蛛形学报Acta Arachnologica Sinica , Nov. 2008, 17（2）：124-128ISSN 1005-96282种染色方法在微核试验中的比较
李锐李生才*刘佳罗原
山西农业大学农学院太谷030801
摘要：DNA 存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA 分子的完整性对细胞至关紧要。外界环
微核试验是检测外来化合物对染色体损伤作用的重境和生物体内部的因素都会导致DNA 分子的损伤或改变，
要方法，已在国内外普遍应用。蜘蛛是许多农、林害虫的天敌，在生物防治中起重要作用，保护和利用蜘蛛已成
为生物防治的一项重要内容。本文主要是通过2种染色方法吉姆萨染色法和吖啶橙染色法对蜘蛛血细胞进行
微核试验，比较2种染色方法的优劣。
关键词：星豹蛛；微核；DNA 损伤；吉姆萨染色法；吖啶橙染色法
前言
星豹蛛Pardosa astrigera L. Koch 广泛分布于我省各地，主要活动于干旱地区。能捕食农田、果园以及菜田等多种农作物害虫。它具有种群数量大，分布广，体型较大，捕食量大；成虫寿命长，繁殖力强，游猎性等特点，是农作物害虫的主要捕食性天敌(李锐等，2007) 。
近年来人们对蜘蛛的研究有所加深，但对星豹蛛的DNA 损伤的研究较少。DNA 作为生命活动中最重要的遗传物质，在维护机体的正常功能上有举足轻重的作用。由于DNA 结构特点及半保留复制特性，DNA 分子易出现损伤，引起细胞及机体损害。对DNA 损伤的修复，则是机体抵御各种伤害的基础。当细胞中DNA 受到损伤时，会威胁基因组的完整性，对于这些损伤，由于DNA 结构微小，直接检测过于复杂和困难（吕斌等，2002）。
微核（Micronuclei ）简称（MCN ）是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的（Fench M ，1997）。微核是细胞的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的、嗜色与主核一致、完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核（王昱等，2003）。位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学) 作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA 的能力（余争平等，2000）。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失丝粒的断片产生的（高雪等，2004）。微核实验作为快速检测体内染色体畸变的方法，已广泛应用于遗传、食品、药物、环境等很多领域，并以其简便、迅速、敏感为优点，广泛用于辐射损伤、工业管理、药物筛选以及血液学等工作的研究（曹佳，2000）。
吉姆萨（Giemsa ）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，为中性物质。
吖啶橙（Acridine Orange ，AO ）是1种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm ，阻断滤光片波长515nm 。它与细胞中DNA 和RNA 结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA 结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO 常与溴化乙啶EB 合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。吖啶橙染色*通迅作者（Correspond auther ）, E-mail:[email protected]
收稿日期（Received ）:2008-08-08
山西省青年基金（2008021041）、山西省科技攻关项目（[1**********]，2006031048）资助
Nov., 2008李锐等：2种染色方法在微核试验中的比较１２５法：该方法属于荧光染色法的一种，吖啶橙可插入DNA 和双链RNA 的双螺旋结构内的碱基对之间，此染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸性磷酸基团之间借静电结合（王天有等，2006）。
本文采用微核实验方法来检测蜘蛛血细胞DNA 的损伤作用，同时比较了2种染色方法对对试验结果的影响。
1材料与实验方法
1.1材料
1.1.1供试材料
星豹蛛, 供试材料为采自山西农业大学苹果园的星豹蛛，将活体带回实验室，每头蜘蛛分装在1个指形管内，管内放一蘸水的脱脂棉以供蜘蛛饮用。为防外缘DNA 的干扰，标本要饥饿一周，其间每天只
进行实验。喂水。一周后，
2.0%阿维菌素乳油（Avermectins ），山西科峰生物科技有限公司提供。将2.0%阿维菌素乳油与丙酮按体积比1:4000配成0.0005%的浓度。
1.1.2主要仪器及试剂
数显电热恒温水浴箱（北京市长风仪器仪表公司），低温冷冻离心机（SIGMA ），BX51型成像显微镜
），玻璃匀浆器等。（OLYMPUS 公司
Giemsa 原液：取Giemsa 粉0.5g 加入33mL 优质丙三醇于研钵中，充分研磨1h ，然后在56℃温箱中保温2h ，再加入33mL 甲醇，混匀后装入棕色瓶中保存备用，贮存时间越久越好。Giemsa 染色液（染色前临时配制）：100mL PBS 液稀释3~5mL Giemsa 原液
放冰箱备用。吖啶橙染色液：称取0.1g 吖啶橙加蒸馏水100mL 做母液，
其他试剂为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1单细胞悬液的制备
将活体蜘蛛用75%的酒精冲洗3次，再用不锈钢剪刀将其剪碎，加100μL 生理盐水到玻璃匀浆器研磨并过200目筛得单细胞悬液，用苔盼蓝排斥法镜检细胞存活率达95%以上。
1.2.2阿维菌素致DNA 断裂作用的研究
将制成的细胞悬液分装于3支1.5mL 的离心管中，均加入终浓度为0.0005%的阿维菌素溶液，轻轻混匀。3支离心管置于室温下，染毒30min 。重复3次。制成的细胞悬液分装于3支1.5mL 的离心管中，为阴性对照组，将3支离心管置于室温下。重复3次。
1.2.3蜘蛛细胞涂片的制备
将细胞悬浮液在预冷的载玻片上进行涂片。
1.2.4蜘蛛细胞涂片的染色
Giemsa 染色法：将涂有蜘蛛细胞涂片的载玻片用甲醇固定15min ，固定好的细胞涂片待甲醇挥发干净后，再用PBS 液（pH =6.8）稀释的Giemsa(5∶1) ，稀释染色必须用缓冲液，缓冲液pH 值要准确，否则影响染色效果，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。将玻片浸于染色缸中，染色10min 后晾干。PBS 液起到稀释的作用，吉姆萨染液须现用现配。
吖啶橙荧光染色法：将涂有蜘蛛细胞涂片的载玻片用甲醇固定15min ，待甲醇挥发干净后，现配1mL 母液加1/15M 磷酸缓冲液（pH =4.8）9mL ，将玻片浸于染色缸中，染色10min ，晾干。吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA 和RNA 结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA 是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。
1.2.5拍摄蜘蛛细胞图片
吉姆萨染色法：在40×100倍的荧光显微镜下用自然光观察蜘蛛细胞涂片，调焦到蜘蛛细胞形态清晰时，进行拍摄，拍200张图片。
126蛛形学报Acta Arachnologica Sinica Vol. 17No. 2
吖啶橙荧光染色法：于绿色荧光下在40×100倍的荧光显微镜下观察蜘蛛细胞涂片，进行调焦观察。当视野中细胞形态清晰时进行拍摄，拍200张图片。
1.2.6观察分析蜘蛛细胞细胞图片
2种染色方法处理好的蜘蛛细胞图片的观察。从未染毒的蜘蛛细胞图片找出细胞分布集中，染色均匀、清晰、背景杂质少的进行分析；将染毒的蜘蛛细胞图片挑选微核多而明显，分布均匀集中的图片以便于观察。
1.2.7微核的鉴别
微核位于细胞质中，与主细胞核分开；形状呈圆形或椭圆形，边缘光滑；染色性质与主细胞核一致；大小为主核的1/3（将含有多个微核的细胞记为一个微核细胞）。
2结果与分析
2.1对照组2种染色方法的比较
图1吉姆萨染色法观察对照组蜘蛛血细胞结构图2吖啶橙染色法观察对照组蜘蛛血细胞结构Fig. 1Hemocytes structures of Pardosa astrigera of
control groups observed by giemsa
staining Fig. 2Hemocytes structures of Pardosa astrigera of control groups observed by acridine orange
staining
图1为吉姆萨染色后蜘蛛血细胞在显微镜下观察图片，可以看出蜘蛛细胞明显，杂质少，整个细胞染色清晰，细胞核被染成深紫色，细胞膜透明。细胞的形态结构清晰，细胞膜和细胞核边界清楚，能很好的区分核与胞质。这种染色方法对胞核着色好，细胞核染色均匀，能够提供优良的对比染色，呈现出清晰的细胞图，观察效果好。
图3吉姆萨染色法观察阿维菌素处理组蜘蛛血细胞微图4吖啶橙染色法观察阿维菌素处理组蜘蛛血细胞微核核结构
Fig. 3Hemocytes micronuclei structures of Pardosa as －
trigera of avermectins treated groups observed by giemsa
staining 结构Fig. 4Hemocytes micronuclei structures of Pardosa as －trigera of avermectins treated groups observed by acridine orange
staining
Nov., 2008李锐等：2种染色方法在微核试验中的比较１２７
由图2为吖啶橙染色染色后蜘蛛血细胞在荧光显微镜下观察图片，可以看出蜘蛛细胞被荧光染料吖啶橙染色后，整个蜘蛛细胞呈现红色，细胞荧光一致，杂质较少。细胞的细胞膜和细胞核边界较模糊，分界不明显，不能很好的区分核与胞质，染色对比不是很明显，观察不是很清晰。
2.2阿维菌素处理组2种染色方法的比较
图3为0.0005%的阿维菌素溶液处理的蜘蛛血细胞用吉姆萨染色法染色后，观察得细胞微核结构图。阿维菌素处理后，蜘蛛血细胞DNA 发生损伤，出现微核，可以看到细胞形态发生明显变化，染色时间对吉姆萨染色效果有影响，时间太短如染色5~7min ，整个载玻片着色不好，效果不明显，整个细胞染成浅紫色，发生微核的细胞区分不明显；如果染色时间太长，则染色太深，会使整个细胞都成深紫色，观察不出细胞膜和细胞核的边界和细胞核分成的小核，同样也影响观察效果；染色10min 可获得满意效果，
细胞膜透明，细胞核分裂成2个或者镜下观察，细胞着色深，轮廓分明。可以看到细胞核被染成紫红色，
以上的小核，整个玻片看起来比较清晰。
图4为0.0005%的阿维菌素溶液处理的蜘蛛血细胞用吖啶橙染色法染色后，观察得细胞微核结构图。阿维菌素处理后，蜘蛛血细胞DNA 发生损伤出现微核，蜘蛛细胞在荧光显微镜下成椭圆型，细胞内有完全与主核分开或未分开的圆形或椭圆形微小核。细胞荧光一致，整个细胞被染成红色，染料杂质少，分辨率高，形态清晰，很容易找到，同时也便于计算微核细胞率。但染色的细胞膜和细胞核边界模糊，不能很好的区分核与胞质，着色对比不是很明显，在观察时需闭光。
3小结与讨论
3.12种染色方法优缺比较
吉姆萨染色灵敏度高，样品需量少，便宜，便于应用及耗时短程序简单，省时省事，染料配方简单，久
染色的细胞显微图像清晰，容易观察和判定。染色后的涂片如经脱水、封固可长期保置不影响染色效果。
存，有利于进行学术交流或作回顾性诊断。缺点是这种染色方法和其他常规的快速染色法均可产生人为
色素会附着在细胞上。假象(吉姆萨色素沉着) ，
吖啶橙染色法，染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸性磷酸基团之间借静电结合。因此，它具有特异性强，检出率高，不易受细胞形态学变化的影响等特点。即使细胞的数量较少，以常规染色法难以做出诊断的标本，使用吖啶橙染色时，呈现明亮染色的细胞也容易与暗色的背景区别开来，从而做出明确诊断。该方法的不足之处是以荧光染料染色的标本不易保存，难以作回顾性诊断。要求条件较高，只能在实验室进行。研究结果表明，用吖啶橙染色法的检出率更高，荧光显微镜检查可见典型的凋亡形态。这种方法不仅可看到细胞的形状，而且能同时看到细胞核。是一种较好的染色方法。
3.22种染色方法的影响因素
PH 值对细胞染色效果有一定的影响作用。吉姆萨染色时，细胞中含有蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH 而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏酸性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用的载玻片必须清洁，无酸碱污染。配制时必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
染色时间长短对染色效果有一定的影响。本实验表明，细胞的颜色与染色时间有密切关系，时间长则染色深，这是因为吉姆萨染色液由天青及伊红组成，天青游离时带正电荷，伊红游离时带负电荷，被染物的主要成分为蛋白质，蛋白质本身带2种电荷，在碱性液体中所带负电荷增加，天青离子附着得多些，细胞则较蓝；时间太短，整个载玻片着色不好，发生微核的细胞区分不明显，整个细胞成浅紫色；浸染10分钟左右才能获得满意的效果。吖啶橙是荧光染料，染色的荧光会在短时间内发生淬灭，这种淬灭会在短时间内对实验结果有一定的影响，所以要求实验过程和观察要迅速。我们在实验观测时采用先在镜下对选定视野进行拍照，再在图像上进行细胞计数的方法，能够减少淬灭对结果造成的影响（吴娣等，2003）。
本文比较了2种染色方法的优缺点，筛选出适合于研究蜘蛛DNA 损伤比较理想的染色方法；微核
128蛛形学报Acta Arachnologica Sinica Vol. 17No. 2试验是反映染色体损伤的重要试验方法，具有简便、迅速、敏感等优点，从而为检测DNA 损伤提供了方便、快捷的方法。而DNA 损伤的研究不仅可以用于蜘蛛，也可以用于昆虫、节肢动物甚至人类健康与疾病的研究。希望本实验可以对DNA 损伤的研究提供有效方法，对生物的研究提供可靠的实验依据，为以后的学者进行深入研究提供参考。
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Comparison of Two Kinds of Staining Methods for Micro-nuclear Test
LI Rui, LI Sheng-Cai, LIU Jia and LUO Yuan
College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract ：DNA is the storehouse of genetic information for all organisms' survival and reproduction, so maintaining DNA integrity is crucial for cell survival. The external environment and internal factors organisms are often led to DNA molecules injury or change. Micro-nuclear test is an important method to detect the damage of foreign compounds to chromosome, which has been widely used at home and abroad. Spider is a kind of natural enemy of agricultural and forest pests, play an important role in biological control, protection and utilization of spiders has become an important part of biological control. This paper was used in two ways Giemsa staining and acridine orange staining to spider hemocytes for micro-nuclear tests, comparing the pros and cons of the two stainings.
Key words:Pardosa astrigera ; Micro-nuclear; DNA damage; Giemsa staining; Acridine orange staining
蛛形学报Acta Arachnologica Sinica , Nov. 2008, 17（2）：124-128ISSN 1005-96282种染色方法在微核试验中的比较
李锐李生才*刘佳罗原
山西农业大学农学院太谷030801
摘要：DNA 存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA 分子的完整性对细胞至关紧要。外界环
微核试验是检测外来化合物对染色体损伤作用的重境和生物体内部的因素都会导致DNA 分子的损伤或改变，
要方法，已在国内外普遍应用。蜘蛛是许多农、林害虫的天敌，在生物防治中起重要作用，保护和利用蜘蛛已成
为生物防治的一项重要内容。本文主要是通过2种染色方法吉姆萨染色法和吖啶橙染色法对蜘蛛血细胞进行
微核试验，比较2种染色方法的优劣。
关键词：星豹蛛；微核；DNA 损伤；吉姆萨染色法；吖啶橙染色法
前言
星豹蛛Pardosa astrigera L. Koch 广泛分布于我省各地，主要活动于干旱地区。能捕食农田、果园以及菜田等多种农作物害虫。它具有种群数量大，分布广，体型较大，捕食量大；成虫寿命长，繁殖力强，游猎性等特点，是农作物害虫的主要捕食性天敌(李锐等，2007) 。
近年来人们对蜘蛛的研究有所加深，但对星豹蛛的DNA 损伤的研究较少。DNA 作为生命活动中最重要的遗传物质，在维护机体的正常功能上有举足轻重的作用。由于DNA 结构特点及半保留复制特性，DNA 分子易出现损伤，引起细胞及机体损害。对DNA 损伤的修复，则是机体抵御各种伤害的基础。当细胞中DNA 受到损伤时，会威胁基因组的完整性，对于这些损伤，由于DNA 结构微小，直接检测过于复杂和困难（吕斌等，2002）。
微核（Micronuclei ）简称（MCN ）是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的（Fench M ，1997）。微核是细胞的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的、嗜色与主核一致、完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核（王昱等，2003）。位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学) 作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA 的能力（余争平等，2000）。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失丝粒的断片产生的（高雪等，2004）。微核实验作为快速检测体内染色体畸变的方法，已广泛应用于遗传、食品、药物、环境等很多领域，并以其简便、迅速、敏感为优点，广泛用于辐射损伤、工业管理、药物筛选以及血液学等工作的研究（曹佳，2000）。
吉姆萨（Giemsa ）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，为中性物质。
吖啶橙（Acridine Orange ，AO ）是1种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm ，阻断滤光片波长515nm 。它与细胞中DNA 和RNA 结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA 结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO 常与溴化乙啶EB 合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。吖啶橙染色*通迅作者（Correspond auther ）, E-mail:[email protected]
收稿日期（Received ）:2008-08-08
山西省青年基金（2008021041）、山西省科技攻关项目（[1**********]，2006031048）资助
Nov., 2008李锐等：2种染色方法在微核试验中的比较１２５法：该方法属于荧光染色法的一种，吖啶橙可插入DNA 和双链RNA 的双螺旋结构内的碱基对之间，此染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸性磷酸基团之间借静电结合（王天有等，2006）。
本文采用微核实验方法来检测蜘蛛血细胞DNA 的损伤作用，同时比较了2种染色方法对对试验结果的影响。
1材料与实验方法
1.1材料
1.1.1供试材料
星豹蛛, 供试材料为采自山西农业大学苹果园的星豹蛛，将活体带回实验室，每头蜘蛛分装在1个指形管内，管内放一蘸水的脱脂棉以供蜘蛛饮用。为防外缘DNA 的干扰，标本要饥饿一周，其间每天只
进行实验。喂水。一周后，
2.0%阿维菌素乳油（Avermectins ），山西科峰生物科技有限公司提供。将2.0%阿维菌素乳油与丙酮按体积比1:4000配成0.0005%的浓度。
1.1.2主要仪器及试剂
数显电热恒温水浴箱（北京市长风仪器仪表公司），低温冷冻离心机（SIGMA ），BX51型成像显微镜
），玻璃匀浆器等。（OLYMPUS 公司
Giemsa 原液：取Giemsa 粉0.5g 加入33mL 优质丙三醇于研钵中，充分研磨1h ，然后在56℃温箱中保温2h ，再加入33mL 甲醇，混匀后装入棕色瓶中保存备用，贮存时间越久越好。Giemsa 染色液（染色前临时配制）：100mL PBS 液稀释3~5mL Giemsa 原液
放冰箱备用。吖啶橙染色液：称取0.1g 吖啶橙加蒸馏水100mL 做母液，
其他试剂为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1单细胞悬液的制备
将活体蜘蛛用75%的酒精冲洗3次，再用不锈钢剪刀将其剪碎，加100μL 生理盐水到玻璃匀浆器研磨并过200目筛得单细胞悬液，用苔盼蓝排斥法镜检细胞存活率达95%以上。
1.2.2阿维菌素致DNA 断裂作用的研究
将制成的细胞悬液分装于3支1.5mL 的离心管中，均加入终浓度为0.0005%的阿维菌素溶液，轻轻混匀。3支离心管置于室温下，染毒30min 。重复3次。制成的细胞悬液分装于3支1.5mL 的离心管中，为阴性对照组，将3支离心管置于室温下。重复3次。
1.2.3蜘蛛细胞涂片的制备
将细胞悬浮液在预冷的载玻片上进行涂片。
1.2.4蜘蛛细胞涂片的染色
Giemsa 染色法：将涂有蜘蛛细胞涂片的载玻片用甲醇固定15min ，固定好的细胞涂片待甲醇挥发干净后，再用PBS 液（pH =6.8）稀释的Giemsa(5∶1) ，稀释染色必须用缓冲液，缓冲液pH 值要准确，否则影响染色效果，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。将玻片浸于染色缸中，染色10min 后晾干。PBS 液起到稀释的作用，吉姆萨染液须现用现配。
吖啶橙荧光染色法：将涂有蜘蛛细胞涂片的载玻片用甲醇固定15min ，待甲醇挥发干净后，现配1mL 母液加1/15M 磷酸缓冲液（pH =4.8）9mL ，将玻片浸于染色缸中，染色10min ，晾干。吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA 和RNA 结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA 是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。
1.2.5拍摄蜘蛛细胞图片
吉姆萨染色法：在40×100倍的荧光显微镜下用自然光观察蜘蛛细胞涂片，调焦到蜘蛛细胞形态清晰时，进行拍摄，拍200张图片。
126蛛形学报Acta Arachnologica Sinica Vol. 17No. 2
吖啶橙荧光染色法：于绿色荧光下在40×100倍的荧光显微镜下观察蜘蛛细胞涂片，进行调焦观察。当视野中细胞形态清晰时进行拍摄，拍200张图片。
1.2.6观察分析蜘蛛细胞细胞图片
2种染色方法处理好的蜘蛛细胞图片的观察。从未染毒的蜘蛛细胞图片找出细胞分布集中，染色均匀、清晰、背景杂质少的进行分析；将染毒的蜘蛛细胞图片挑选微核多而明显，分布均匀集中的图片以便于观察。
1.2.7微核的鉴别
微核位于细胞质中，与主细胞核分开；形状呈圆形或椭圆形，边缘光滑；染色性质与主细胞核一致；大小为主核的1/3（将含有多个微核的细胞记为一个微核细胞）。
2结果与分析
2.1对照组2种染色方法的比较
图1吉姆萨染色法观察对照组蜘蛛血细胞结构图2吖啶橙染色法观察对照组蜘蛛血细胞结构Fig. 1Hemocytes structures of Pardosa astrigera of
control groups observed by giemsa
staining Fig. 2Hemocytes structures of Pardosa astrigera of control groups observed by acridine orange
staining
图1为吉姆萨染色后蜘蛛血细胞在显微镜下观察图片，可以看出蜘蛛细胞明显，杂质少，整个细胞染色清晰，细胞核被染成深紫色，细胞膜透明。细胞的形态结构清晰，细胞膜和细胞核边界清楚，能很好的区分核与胞质。这种染色方法对胞核着色好，细胞核染色均匀，能够提供优良的对比染色，呈现出清晰的细胞图，观察效果好。
图3吉姆萨染色法观察阿维菌素处理组蜘蛛血细胞微图4吖啶橙染色法观察阿维菌素处理组蜘蛛血细胞微核核结构
Fig. 3Hemocytes micronuclei structures of Pardosa as －
trigera of avermectins treated groups observed by giemsa
staining 结构Fig. 4Hemocytes micronuclei structures of Pardosa as －trigera of avermectins treated groups observed by acridine orange
staining
Nov., 2008李锐等：2种染色方法在微核试验中的比较１２７
由图2为吖啶橙染色染色后蜘蛛血细胞在荧光显微镜下观察图片，可以看出蜘蛛细胞被荧光染料吖啶橙染色后，整个蜘蛛细胞呈现红色，细胞荧光一致，杂质较少。细胞的细胞膜和细胞核边界较模糊，分界不明显，不能很好的区分核与胞质，染色对比不是很明显，观察不是很清晰。
2.2阿维菌素处理组2种染色方法的比较
图3为0.0005%的阿维菌素溶液处理的蜘蛛血细胞用吉姆萨染色法染色后，观察得细胞微核结构图。阿维菌素处理后，蜘蛛血细胞DNA 发生损伤，出现微核，可以看到细胞形态发生明显变化，染色时间对吉姆萨染色效果有影响，时间太短如染色5~7min ，整个载玻片着色不好，效果不明显，整个细胞染成浅紫色，发生微核的细胞区分不明显；如果染色时间太长，则染色太深，会使整个细胞都成深紫色，观察不出细胞膜和细胞核的边界和细胞核分成的小核，同样也影响观察效果；染色10min 可获得满意效果，
细胞膜透明，细胞核分裂成2个或者镜下观察，细胞着色深，轮廓分明。可以看到细胞核被染成紫红色，
以上的小核，整个玻片看起来比较清晰。
图4为0.0005%的阿维菌素溶液处理的蜘蛛血细胞用吖啶橙染色法染色后，观察得细胞微核结构图。阿维菌素处理后，蜘蛛血细胞DNA 发生损伤出现微核，蜘蛛细胞在荧光显微镜下成椭圆型，细胞内有完全与主核分开或未分开的圆形或椭圆形微小核。细胞荧光一致，整个细胞被染成红色，染料杂质少，分辨率高，形态清晰，很容易找到，同时也便于计算微核细胞率。但染色的细胞膜和细胞核边界模糊，不能很好的区分核与胞质，着色对比不是很明显，在观察时需闭光。
3小结与讨论
3.12种染色方法优缺比较
吉姆萨染色灵敏度高，样品需量少，便宜，便于应用及耗时短程序简单，省时省事，染料配方简单，久
染色的细胞显微图像清晰，容易观察和判定。染色后的涂片如经脱水、封固可长期保置不影响染色效果。
存，有利于进行学术交流或作回顾性诊断。缺点是这种染色方法和其他常规的快速染色法均可产生人为
色素会附着在细胞上。假象(吉姆萨色素沉着) ，
吖啶橙染色法，染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸性磷酸基团之间借静电结合。因此，它具有特异性强，检出率高，不易受细胞形态学变化的影响等特点。即使细胞的数量较少，以常规染色法难以做出诊断的标本，使用吖啶橙染色时，呈现明亮染色的细胞也容易与暗色的背景区别开来，从而做出明确诊断。该方法的不足之处是以荧光染料染色的标本不易保存，难以作回顾性诊断。要求条件较高，只能在实验室进行。研究结果表明，用吖啶橙染色法的检出率更高，荧光显微镜检查可见典型的凋亡形态。这种方法不仅可看到细胞的形状，而且能同时看到细胞核。是一种较好的染色方法。
3.22种染色方法的影响因素
PH 值对细胞染色效果有一定的影响作用。吉姆萨染色时，细胞中含有蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH 而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏酸性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用的载玻片必须清洁，无酸碱污染。配制时必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
染色时间长短对染色效果有一定的影响。本实验表明，细胞的颜色与染色时间有密切关系，时间长则染色深，这是因为吉姆萨染色液由天青及伊红组成，天青游离时带正电荷，伊红游离时带负电荷，被染物的主要成分为蛋白质，蛋白质本身带2种电荷，在碱性液体中所带负电荷增加，天青离子附着得多些，细胞则较蓝；时间太短，整个载玻片着色不好，发生微核的细胞区分不明显，整个细胞成浅紫色；浸染10分钟左右才能获得满意的效果。吖啶橙是荧光染料，染色的荧光会在短时间内发生淬灭，这种淬灭会在短时间内对实验结果有一定的影响，所以要求实验过程和观察要迅速。我们在实验观测时采用先在镜下对选定视野进行拍照，再在图像上进行细胞计数的方法，能够减少淬灭对结果造成的影响（吴娣等，2003）。
本文比较了2种染色方法的优缺点，筛选出适合于研究蜘蛛DNA 损伤比较理想的染色方法；微核
128蛛形学报Acta Arachnologica Sinica Vol. 17No. 2试验是反映染色体损伤的重要试验方法，具有简便、迅速、敏感等优点，从而为检测DNA 损伤提供了方便、快捷的方法。而DNA 损伤的研究不仅可以用于蜘蛛，也可以用于昆虫、节肢动物甚至人类健康与疾病的研究。希望本实验可以对DNA 损伤的研究提供有效方法，对生物的研究提供可靠的实验依据，为以后的学者进行深入研究提供参考。
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Comparison of Two Kinds of Staining Methods for Micro-nuclear Test
LI Rui, LI Sheng-Cai, LIU Jia and LUO Yuan
College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract ：DNA is the storehouse of genetic information for all organisms' survival and reproduction, so maintaining DNA integrity is crucial for cell survival. The external environment and internal factors organisms are often led to DNA molecules injury or change. Micro-nuclear test is an important method to detect the damage of foreign compounds to chromosome, which has been widely used at home and abroad. Spider is a kind of natural enemy of agricultural and forest pests, play an important role in biological control, protection and utilization of spiders has become an important part of biological control. This paper was used in two ways Giemsa staining and acridine orange staining to spider hemocytes for micro-nuclear tests, comparing the pros and cons of the two stainings.
Key words:Pardosa astrigera ; Micro-nuclear; DNA damage; Giemsa staining; Acridine orange staining