后，人的免疫系统就会起到保护作用，但美国路易斯安那州研究人员说，以前的研究显示，鳄鱼有一种特别强的免疫系统，它能抵抗以前没有出现过的真菌、病毒和细菌等微生物。这个研究小组为了增强美国鳄鱼的免疫系统，给它们注射了一种物质，随后提取了血液样本。然后，他们分离出抵抗感染的白细胞，萃取了抗生蛋白。
实验室测试结果表明，即使少量萃取出来的蛋白质，也能杀死大量细菌，包括金黄色葡萄球菌等。这些蛋白质还能杀死8种白色念珠菌中的6种，这是一种酵母感染，会给艾滋病等患者造成严重影响，削弱他们的免疫系统力。
科学家希望这些蛋白质将来可以被用做治疗人类传染病药物抗菌药和抗病毒药的主要成分。他们下一步将弄清楚这些抗生蛋白精确的化学机理。研究显示，鳄鱼体内的白细胞能消灭皮氏培养皿中的病毒。研究人员已经开始分析把它们用在消灭艾滋病病毒上的可能性。
生物化学家马克·迈查恩4年来一直在研究鳄鱼血的抗生特性，他表示这个研究小组对抗菌药和抗真菌药的发展充满希望。他说：“总有一天，你可能接受一种鳄鱼血液产品的治疗。我估计用鳄鱼血液做成的乳脂可能治疗糖尿病患者脚底溃疡，或者防止烧伤患者受到感染等。”迈查恩用澳大利亚鳄鱼做了类似研究。
诺丁汉大学微生物学专家保罗·威廉斯表示，今天所用的多数抗生素都是很久以前研制出来的。他说：“我们正面临困境，所以需要发明新的抗生素。科学家正从青蛙皮肤和鳄鱼身上寻找缩氨酸，以便观察它们是否可以减小毒性，杀死细菌，或者改善抵抗传染的免疫系统。但是，多数都没有被用在临床上。”
经英国皇家科学院研究公布，含有比当今所发现的一切抗生素还要强有力的抗菌物质，不仅可杀伤病菌，而且可消灭霉菌甚至一部份病毒，即是人类已经从鳄鱼血看到人类抗癌病毒与HIV病毒的曙光。
参考文献
[1] 传统动物药鳄鱼血的免疫效应和安全性研究 王平; 李伟琦 中国中医基础医学杂志 2011-12-28 期刊 88——96
[2] 鳄鱼血浆体外抗菌实验研究 许东晖; 马海萍; 梅雪婷; 许实波 中国海洋药物 2008-02-28 期刊 190——220
[3] Ongoing blood clotting in recent cerebral thrombosis: presence of fibrin monomers in the circulation demonstrated by the ethanol gelation test (EGT).
Ionescu D A;;Andronescu S;;Marcu I;;Ghiţescu M Neurologie et psychiatrie 1983-2 PubMed期刊 11——15
[4] Ongoing Blood Pressure Change in Both Upper Extremities: An Unusual Presentation of Aortic Dissection
Hung Yi Chen International Journal of Clinical Medicine 2011-04 美国科研出版社期刊 55——60
[5] Alterations in resting-state regional cerebral blood flow demonstrate ongoing pain in osteoarthritis: An arterial spin-labeled magnetic resonance imaging study.
Howard Matthew A;;Sanders 2012-12 PubMed期刊 220——231
2 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
2.1 研究内容
（1）优化鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化条件
（2）鳄鱼血液中蛋白质含量的测定
（3）鳄鱼血红蛋白化学结构分析
2.2 研究目标
（1）优化蛋白质提取、分离纯化条件，提高血红蛋白得率及纯度
（2）阐明血红蛋白构效关系
2.3 拟解决的关键科学问题
（1）鳄鱼血红蛋白的纯化
（2）鳄鱼血红蛋白质含量的测定
（3）鳄鱼血红蛋白化学结构表征
（4）鳄鱼血氨基酸链的结构分析
3 拟采取的研究方案及可行性分析。
3.1 拟采取的研究方案
（1）优化鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化条件
①样品处理：
研究方案：要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤；在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放；离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体；装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
②鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化方法优化
研究方案：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。粗分离：透析除去分子较小的杂质。纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
（2）鳄鱼血蛋白质含量的测定
研究方案：双缩脲法操作方法 ：①标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 ②鳄鱼血的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定鳄鱼血的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
（3）鳄鱼血蛋白质化学结构分析
研究方案：综合利用化学、GC-MS、一维和二维核磁分析蛋白质化学结构。
（4）鳄鱼血氨基酸链的结构分析
研究方案：利用核磁共振原理，检测分子质量小于60Ku的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后采集不同的峰组成图谱，并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征的图谱。
3.2 可行性分析
（1）理论依据充分
鳄鱼血具有治癌、治艾滋病、广普抗菌、病毒神的奇作用，且鳄鱼血中蛋白质的提取、分离纯化、
结构表征和生物活性测定方法已建立，因此，运用多种方法将其从鳄鱼血液分离纯化出来，表征蛋白质化学结构，研究蛋白质构效关系理论上合理可行。
（2）研究方法可行
本项目拟采用的方法都是较为成熟的方法和技术，且本试验室已建立了较成熟和完善的蛋白质等生化物质的提取、分离、纯化与鉴定等分析方法。根据项目实际要求，适当改进各种方法，形成完整技术，可以达到完成项目的预期目标。
（3）研究基础较好，设备条件完善：见研究基础和工作条件部分。
（4）项目组成员结构合理、团结敬业,理论基础扎实、专业知识丰富、实验技术熟练。
4 本项目的特色与创新之处。
（1）阐明鳄鱼血蛋白质化学结构、溶液构象与多糖抗氧化活性内在联系，属于原创性研究
（2）首次观察化学修饰对鳄鱼血蛋白质外抗氧化活性影响，进一步揭示蛋白质构效关系
5 年度研究计划及预期研究结果。
5.1 年度研究计划
2014.01–2014.12
(1)优化鳄鱼血蛋白质提取纯化条件 ；
(2)测定蛋白质含量；
(3)鳄鱼血蛋白质分子量测定；
2015.01–2015.12
(1)进行鳄鱼血蛋白质的双缩脲实验，完成GC-MS和一维与二维核磁测试；
(2)应用核磁共振分析氨基酸链的结构；
(3)鳄鱼血蛋白质活性检测；
2016.01–2016.12
(2)总结工作成果，进行论文撰写与发表。
5.2 预期研究结果
优化鳄鱼血蛋白质提取、分离、纯化条件，准确分析蛋白质化学结构，阐明蛋白质化学结构、功能的内在联系。
国家自然科学基金
申请书
项目名称：鳄鱼血实验的持续研究
申 请 人：赵庆荣 电话： [1**********]
依托单位：海南大学
通讯地址：海南省海口市人民大道58号
邮政编码：570028 单位电话：
电子邮箱：[email protected]
申报日期： 2015年1月1日
国家自然科学基金委员会
报告正文
（一）立项依据与研究内容
1 项目的立项依据
据国外媒体报道，美国研究人员在美国化学学会会议上表示，从鳄鱼血液中提取的蛋白质可用于研制消灭金黄色葡萄球菌(MRSA)等“超级病菌”的新抗生素上，将有助于治疗重度烧伤和溃疡患者。
鳄鱼在激烈的领土争夺战中会遭受重伤。尽管伤口会感染细菌、病毒和真菌，但依然能很快愈合。抗生素的抗性仍在增强，但现在仍然没有新的对付抗性增强的方法。
人在接触了具有感染能力的有机体后，人的免疫系统就会起到保护作用，但美国路易斯安那州研究人员说，以前的研究显示，鳄鱼有一种特别强的免疫系统，它能抵抗以前没有出现过的真菌、病毒和细菌等微生物。这个研究小组为了增强美国鳄鱼的免疫系统，给它们注射了一种物质，随后提取了血液样本。然后，他们分离出抵抗感染的白细胞，萃取了抗生蛋白。
实验室测试结果表明，即使少量萃取出来的蛋白质，也能杀死大量细菌，包括金黄色葡萄球菌等。这些蛋白质还能杀死8种白色念珠菌中的6种，这是一种酵母感染，会给艾滋病等患者造成严重影响，削弱他们的免疫系统力。
科学家希望这些蛋白质将来可以被用做治疗人类传染病药物抗菌药和抗病毒药的主要成分。他们下一步将弄清楚这些抗生蛋白精确的化学机理。研究显示，鳄鱼体内的白细胞能消灭皮氏培养皿中的病毒。研究人员已经开始分析把它们用在消灭艾滋病病毒上的可能性。
生物化学家马克·迈查恩4年来一直在研究鳄鱼血的抗生特性，他表示这个研究小组对抗菌药和抗真菌药的发展充满希望。他说：“总有一天，你可能接受一种鳄鱼血液产品的治疗。我估计用鳄鱼血液做成的乳脂可能治疗糖尿病患者脚底溃疡，或者防止烧伤患者受到感染等。”迈查恩用澳大利亚鳄鱼做了类似研究。
诺丁汉大学微生物学专家保罗·威廉斯表示，今天所用的多数抗生素都是很久以前研制出来的。他说：“我们正面临困境，所以需要发明新的抗生素。科学家正从青蛙皮肤和鳄鱼身上寻找缩氨酸，以便观察它们是否可以减小毒性，杀死细菌，或者改善抵抗传染的免疫系统。但是，多数都没有被用在临床上。”
经英国皇家科学院研究公布，含有比当今所发现的一切抗生素还要强有力的抗菌物质，不仅可杀伤病菌，而且可消灭霉菌甚至一部份病毒，即是人类已经从鳄鱼血看到人类抗癌病毒与HIV病毒的曙光。
参考文献
[1] 传统动物药鳄鱼血的免疫效应和安全性研究 王平; 李伟琦 中国中医基础医学杂志 2011-12-28 期刊 88——96
[2] 鳄鱼血浆体外抗菌实验研究 许东晖; 马海萍; 梅雪婷; 许实波 中国海洋药物 2008-02-28 期刊 190——220
[3] Ongoing blood clotting in recent cerebral thrombosis: presence of fibrin monomers in the circulation demonstrated by the ethanol gelation test (EGT).
Ionescu D A;;Andronescu S;;Marcu I;;Ghiţescu M Neurologie et psychiatrie 1983-2 PubMed期刊 11——15
[4] Ongoing Blood Pressure Change in Both Upper Extremities: An Unusual Presentation of Aortic Dissection
Hung Yi Chen International Journal of Clinical Medicine 2011-04 美国科研出版社期刊 55——60
[5] Alterations in resting-state regional cerebral blood flow demonstrate ongoing pain in osteoarthritis: An arterial spin-labeled magnetic resonance imaging study.
Howard Matthew A;;Sanders 2012-12 PubMed期刊 220——231
2 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
2.1 研究内容
（1）优化鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化条件
（2）鳄鱼血液中蛋白质含量的测定
（3）鳄鱼血红蛋白化学结构分析
2.2 研究目标
（1）优化蛋白质提取、分离纯化条件，提高血红蛋白得率及纯度
（2）阐明血红蛋白构效关系
2.3 拟解决的关键科学问题
（1）鳄鱼血红蛋白的纯化
（2）鳄鱼血红蛋白质含量的测定
（3）鳄鱼血红蛋白化学结构表征
（4）鳄鱼血氨基酸链的结构分析
3 拟采取的研究方案及可行性分析。
3.1 拟采取的研究方案
（1）优化鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化条件
①样品处理：
研究方案：要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤；在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放；离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体；装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
②鳄鱼血红蛋白提取、分离和纯化方法优化
研究方案：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。粗分离：透析除去分子较小的杂质。纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
（2）鳄鱼血蛋白质含量的测定
研究方案：双缩脲法操作方法 ：①标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 ②鳄鱼血的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定鳄鱼血的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
（3）鳄鱼血蛋白质化学结构分析
研究方案：综合利用化学、GC-MS、一维和二维核磁分析蛋白质化学结构。
（4）鳄鱼血氨基酸链的结构分析
研究方案：利用核磁共振原理，检测分子质量小于60Ku的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后采集不同的峰组成图谱，并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征的图谱。
3.2 可行性分析
（1）理论依据充分
鳄鱼血具有治癌、治艾滋病、广普抗菌、病毒神的奇作用，且鳄鱼血中蛋白质的提取、分离纯化、
结构表征和生物活性测定方法已建立，因此，运用多种方法将其从鳄鱼血液分离纯化出来，表征蛋白质化学结构，研究蛋白质构效关系理论上合理可行。
（2）研究方法可行
本项目拟采用的方法都是较为成熟的方法和技术，且本试验室已建立了较成熟和完善的蛋白质等生化物质的提取、分离、纯化与鉴定等分析方法。根据项目实际要求，适当改进各种方法，形成完整技术，可以达到完成项目的预期目标。
（3）研究基础较好，设备条件完善：见研究基础和工作条件部分。
（4）项目组成员结构合理、团结敬业,理论基础扎实、专业知识丰富、实验技术熟练。
4 本项目的特色与创新之处。
（1）阐明鳄鱼血蛋白质化学结构、溶液构象与多糖抗氧化活性内在联系，属于原创性研究
（2）首次观察化学修饰对鳄鱼血蛋白质外抗氧化活性影响，进一步揭示蛋白质构效关系
5 年度研究计划及预期研究结果。
5.1 年度研究计划
2014.01–2014.12
(1)优化鳄鱼血蛋白质提取纯化条件 ；
(2)测定蛋白质含量；
(3)鳄鱼血蛋白质分子量测定；
2015.01–2015.12
(1)进行鳄鱼血蛋白质的双缩脲实验，完成GC-MS和一维与二维核磁测试；
(2)应用核磁共振分析氨基酸链的结构；
(3)鳄鱼血蛋白质活性检测；
2016.01–2016.12
(2)总结工作成果，进行论文撰写与发表。
5.2 预期研究结果
优化鳄鱼血蛋白质提取、分离、纯化条件，准确分析蛋白质化学结构，阐明蛋白质化学结构、功能的内在联系。