研究探讨
高温煅烧贝壳粉抑菌效果研究
任惠，张志胜*，刘媛，刘菲，冯媛媛，杨霞
河北农业大学 食品科技学院（保定 071001）
摘要将贝壳粉经过高温煅烧，研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。通过抑菌圈试验、最小抑
菌浓度测定试验及抑菌率测定试验表明高温煅烧贝壳粉具有一定的抑菌作用。通过对煅烧温度、贝壳粉浓度、超声波处理时间以及扩散时间因素的研究，确定了高温煅烧贝壳粉适宜的抑菌条件：煅烧温度1100 ℃、贝壳粉浓度1%、超声时间15 min以及扩散时间16 h（大肠杆菌）和24 h（金黄色葡萄球菌）。关键词
高温煅烧；贝壳粉；抑菌；大肠杆菌; 金黄色葡萄球菌
Antiseptic Action of High-temperature Calcined Seashell Powder
Ren Hui, Zhang Zhi-sheng, Liu Yuan, Liu Fei, Feng Yuan-yuan, Yang Xia
College of Food Science and Technology,Agriculture University of Hebei (Baoding 071001)
Abstract The antiseptic action of high-temperature calcined seashell powder on E. coli and Staphylococcus aureus was investigated. The antiseptic action was demonstrated through the antibacterial circle experiment and the MIC test and antibacterial rate determination by the experiment and the antibacterial rate determination experiment. The calcining temperature, the concentration of seashell powder solution, the ultrasound treatment time and the diffusion time were studied as experiment factors to optimize the best antibacterial conditions. The results showed that the best antibacterial conditions were as follows: the calcining temperature was 1100 ℃, the concentration of seashell powder solution was 1%, the ultrasound treatment time was 15 min and the diffusion time was 16 h (E. coli) and 24 h (Staphylococcus aureus).Keyword high-temperature calcinations; seashell powder; E. coli; antibacterial Staphylococcus aureus
贝壳是软体动物的外套膜，具有一种特殊的腺细胞，其分泌物可形成保护身体柔软部分的钙化物，称为贝壳。我国海域辽阔，是海洋贝类的生产大国，近年来，贝类的养殖和加工成为沿海和海岛经济发展的重要组成部分，我国贝类的产量和加工量每年已达到数百万吨甚至上千万吨之多[1]。贝壳资源极其丰富且品种繁多，但同时产生大量的废弃物，每年都有数百万吨的空贝壳被丢弃在海岸边。大量的贝壳严重污染了环境，破坏了海岸边应有的景色，贝壳污染已成为沿海地区亟待解决的环境问题之一，如何回收利用这些贝壳资源成为我们关注的的问题。
从海洋贝壳中提取的天然保鲜剂也具有较好的抗菌保鲜作用[2-3]。在目前的研究中，将贝壳粉采用高温灼烧后制取活性氧化钙，并以常见食品为保鲜材料，就活性氧化钙的制作及其抑菌作用做了初步探讨[4]。还有比较了不同贝壳煅烧物对猪瘦肉和豆腐干的防腐效果[5]。截至发稿前尚未见系统地研究贝壳粉煅烧物的抑菌效果并对其抑菌条件进行优化的报道。本研究先验证了贝壳粉的抑菌效果，进而改进了抑菌试验方法，同时优化了试验条件，确定了高温煅烧贝壳粉适宜的抑菌条件。为回收利用贝壳资源、开发新型天然生物保鲜剂提供了理论依据。
1 材料、仪器与方法
1.1 材料与试剂
材料：海湾扇贝，丰瑞水产食品有限公司提供；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，本实验室保藏菌种。
试剂：营养琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂；氧化钙，国产分析纯试剂，水为无菌水。1.2 试验仪器与设备
高温马福炉（SX2-2.5-12型）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；四两装高速中药粉碎机（QE-200g型）：武义县屹立工具有限公司；超声波破碎仪（JY-150B型）：北京天恩翰拓科技有限公司；漩涡混合器（QL-861型）：海门市麒麟医用仪器厂；电热鼓风干燥箱（101-0型）：天津市泰斯特仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-1F型）：苏州安泰空气技术有限公司，不锈钢手提式灭菌器（DSX-280A型）：上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱（DH3600Ⅱ型）：天津市泰斯特仪器有限公司；牛津杯（6 mm×7.8 mm×10 mm）：石家庄伟天科学仪器设备有限公司。1.3 试验方法1.3.1 贝壳粉制备
材料预处理：将海湾扇贝于适量水中煮至扇贝自然开口，取出扇贝闭壳肌、内脏等内容物，将贝壳冲洗干净，于自然条件下晾干，称取适量于四两装高速中药粉碎机中粉碎5 min，粉碎3次，过80目筛，备用。
高温煅烧：称取适量粉碎好的贝壳粉于10个坩埚
*通讯作者
研究探讨
中，每2个坩埚设为一组，每组温度分别为900 ℃，950 ℃，1 000 ℃，1 050 ℃，1 100 ℃，煅烧温度为2 h。然后将贝壳粉在电热干燥箱中干燥至恒重，放置于干燥器中。通过称量贝壳粉煅烧前后质量，计算贝壳粉失重率，计算得失重率为44.25%。根据相关文献[6]知，贝壳粉煅烧完全。1.3.2 抑菌剂制备
取无菌小试管，分别将在5个不同温度下煅烧的贝壳粉用无菌水配制成浓度为0.031 2%、0.062 5%、0.125%、0.25%、0.5%，1%的悬浊液10 mL。并将配制好的贝壳粉抑菌剂在超声波破碎仪中处理一定时间和不做超声处理作为对照。同时配制同样浓度的CaO作为对照。
1.3.3 受试菌准备
将实验室保藏菌种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行活化，配制成菌悬液[7]，并控制细菌总数在105 cfu/mL～106 cfu/mL，作为试验受试菌。参照GB/T47892-2003菌落总数测定方法[8]。1.3.4 抑菌性能测定试验
通过抑菌圈试验、最小抑菌浓度测定试验及抑菌率测定试验评价高温煅烧贝壳粉的抑菌作用。1.3.4.1 抑菌圈试验
本试验采用琼脂扩散法的牛津杯法评价贝壳粉抑菌剂的抑菌活力。通过抑菌圈直径的大小确定抗菌剂抗菌能力的强弱[9]。
用吸管准确量取预先配制好的营养琼脂培养基20 mL，加入内径一致并预先水平放置的培养皿内，凝固后并使培养皿中水分干燥透。取200 μL的受试菌悬液在平板上并用无菌玻耙涂布均匀，涂布后以平板无可见水滴为准，此时的平板立刻进行抑菌试验。用无菌镊子将灭菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的培养皿中均匀地放置4只牛津杯。用移液枪精准吸取一定浓度的贝壳粉抑菌剂200 μL至牛津杯中，注意不要将菌悬液溢出牛津杯外。同时吸取无菌水和同样浓度的CaO溶液至牛津杯中作为对照。将加入抑菌剂的培养皿在3 ℃～4 ℃冰箱中静置一定时间（即做扩散处理）和不做扩散处理作为对照，然后在受试菌最适生长温度37℃下，培养24 h，拍照并测量抑菌圈直径。平行试验3次，求其平均值，试验重复2次。1.3.4.2 最小抑菌浓度（MIC)测定试验
根据最小抑菌浓度测定试验原理[9]，将不同浓度的抗菌剂分别溶解于含100 mL已灭菌的营养肉汤培养基的锥形瓶中，移取一定量的已知浓度的菌悬液分别接种于含抗菌剂的营养肉汤培养基的锥形瓶中，作为试验组；以同样方法移取一定量的已知浓度的菌悬液接种于不含抗菌剂的锥形瓶中，作为阳性对照组；取只含有100 mL营养肉汤培养基的锥形瓶，不接种试验菌，作为阴性对照组。试验前已计算出试验菌悬液的
浓度，应使试验组和阳性对照组的锥形瓶中接种的试验菌浓度为5×105～5×106 cfu/mL，并对阳性对照组进行0 h活菌计数（0小时活菌计数用来确定试验菌的准确浓度及作为判定MIC的参考）。最后将试验组、阳性对照组、阴性对照组及0 h活菌计数的培养皿同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养24 h，观察结果。
当阳性对照组有细菌生长(混浊)，阴性对照组无菌生长(透明)，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗菌剂浓度，即为该抗菌剂对受试菌的MIC。1.3.4.3 抑菌率的测定
将盛有10 mL煅烧物悬液的三角瓶放于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，使三角瓶中的悬浮液保持均匀稳定。再将100 μL菌悬液注入上述三角瓶中，从三角瓶中取出100 μL液体，立即注入9.9 mL生理盐水中稀释,振荡均匀。从上述生理盐水中取出1 mL，采用平板稀释法测定残留的细菌数，于37 ℃培养24 h计算菌落数。同时做一对照试验(即用未经任何处理的受试
菌铺平板，计算菌落数)，以计算抑菌率。
2 结果与讨论
2.1 抑菌圈直径和最小抑菌浓度
由培养基扩散法初步确定抑菌剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌能力大小，结果以抑菌圈直径大小（单位mm）表示，见表1、图1、图2。
表1 不同浓度抑菌剂的抑菌圈直径
9000.062 5
0.1250.250.51
9500.062 5
0.1250.250.51
10000.062 5
0.1250.250.51
10500.062 5
0.1250.250.51
11000.062 5
0.1250.250.51
CaO悬液0.062 5
0.1250.250.51
5.866.386.607.667.949.6410.1812.2414.0616.226.727.067.388.128.6610.8210.9613.6214.9417.527.027.877.708.768.8611.3011.2415.3615.8419.027.808.848.5210.069.8012.4812.2016.0416.6819.868.429.689.1610.9610.5013.4212.9617.1216.9821.026.867.027.528.068.6012.8811.0414.9615.1618.68
根据文献[10]中对抑菌作用的判断：抑菌圈直径
小于或等于7 mm者，判为无抑菌作用；抑菌圈直径大
研究探讨
于7 mm者，有弱抑菌作用；抑菌圈在10～20 mm者，有中等抑菌作用；抑菌圈直径大于20 mm者，有强抑菌作用。由表1可知，贝壳粉抑菌剂有抑菌作用，且不同煅烧温度及不同浓度的抑菌剂抑菌效果不同。
图1 贝壳粉煅烧物对大肠杆菌抑菌效果图
图3 煅烧温度对抑菌效果的影响
2.2.2 贝壳粉浓度对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000 ℃，配制浓度为0.062 5%，0.125%，0.25%，0.5%，1%的抑菌剂在超声波破碎仪中破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图4所示）。可以看出，随着浓度的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，但从食品防腐剂添加范围和节省成本角度
考虑，确定抑菌剂浓度1%为最佳试验条件。
（注：图中1，2为抑菌剂，3为无菌水，4为CaO悬液）
图2 贝壳粉煅烧物对金黄色葡萄球菌抑菌效果图由营养肉汤稀释法测试抗菌剂抑菌性能，可测定配合物的最小抑菌浓度(MIC)，数据见表2。
表2 最小抑菌浓度和抑菌率
菌种大肠杆菌金黄色葡萄球菌
最小抑菌浓度/(mg・mL-1)
760680
抑菌率/%92.495.5
根据文献[11]最小抑菌浓度低于800 μg/mL即认为有抗菌作用，最小抑菌浓度越小则表明抗菌剂的抗菌性能越好。抑菌试验结果表明，该抗菌剂对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于对大肠杆菌的抑菌效果。
通过以上试验结果，可证明所制备的物质可以作为抑菌剂使用。为了进一步提高抑菌效果，将贝壳粉悬液进行超声波破碎及对加入抑菌剂的平皿做扩散处理，并与常规抑菌方法进行比较。以煅烧温度、煅烧时间、贝壳粉浓度、超声时间以及扩散时间为单因素，进行正交试验，确定最佳试验条件。2.2 单因素试验
2.2.1 煅烧温度对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为900 ℃，950 ℃，1 000 ℃，1 050 ℃，1 100 ℃的贝壳粉，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图3所示）。可以看出，随着煅烧温度的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当温度达到1 050 ℃以上时，抑菌圈直径增加缓慢。因此为了节
约能源，确定煅烧温度1 050℃为最佳试验条件。
图4 抑菌剂浓度对抑菌效果的影响
2.2.3 超声破碎时间对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000℃，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中分别破碎10，15，20，25，30 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图5所示）。可以看出，随着超声破碎时间的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当时间达到20 min以上时，抑菌圈直径都开始
减小。因此确定破碎时间15 min为最佳试验条件。
图5 超声破碎时间对抑菌效果的影响
2.2.4 扩散时间对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000 ℃，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中分别破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间分别为8 h，16 h，24 h，32 h，40 h，得到结果（如图6示）。可以看出，随着扩散时间的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当时间达到24 h以上时，抑菌圈直径增加缓慢。因此确定扩散时间24 h为最佳试验条件。2.3 正交试验
为确定在多因素条件下的最佳煅烧温度、贝壳粉浓度、超微粉碎时间、扩散时间，进行正交试验选用
研究探讨
L9(34)正交表进行试验方案设计，因素水平见表3，试
验结果如表4所示。
（注：图中1，2为抑菌剂，3为无菌水，4为CaO悬液）
图6 时间对抑菌效果的影响表3 正交试验因素水平表
水平123
A煅烧温度/℃B扩散时间/hC贝壳粉浓度/%D超声破碎时间/min
1 000160.5101 050240.75151 10032120
图8 贝壳粉煅烧物对金黄色葡萄球菌抑菌效果图
3 结论与讨论
1) 通过抑菌圈试验、最小抑菌浓度测定试验及抑
菌率测定试验表明贝壳粉有一定的抑菌作用可作为抑菌剂使用。为进一步提高抑菌作用，以贝壳粉煅烧时间、贝壳粉浓度、超声时间以及扩散时间为因素，对抑菌效果进行研究，得出最优试验条件为煅烧温度1 100 ℃、贝壳粉浓度1%，超声粉碎时间15 min以及扩散时间16 h（大肠杆菌）和24 h（金黄色葡萄球菌），大肠杆菌抑菌圈直径17.86 mm金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为22.64 mm。而在此条件下未经超声波粉碎处理和扩散处理的常规抑菌试验的对照中，得到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈平均直径分别为16.86 mm和20.82 mm。这主要由三方面作用引起：一是高温煅烧使贝壳粉在分子结构上发生了特殊的变化，使其具有了更好的稳定性和抑菌效果[12-13]；二是超声波粉碎使贝壳粉粒径变小，使颗粒分散更均匀，更好的溶于抑菌剂溶剂中，单位体积的贝壳粉数量增加，使抑菌效果增加；三是扩散处理在3 ℃～4 ℃条件下作用一定时间，使受试菌处于缓慢生长状态时，而抑菌剂更能充分扩散，然后置于受试菌最适增长温度下培养，使抑菌作用增强。
2) 通过试验可看出贝壳粉煅烧物的抑菌作用优于CaO的抑菌作用，分析其抑菌机理：一是贝壳粉煅烧物引起细菌细胞膜电荷的变化，影响细菌对营养物质的吸收或是渗透进入到微生物细胞内，吸附细胞内带负电的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌[12]；二是贝壳粉煅烧物吸附在微生物细胞表面，形成一层分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到杀菌和抑菌作用；三是通过改变细菌生长环境的pH来抑制受试菌生长繁殖，因此抑菌作用表现的较为迅速而强烈；四是同时钙处理能提高胞外钙水平，补偿胞壁区域钙的损失，对细胞壁细胞膜结构和功能起维护和调节作用，从而使细胞内保持分隔状态，进而对整个代谢过程有调控作用[14]。钙对呼吸作用有关的酶有直接调控作用，从而使呼吸强度下降[15]，最终达到抑菌作用。还有贝壳粉煅烧物中含有铜、锌等具有抑菌作用的微量元素[16]，增强了抑菌效果。其具体的抑菌机理还需要进一步探讨。
表4 正交试验表L9(34)
试验号
试验因素抑菌圈直径 /mm
ABCDⅠⅡ
1111111.68(9.02)11.60(9.08)2122215.88(11.38)15.74(11.30)3133319.22(15.88)19.18(15.76)4212316.32(12.34)16.40(12.38)5223120.28(16.76)20.42(16.80)6231212.62(9.88)12.66(10.00)7313221.88(17.88)21.92(17.80)8321313.98(10.62)14.06(10.58)9332117.22(13.02)17.26(13.04)K193.30(72.42)99.80(78.50)76.60(59.18)98.46(77.72)K298.70(78.16)100.36(77.44)98.82(73.46)100.70(78.24)K3106.32(82.94)98.16(77.58)122.90(100.88)99.16(77.56)115.55(12.07)16.63(13.08)12.77(9.86)16.41(12.95)216.45(13.03)16.75(12.91)16.47(12.24)16.78(13.04)317.72(13.82)16.36(12.93)20.48(16.81)16.52(12.93)R2.17(1.75)0.39(0.17)7.71(6.95)0.37(0.11)
注：括号内数据为大肠杆菌试验数据，括号外数据为金黄色葡萄球菌试验数据
2.4 验证试验
由表4中的极差分析可知：4种因素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果的影响大小均为：C>A>B>D，根据正交试验抑菌圈直径的大小，可以得出最优的抑菌条件为A3B1C3D2（大肠杆菌，如图7所示）和A3B2C3D2（金黄色葡萄球菌）。但从正交试验结果表中可以看出两种菌的抑菌方案均为A3B1C3D2抑菌圈直径最大，这与对金黄色葡萄球菌的抑菌结果不一致，因此对其进行验证试验。同时进行2次平行试验，测得金黄色葡萄球菌A3B1C3D2方案抑菌圈直径为21.82 mm，A3B2C3D2方案抑菌圈直径为22.64 mm，证实A3B2C3D2最佳组合（如图8所示）。
而在此条件下未经超声波粉碎处理和扩散处理的常规抑菌试验的对照中，得到的大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌抑菌圈平均直径分别为16.86 mm和20.82 mm。
图7 贝壳粉煅烧物对大肠杆菌抑菌效果图
研究探讨
抗坏血酸钙对蚕豆种子采后衰老的影响
张兰1，郑永华2
1. 江苏食品职业技术学院（淮安 223003）；2. 南京农业大学（南京 210095）
摘要研究了不同浓度的抗坏血酸钙处理对蚕豆贮藏期间的生理变化和衰老的影响。结果表明：适当的钙
处理可显著降低蚕豆的呼吸强度，推迟乙烯、Asc-POD高峰的出现，延缓超氧阴离子（O2-）含量的上升保持SOD活性，延缓衰老，减少营养成分VC的下降，从而保持了较好的品质。关键词
蚕豆；抗坏血酸钙；衰老；品质
Effect of Postharvest Calcium Treatment on Broad Bean Senescence
Zhang Lan1, Zheng Yong-hua2
1. Jiangsu Food Science College (Huai’an 223003); 2. Nanjing Agricultural University (Nanjing 210095)
Abstract Calcium ascorbate treatments on postharvest physiology and senescence of fresh broad beans were investigated. Results showed that suitable calcium treatment could significantly reduce respiratory rate, and delay ethylene production and Asc-POD peaks. O2- content was slowly raised, while SOD activity was maintained. Ascorbic acid was slowly decreased and good quality was kept for broad beans.Keywords broad bean; Calcium ascorbate; senescence; quality
钙对果实衰老与生理病害的发生有一定的抑制作用，其重要原因在于钙是膜的稳定剂，维持和保护质膜的结构与功能[1]，抑制苹果果实膜微黏度的升高，使膜外表面硬化[2]，延缓衰老。自由基被认为会导致膜系统损伤，从而促进植物衰老。采后果实经钙盐浸渍或渗入处理，可抑制完整果实的呼吸作用，降低呼吸强度[3]。目前大多数认为，外源钙处理浓度提
参考文献：
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高，抑制呼吸作用的效果增强。在某些情况下，采前喷钙、采后浸钙、渗钙对呼吸作用的影响不大[4]。这种现象产生的原因在于果实Ca2+含量高，足以防止膜完整性的丧失，进一步加强对呼吸的效果不大[5]。另外，采后果实经钙盐处理，可以有效降低其乙烯释放率[6]，渗钙推迟了鳄梨乙烯高峰期出现[7]。
蚕豆种子组织幼嫩，长江一带成熟于5月，气温
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高温煅烧贝壳粉抑菌效果研究
任惠，张志胜*，刘媛，刘菲，冯媛媛，杨霞
河北农业大学 食品科技学院（保定 071001）
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菌浓度测定试验及抑菌率测定试验表明高温煅烧贝壳粉具有一定的抑菌作用。通过对煅烧温度、贝壳粉浓度、超声波处理时间以及扩散时间因素的研究，确定了高温煅烧贝壳粉适宜的抑菌条件：煅烧温度1100 ℃、贝壳粉浓度1%、超声时间15 min以及扩散时间16 h（大肠杆菌）和24 h（金黄色葡萄球菌）。关键词
高温煅烧；贝壳粉；抑菌；大肠杆菌; 金黄色葡萄球菌
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Ren Hui, Zhang Zhi-sheng, Liu Yuan, Liu Fei, Feng Yuan-yuan, Yang Xia
College of Food Science and Technology,Agriculture University of Hebei (Baoding 071001)
Abstract The antiseptic action of high-temperature calcined seashell powder on E. coli and Staphylococcus aureus was investigated. The antiseptic action was demonstrated through the antibacterial circle experiment and the MIC test and antibacterial rate determination by the experiment and the antibacterial rate determination experiment. The calcining temperature, the concentration of seashell powder solution, the ultrasound treatment time and the diffusion time were studied as experiment factors to optimize the best antibacterial conditions. The results showed that the best antibacterial conditions were as follows: the calcining temperature was 1100 ℃, the concentration of seashell powder solution was 1%, the ultrasound treatment time was 15 min and the diffusion time was 16 h (E. coli) and 24 h (Staphylococcus aureus).Keyword high-temperature calcinations; seashell powder; E. coli; antibacterial Staphylococcus aureus
贝壳是软体动物的外套膜，具有一种特殊的腺细胞，其分泌物可形成保护身体柔软部分的钙化物，称为贝壳。我国海域辽阔，是海洋贝类的生产大国，近年来，贝类的养殖和加工成为沿海和海岛经济发展的重要组成部分，我国贝类的产量和加工量每年已达到数百万吨甚至上千万吨之多[1]。贝壳资源极其丰富且品种繁多，但同时产生大量的废弃物，每年都有数百万吨的空贝壳被丢弃在海岸边。大量的贝壳严重污染了环境，破坏了海岸边应有的景色，贝壳污染已成为沿海地区亟待解决的环境问题之一，如何回收利用这些贝壳资源成为我们关注的的问题。
从海洋贝壳中提取的天然保鲜剂也具有较好的抗菌保鲜作用[2-3]。在目前的研究中，将贝壳粉采用高温灼烧后制取活性氧化钙，并以常见食品为保鲜材料，就活性氧化钙的制作及其抑菌作用做了初步探讨[4]。还有比较了不同贝壳煅烧物对猪瘦肉和豆腐干的防腐效果[5]。截至发稿前尚未见系统地研究贝壳粉煅烧物的抑菌效果并对其抑菌条件进行优化的报道。本研究先验证了贝壳粉的抑菌效果，进而改进了抑菌试验方法，同时优化了试验条件，确定了高温煅烧贝壳粉适宜的抑菌条件。为回收利用贝壳资源、开发新型天然生物保鲜剂提供了理论依据。
1 材料、仪器与方法
1.1 材料与试剂
材料：海湾扇贝，丰瑞水产食品有限公司提供；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，本实验室保藏菌种。
试剂：营养琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂；氧化钙，国产分析纯试剂，水为无菌水。1.2 试验仪器与设备
高温马福炉（SX2-2.5-12型）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；四两装高速中药粉碎机（QE-200g型）：武义县屹立工具有限公司；超声波破碎仪（JY-150B型）：北京天恩翰拓科技有限公司；漩涡混合器（QL-861型）：海门市麒麟医用仪器厂；电热鼓风干燥箱（101-0型）：天津市泰斯特仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-1F型）：苏州安泰空气技术有限公司，不锈钢手提式灭菌器（DSX-280A型）：上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱（DH3600Ⅱ型）：天津市泰斯特仪器有限公司；牛津杯（6 mm×7.8 mm×10 mm）：石家庄伟天科学仪器设备有限公司。1.3 试验方法1.3.1 贝壳粉制备
材料预处理：将海湾扇贝于适量水中煮至扇贝自然开口，取出扇贝闭壳肌、内脏等内容物，将贝壳冲洗干净，于自然条件下晾干，称取适量于四两装高速中药粉碎机中粉碎5 min，粉碎3次，过80目筛，备用。
高温煅烧：称取适量粉碎好的贝壳粉于10个坩埚
*通讯作者
研究探讨
中，每2个坩埚设为一组，每组温度分别为900 ℃，950 ℃，1 000 ℃，1 050 ℃，1 100 ℃，煅烧温度为2 h。然后将贝壳粉在电热干燥箱中干燥至恒重，放置于干燥器中。通过称量贝壳粉煅烧前后质量，计算贝壳粉失重率，计算得失重率为44.25%。根据相关文献[6]知，贝壳粉煅烧完全。1.3.2 抑菌剂制备
取无菌小试管，分别将在5个不同温度下煅烧的贝壳粉用无菌水配制成浓度为0.031 2%、0.062 5%、0.125%、0.25%、0.5%，1%的悬浊液10 mL。并将配制好的贝壳粉抑菌剂在超声波破碎仪中处理一定时间和不做超声处理作为对照。同时配制同样浓度的CaO作为对照。
1.3.3 受试菌准备
将实验室保藏菌种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行活化，配制成菌悬液[7]，并控制细菌总数在105 cfu/mL～106 cfu/mL，作为试验受试菌。参照GB/T47892-2003菌落总数测定方法[8]。1.3.4 抑菌性能测定试验
通过抑菌圈试验、最小抑菌浓度测定试验及抑菌率测定试验评价高温煅烧贝壳粉的抑菌作用。1.3.4.1 抑菌圈试验
本试验采用琼脂扩散法的牛津杯法评价贝壳粉抑菌剂的抑菌活力。通过抑菌圈直径的大小确定抗菌剂抗菌能力的强弱[9]。
用吸管准确量取预先配制好的营养琼脂培养基20 mL，加入内径一致并预先水平放置的培养皿内，凝固后并使培养皿中水分干燥透。取200 μL的受试菌悬液在平板上并用无菌玻耙涂布均匀，涂布后以平板无可见水滴为准，此时的平板立刻进行抑菌试验。用无菌镊子将灭菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的培养皿中均匀地放置4只牛津杯。用移液枪精准吸取一定浓度的贝壳粉抑菌剂200 μL至牛津杯中，注意不要将菌悬液溢出牛津杯外。同时吸取无菌水和同样浓度的CaO溶液至牛津杯中作为对照。将加入抑菌剂的培养皿在3 ℃～4 ℃冰箱中静置一定时间（即做扩散处理）和不做扩散处理作为对照，然后在受试菌最适生长温度37℃下，培养24 h，拍照并测量抑菌圈直径。平行试验3次，求其平均值，试验重复2次。1.3.4.2 最小抑菌浓度（MIC)测定试验
根据最小抑菌浓度测定试验原理[9]，将不同浓度的抗菌剂分别溶解于含100 mL已灭菌的营养肉汤培养基的锥形瓶中，移取一定量的已知浓度的菌悬液分别接种于含抗菌剂的营养肉汤培养基的锥形瓶中，作为试验组；以同样方法移取一定量的已知浓度的菌悬液接种于不含抗菌剂的锥形瓶中，作为阳性对照组；取只含有100 mL营养肉汤培养基的锥形瓶，不接种试验菌，作为阴性对照组。试验前已计算出试验菌悬液的
浓度，应使试验组和阳性对照组的锥形瓶中接种的试验菌浓度为5×105～5×106 cfu/mL，并对阳性对照组进行0 h活菌计数（0小时活菌计数用来确定试验菌的准确浓度及作为判定MIC的参考）。最后将试验组、阳性对照组、阴性对照组及0 h活菌计数的培养皿同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养24 h，观察结果。
当阳性对照组有细菌生长(混浊)，阴性对照组无菌生长(透明)，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗菌剂浓度，即为该抗菌剂对受试菌的MIC。1.3.4.3 抑菌率的测定
将盛有10 mL煅烧物悬液的三角瓶放于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，使三角瓶中的悬浮液保持均匀稳定。再将100 μL菌悬液注入上述三角瓶中，从三角瓶中取出100 μL液体，立即注入9.9 mL生理盐水中稀释,振荡均匀。从上述生理盐水中取出1 mL，采用平板稀释法测定残留的细菌数，于37 ℃培养24 h计算菌落数。同时做一对照试验(即用未经任何处理的受试
菌铺平板，计算菌落数)，以计算抑菌率。
2 结果与讨论
2.1 抑菌圈直径和最小抑菌浓度
由培养基扩散法初步确定抑菌剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌能力大小，结果以抑菌圈直径大小（单位mm）表示，见表1、图1、图2。
表1 不同浓度抑菌剂的抑菌圈直径
9000.062 5
0.1250.250.51
9500.062 5
0.1250.250.51
10000.062 5
0.1250.250.51
10500.062 5
0.1250.250.51
11000.062 5
0.1250.250.51
CaO悬液0.062 5
0.1250.250.51
5.866.386.607.667.949.6410.1812.2414.0616.226.727.067.388.128.6610.8210.9613.6214.9417.527.027.877.708.768.8611.3011.2415.3615.8419.027.808.848.5210.069.8012.4812.2016.0416.6819.868.429.689.1610.9610.5013.4212.9617.1216.9821.026.867.027.528.068.6012.8811.0414.9615.1618.68
根据文献[10]中对抑菌作用的判断：抑菌圈直径
小于或等于7 mm者，判为无抑菌作用；抑菌圈直径大
研究探讨
于7 mm者，有弱抑菌作用；抑菌圈在10～20 mm者，有中等抑菌作用；抑菌圈直径大于20 mm者，有强抑菌作用。由表1可知，贝壳粉抑菌剂有抑菌作用，且不同煅烧温度及不同浓度的抑菌剂抑菌效果不同。
图1 贝壳粉煅烧物对大肠杆菌抑菌效果图
图3 煅烧温度对抑菌效果的影响
2.2.2 贝壳粉浓度对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000 ℃，配制浓度为0.062 5%，0.125%，0.25%，0.5%，1%的抑菌剂在超声波破碎仪中破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图4所示）。可以看出，随着浓度的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，但从食品防腐剂添加范围和节省成本角度
考虑，确定抑菌剂浓度1%为最佳试验条件。
（注：图中1，2为抑菌剂，3为无菌水，4为CaO悬液）
图2 贝壳粉煅烧物对金黄色葡萄球菌抑菌效果图由营养肉汤稀释法测试抗菌剂抑菌性能，可测定配合物的最小抑菌浓度(MIC)，数据见表2。
表2 最小抑菌浓度和抑菌率
菌种大肠杆菌金黄色葡萄球菌
最小抑菌浓度/(mg・mL-1)
760680
抑菌率/%92.495.5
根据文献[11]最小抑菌浓度低于800 μg/mL即认为有抗菌作用，最小抑菌浓度越小则表明抗菌剂的抗菌性能越好。抑菌试验结果表明，该抗菌剂对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于对大肠杆菌的抑菌效果。
通过以上试验结果，可证明所制备的物质可以作为抑菌剂使用。为了进一步提高抑菌效果，将贝壳粉悬液进行超声波破碎及对加入抑菌剂的平皿做扩散处理，并与常规抑菌方法进行比较。以煅烧温度、煅烧时间、贝壳粉浓度、超声时间以及扩散时间为单因素，进行正交试验，确定最佳试验条件。2.2 单因素试验
2.2.1 煅烧温度对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为900 ℃，950 ℃，1 000 ℃，1 050 ℃，1 100 ℃的贝壳粉，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图3所示）。可以看出，随着煅烧温度的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当温度达到1 050 ℃以上时，抑菌圈直径增加缓慢。因此为了节
约能源，确定煅烧温度1 050℃为最佳试验条件。
图4 抑菌剂浓度对抑菌效果的影响
2.2.3 超声破碎时间对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000℃，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中分别破碎10，15，20，25，30 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间为24 h，得到结果（如图5所示）。可以看出，随着超声破碎时间的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当时间达到20 min以上时，抑菌圈直径都开始
减小。因此确定破碎时间15 min为最佳试验条件。
图5 超声破碎时间对抑菌效果的影响
2.2.4 扩散时间对抑菌效果的影响
取煅烧温度分别为1 000 ℃，配制浓度为0.5%的抑菌剂在超声波破碎仪中分别破碎20 min，接下来处理见1.3.4.1，扩散处理的时间分别为8 h，16 h，24 h，32 h，40 h，得到结果（如图6示）。可以看出，随着扩散时间的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都增加，当时间达到24 h以上时，抑菌圈直径增加缓慢。因此确定扩散时间24 h为最佳试验条件。2.3 正交试验
为确定在多因素条件下的最佳煅烧温度、贝壳粉浓度、超微粉碎时间、扩散时间，进行正交试验选用
研究探讨
L9(34)正交表进行试验方案设计，因素水平见表3，试
验结果如表4所示。
（注：图中1，2为抑菌剂，3为无菌水，4为CaO悬液）
图6 时间对抑菌效果的影响表3 正交试验因素水平表
水平123
A煅烧温度/℃B扩散时间/hC贝壳粉浓度/%D超声破碎时间/min
1 000160.5101 050240.75151 10032120
图8 贝壳粉煅烧物对金黄色葡萄球菌抑菌效果图
3 结论与讨论
1) 通过抑菌圈试验、最小抑菌浓度测定试验及抑
菌率测定试验表明贝壳粉有一定的抑菌作用可作为抑菌剂使用。为进一步提高抑菌作用，以贝壳粉煅烧时间、贝壳粉浓度、超声时间以及扩散时间为因素，对抑菌效果进行研究，得出最优试验条件为煅烧温度1 100 ℃、贝壳粉浓度1%，超声粉碎时间15 min以及扩散时间16 h（大肠杆菌）和24 h（金黄色葡萄球菌），大肠杆菌抑菌圈直径17.86 mm金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为22.64 mm。而在此条件下未经超声波粉碎处理和扩散处理的常规抑菌试验的对照中，得到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈平均直径分别为16.86 mm和20.82 mm。这主要由三方面作用引起：一是高温煅烧使贝壳粉在分子结构上发生了特殊的变化，使其具有了更好的稳定性和抑菌效果[12-13]；二是超声波粉碎使贝壳粉粒径变小，使颗粒分散更均匀，更好的溶于抑菌剂溶剂中，单位体积的贝壳粉数量增加，使抑菌效果增加；三是扩散处理在3 ℃～4 ℃条件下作用一定时间，使受试菌处于缓慢生长状态时，而抑菌剂更能充分扩散，然后置于受试菌最适增长温度下培养，使抑菌作用增强。
2) 通过试验可看出贝壳粉煅烧物的抑菌作用优于CaO的抑菌作用，分析其抑菌机理：一是贝壳粉煅烧物引起细菌细胞膜电荷的变化，影响细菌对营养物质的吸收或是渗透进入到微生物细胞内，吸附细胞内带负电的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌[12]；二是贝壳粉煅烧物吸附在微生物细胞表面，形成一层分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到杀菌和抑菌作用；三是通过改变细菌生长环境的pH来抑制受试菌生长繁殖，因此抑菌作用表现的较为迅速而强烈；四是同时钙处理能提高胞外钙水平，补偿胞壁区域钙的损失，对细胞壁细胞膜结构和功能起维护和调节作用，从而使细胞内保持分隔状态，进而对整个代谢过程有调控作用[14]。钙对呼吸作用有关的酶有直接调控作用，从而使呼吸强度下降[15]，最终达到抑菌作用。还有贝壳粉煅烧物中含有铜、锌等具有抑菌作用的微量元素[16]，增强了抑菌效果。其具体的抑菌机理还需要进一步探讨。
表4 正交试验表L9(34)
试验号
试验因素抑菌圈直径 /mm
ABCDⅠⅡ
1111111.68(9.02)11.60(9.08)2122215.88(11.38)15.74(11.30)3133319.22(15.88)19.18(15.76)4212316.32(12.34)16.40(12.38)5223120.28(16.76)20.42(16.80)6231212.62(9.88)12.66(10.00)7313221.88(17.88)21.92(17.80)8321313.98(10.62)14.06(10.58)9332117.22(13.02)17.26(13.04)K193.30(72.42)99.80(78.50)76.60(59.18)98.46(77.72)K298.70(78.16)100.36(77.44)98.82(73.46)100.70(78.24)K3106.32(82.94)98.16(77.58)122.90(100.88)99.16(77.56)115.55(12.07)16.63(13.08)12.77(9.86)16.41(12.95)216.45(13.03)16.75(12.91)16.47(12.24)16.78(13.04)317.72(13.82)16.36(12.93)20.48(16.81)16.52(12.93)R2.17(1.75)0.39(0.17)7.71(6.95)0.37(0.11)
注：括号内数据为大肠杆菌试验数据，括号外数据为金黄色葡萄球菌试验数据
2.4 验证试验
由表4中的极差分析可知：4种因素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果的影响大小均为：C>A>B>D，根据正交试验抑菌圈直径的大小，可以得出最优的抑菌条件为A3B1C3D2（大肠杆菌，如图7所示）和A3B2C3D2（金黄色葡萄球菌）。但从正交试验结果表中可以看出两种菌的抑菌方案均为A3B1C3D2抑菌圈直径最大，这与对金黄色葡萄球菌的抑菌结果不一致，因此对其进行验证试验。同时进行2次平行试验，测得金黄色葡萄球菌A3B1C3D2方案抑菌圈直径为21.82 mm，A3B2C3D2方案抑菌圈直径为22.64 mm，证实A3B2C3D2最佳组合（如图8所示）。
而在此条件下未经超声波粉碎处理和扩散处理的常规抑菌试验的对照中，得到的大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌抑菌圈平均直径分别为16.86 mm和20.82 mm。
图7 贝壳粉煅烧物对大肠杆菌抑菌效果图
研究探讨
抗坏血酸钙对蚕豆种子采后衰老的影响
张兰1，郑永华2
1. 江苏食品职业技术学院（淮安 223003）；2. 南京农业大学（南京 210095）
摘要研究了不同浓度的抗坏血酸钙处理对蚕豆贮藏期间的生理变化和衰老的影响。结果表明：适当的钙
处理可显著降低蚕豆的呼吸强度，推迟乙烯、Asc-POD高峰的出现，延缓超氧阴离子（O2-）含量的上升保持SOD活性，延缓衰老，减少营养成分VC的下降，从而保持了较好的品质。关键词
蚕豆；抗坏血酸钙；衰老；品质
Effect of Postharvest Calcium Treatment on Broad Bean Senescence
Zhang Lan1, Zheng Yong-hua2
1. Jiangsu Food Science College (Huai’an 223003); 2. Nanjing Agricultural University (Nanjing 210095)
Abstract Calcium ascorbate treatments on postharvest physiology and senescence of fresh broad beans were investigated. Results showed that suitable calcium treatment could significantly reduce respiratory rate, and delay ethylene production and Asc-POD peaks. O2- content was slowly raised, while SOD activity was maintained. Ascorbic acid was slowly decreased and good quality was kept for broad beans.Keywords broad bean; Calcium ascorbate; senescence; quality
钙对果实衰老与生理病害的发生有一定的抑制作用，其重要原因在于钙是膜的稳定剂，维持和保护质膜的结构与功能[1]，抑制苹果果实膜微黏度的升高，使膜外表面硬化[2]，延缓衰老。自由基被认为会导致膜系统损伤，从而促进植物衰老。采后果实经钙盐浸渍或渗入处理，可抑制完整果实的呼吸作用，降低呼吸强度[3]。目前大多数认为，外源钙处理浓度提
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高，抑制呼吸作用的效果增强。在某些情况下，采前喷钙、采后浸钙、渗钙对呼吸作用的影响不大[4]。这种现象产生的原因在于果实Ca2+含量高，足以防止膜完整性的丧失，进一步加强对呼吸的效果不大[5]。另外，采后果实经钙盐处理，可以有效降低其乙烯释放率[6]，渗钙推迟了鳄梨乙烯高峰期出现[7]。
蚕豆种子组织幼嫩，长江一带成熟于5月，气温
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