中兽医医药杂志 J TCV M
2004年第5期ξλ
甘肃棘豆化学成分研究
Ⅰ. 碱水氯仿提取部位成分分析
童德文, 赵宝玉, 廉士刚, 樊泽峰
(西北农林科技大学动物科技学院, 陕西杨凌712100)
摘 要: 将甘肃棘豆草粉用甲醇浸提, 浓缩浸提液后,1mol/l 的盐酸酸解, 抽滤, 所得酸水液首先用氯仿萃取8次后, 然后用NaOH 碱化, 最后碱水液经氯仿萃取4次后所得氯仿液减压浓缩即得碱水氯仿提取部位。取碱水氯仿提取部位2216g , 在氯仿-乙酸乙酯-甲醇洗脱体系下, 柱层析梯度洗脱进行分离, 每30ml 收集1份, 共收集721份, TLC 检测, 合并同类, 得晶体Ⅰ, 对晶体Ⅰ进行了分光光度和TLC 鉴定。对碱水氯仿提取部位进行气质联用分析, 共有20种成分, 确定了结构的成分有10种, 分别是生物碱1种、酯6种、醇1种、芳香烃1种、脂肪酸1种, 其它10种成分的结构还待进一步分析确定。 关键词: 甘肃棘豆; TLC ; 柱层析
中图分类号:S85918 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2004) 05-0013-04 甘肃棘豆(Oxyt ropis kansuensis Bunge. ) 为多年生豆科棘2 试验方法
豆属草本植物, 是疯草(locoweed ) 的一种, 广泛分布于宁夏、2. 1
甘肃棘豆中碱水氯仿部位的提取
内蒙古、甘肃东部和南部、四川西部、云南西北部及青海西部和南部, 马、牛、羊采食后引起以神经症状为主的慢性中毒,
称“疯草病”
(Locodisease ) , 给畜牧业生产造成巨大损失, 是目前我国西部牧区危害最严重的毒草之一1～4。我国对疯草中毒的研究始于70年代末期, 经过多年的研究, 国内学者认为疯草中毒的主要毒性成分为生物碱, 目前在疯草中已分离鉴定出的生物碱主要有吲哚兹啶类生物碱、喹喏里西啶类生物碱和哌啶类生物碱5～9。本试验在醇类提取法分离苦马豆素的基础上, 试图通过柱层析分离甘肃棘豆碱性氯仿提取部位中的各组分, 并利用气质联用对其中的各组分进行分析, 以期达到对该部位化学成分系统分析的目的, 为进一步防治动物疯草中毒奠定基础。
1 试验材料1. 1 植物材料
甘肃棘豆,2002年8月采于青海泽库县, 自然干燥, 粉碎备用。
1. 2 主要仪器和试剂
循环式多用真空泵(郑州长城工贸有限公司生产) 、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产) 、可调式电热板(北京化玻联医疗器械有限公司生产) 、ZF -2型三用紫光仪(上海安亭电子仪器厂生产) 、HPG 6890/MS973联用仪(美国惠普公司) 、玻璃管层析柱(415cm ×70cm ) 、薄层层析硅胶(批号:
990903, 青岛海洋化工集团公司) 、柱层析硅胶(批号:图1 甘肃棘豆中碱水氯仿部位的提取流程
2001830, 青岛市北区海化干燥剂厂) 。
2. 2 碱水氯仿提取部位的处理
收稿日期:2004-04-30
将碱水氯仿提取部分置水浴锅上, 完全干燥后与60～
项目来源:国家自然科学基金资助项目(30371067) ; 西北农
100目的硅胶按1∶1(g/g ) 进行拌样, 将拌好的样品挥干, 研细
林科技大学重点科研项目资助(080807)
备用。
作者简介:童德文(1967-) , 男, 博士, 副教授, 主要从事兽医
2. 3 薄层层析(Thin -layer Chromatography , TLC )
病理学与毒理学教学与研究。
将甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、苯、石油醚、二氯甲烷等8种有机溶剂进行组合搭配作为展开剂, 进行氯仿碱水
调
查研究
ψλ
提取部位的TLC 试验, 根据展开效果选择柱层析理想的洗脱体系。
2. 4 碱水氯仿提取部位的柱层析分离
取处理好的样品3516g , 置硅胶柱。洗脱液用氯仿-乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱, 梯度顺序为氯仿→氯仿∶乙酸乙酯(501∶、201∶、11∶, v/v ) →乙酸乙酯→氯仿∶甲醇∶水∶氨水(76∶20∶2∶2,
v/v ) →甲醇。每30ml 收集1份, 共收集721份。2. 5 碱水氯仿提取部位柱层析后组分的TLC 检测
展开剂(v /v ) ∶氯仿∶乙醚为7∶1或4∶1; 氯仿∶甲醇为
7∶1或4∶1; 氯仿∶甲醇∶氨水为15∶4∶1; 氯仿∶甲醇∶氨水∶水为70∶26∶2∶2。
显色剂:改良碘化铋钾溶液; 5%硫酸乙醇溶液; 过氧化氢/
10%醋酐/Ehrlich 试剂。上行法展开, 显色后记录各斑点颜
色, 并计算R f 值。
2. 6 194～204号样品中结晶Ⅰ的初步鉴定
结晶I 为194～204合并液上层物质用甲醇重结晶析出的晶体, 对结晶I 进行TLC 鉴定和722可见光度计的吸收光谱测定(从180～860nm , 每20nm 测一次吸光度) 。
2. 7 气相-质谱(G as chromatography -Mass spectrum , GC -MS ) 分析
对碱水氯仿提取部位进行GC -MS 分析。GC -MS 接Ⅱ温度280℃, 检索数据库为DA TABASE/N IST98L 。GC 条件:色谱柱HP -1, 毛细管柱(30m ×0132mm ×0125μm ) , 柱温50～60℃, 柱温由50℃升至260℃, 升温程序4℃/
min , 进样口温度300℃。MS 条件:电子轰击(EI 电子源) , 电
子能量70ev , 离子源温度230℃, 四极杆15℃, 温度扫描范围15～550aum 。
3 分析结果
3. 1 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位TLC 检测
调结果见表1。
查表1 碱水氯仿提取部位TLC 检测结果
研改良碘化究
展开剂(v/v ) 铋钾显色 R f 值
氯仿-乙醚1∶1橙红色0. 36、0. 19氯仿-乙醚1∶3橙红色0. 61、0. 40氯仿-乙酸乙酯1∶1橙红色0. 84、0. 72、0. 59氯仿-乙酸乙酯1∶2橙红色0. 79、0. 60、0. 54氯仿-乙酸乙酯3∶2橙红色0. 69、0. 54、0. 41氯仿-乙酸乙酯-甲醇3∶1∶2橙红色0. 86、0. 34
苯-乙醚13∶42
橙红色
0. 77、0. 61、0. 50、0. 38
从表1中可以看出, 氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系和苯-乙醚体系展开效果较好, 但是由于苯的毒性太大, 而乙醚又有较大的挥发性, 因此, 二者不适合作展开剂, 所以最后的展开体系选择为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系。
3. 2 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位柱层析结果
在氯仿-乙酸乙酯-甲醇洗脱体系下梯度洗脱, 每30
ml 收集1份, 共收集721份, TLC 检测, 合并同类后, 氯仿洗
中兽医医药杂志 J TCV M
2004年第5期脱的1～16、17～60、1～143、144～193分别合并, 编号为1、
2、3、4。氯仿-乙酸乙酯(v/v ) 50∶1洗脱的194～204、205～244、245～267合并, 编号为5、6、7。氯仿-乙酸乙酯(v/v ) 20∶1洗脱的268～307、308～393合并, 编号为8、9。氯仿-
乙酸乙酯(v/v ) 1∶1洗脱的394～445、446～484合并, 编号为
10、11。乙酸乙酯洗脱的485～522合并, 编号为12。氯仿-
甲醇-氨水-水(v/v ) 70∶26∶2∶2洗脱的523～536、537～553、
554～625、626～669、670～709、710～721合并, 编号为13、14、15、16、17、18。并在5号样品中得到结晶Ⅰ。
3. 3 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位柱层析后各组分TLC 检
测结果(见表2)
表2 碱水氯仿提取部位分离物TLC 鉴定结果
编号洗脱物特征
展开剂显色剂
显色R f 值1橘黄色液体氯仿Dr 橘红色0. 712橘黄色液体氯仿
Dr 橘红色
0. 43
3
棕色油状物
a Dr 橘红色0. 75、0. 66、0. 524橘黄有絮状沉淀
b Dr 浅褐色0. 57
b
5%硫酸乙醇黄色5
上层有结晶a 5%硫酸乙醇
黄色0. 58下层褐色液体a Dr 橘红色6深褐色液体a Dr 橘红色
0. 85、0. 77橘黄色液体b Dr 橘红色0. 74、0. 55、0. 368橘黄色液体a Dr 橘红色0. 64、0. 46、0. 309棕黑色液体a Dr 橘红带10黑褐色液体c Dr 显色较弱11黑褐色液体c Dr 不显色12黑褐色液体d Dr 橘红带13黑褐色液体e Eh 褐色0. 84、0. 67
14黑褐色液体f Dr 无斑点15棕黑油状液c Eh 褐色0. 80、0. 6816棕黑油状液e Eh 褐色0. 90、0. 7417棕黑油状液e Eh 褐色、紫黑色0. 90、0. 74、0. 52
18棕黑油状液
e
Eh 紫褐色0. 69Dr
显色较弱
注:a :氯仿-乙醚(7∶1, v/v ) 、b :氯仿-乙醚(4∶1, v/v ) 、c :氯仿
-甲醇-氨水(15∶4∶1, v/v ) 、d :氯仿-甲醇(10∶1, v/v ) 、e :氯仿-甲
醇(7∶1, v/v ) 、f :氯仿-甲醇-氨水-水(70∶26∶2∶2, v/v ) 、Dr :改良Dra 2
gendorff 试剂、Eh :Ehrlich ’s 试剂
3. 4 结晶Ⅰ初步鉴定结果
结晶Ⅰ为黄色针状结晶。以甲醇作溶剂溶解后, 可见光光度计测吸收光谱, 在420nm 处出现最大吸收峰,280nm 和660nm 处各有一小吸收峰, 具体结构待进一步检测确定。
TLC 检测结果见表3。
2004年第5期 中兽医医药杂志 J TCV M
ζλ
3. 5 GC -MS 检测结果
表3 结晶I TLC 鉴定结果
展开剂
显色剂
Ehrlich ’s 试剂
斑点数目无
11
斑点颜色
-
甘肃棘豆碱水氯仿提取部位G C -MS 分析, 共出峰20
R f 值-
个, 经NIST98L 质谱数据库检索, 确定了10种单体(见表
4) 。
4 讨论和结论
4. 1 本次试验中, 得到一种结晶Ⅰ, 为黄色针状结晶, 分光
氯仿-乙醚(7∶1,v/v ) 改良碘化铋钾
5%硫酸乙醇
浅褐色0. 58黄色
0. 58
光度计测定结果表明, 在420nm 处出现最大吸收峰, TLC 鉴定, 改良碘化铋钾和5%硫酸乙醇显色,R f 值为0158, 其具体
表4 碱水氯仿部位分离物GC -MS 分析鉴定结果
峰号
[1**********]
保留时间
6. 5487. 94820. 36224. 21726. 22829. 49433. 66530. 51631. 68832. 776
化合物名称苯甲醇
2-吡咯烷酮
分子式(分子量)
C 7H 8O (108) C 4H 7HO (85) C 12H 24O 4(232) C 14H 20(188) C 14H 26O 4(258) C 11H 12O 4(208) C 16H 32O 2(256) C 16H 22O 4(278) C 16H 22O 4(278) C 18H 24O 6(336)
相对含量
9. 3530. 5800. 9520. 8931. 2812. 7521. 5103. 12210. 72754. 608
丁二酸二(2-甲基) 丙酯
1,4-二甲基-2,5-二异丙基苯
己二酸二(2-甲基) 丙酯
3-(4-羟基-3-甲氧基苯酚) -2-丙稀酸甲酯
十六碳酸
邻苯二甲酸二(2-甲基) 丙酯
邻苯二甲酸二丁酯
结构还待进一步鉴定。
4. 2 在本次试验中应用了GC -MS 技术对甘肃棘豆碱水氯
参考文献:
12
王建华, 张树方主编. 动物中毒病及毒理学(第2版) 〔M 〕. 台北:台湾中草药杂志出版社,2002.
童德文, 曹光荣, 李绍君, 等. 甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定〔J 〕. 西北农林科技大学学报,2001,29(3) :5～
8.
仿提取部位进行了分析, 共检测出20种化学成分, 其中有10种成分与色谱数据库中数据相符合, 故可知其具体化学结构, 而另外10种成分的具体化学结构还待进一步确定。
4. 3 在洗脱体系的选择过程中, 要求的展开剂能在甘肃棘
调
查研究
豆的碱水氯仿提取部位的薄层层析试验中, 尽量多的显示出单一斑点, 且各斑点之间的距离要明显。根据这一要求, 在经多次试验后, 找出了两种展开体系, 为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系和苯-乙醚体系, 但是由于苯的毒性太大, 而乙醚的挥发性也较大, 因此二者不适合于作洗脱剂, 最终洗脱体系选择为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系。
4. 4 在甘肃棘豆的生物碱中, 主要为强极性多羟基吲哚里
3456
赵宝玉, 曹光荣, 童德文, 等. 甘肃棘豆毒性生物碱的研究〔J 〕. 中国兽医学报,2001,21(3) :174～176.
赵宝玉, 童德文, 曹光荣, 等. 甘肃棘豆有毒成分的分离与分析〔J 〕. 西北农业学报,1999,8(5) :93～96.
徐任生, 陈仲良主编. 中草药有效成分提取与分离(第2版) 〔M 〕. 上海:上海科技出版社,1989.
Molyneux R J. Analysis and distributivn of swainsonine and related polytydroxy indotizidine alkaloids by thin -layer chromatography 〔J 〕. phytochemicul analysis , 1991,2,125
西啶生物碱, 还含有少量的弱、中极性生物碱。在本次试验中, 碱性氯仿提取部分中的生物碱在TLC 检测结果中, 大部分对改良Dragendorff 显色明显, 而仅有少部分对Ehrlich ’s 试剂显色明显, 还有极少部分对5%硫酸乙醇显黄色, 说明碱性氯仿提取部分以小极性生物碱为主, 同时也含有大极性生物碱。
7
～129.
Molyneux R J and James L F. Loco intoxicatim imdolizidine alkaloids of spotted Locoweed catragalus Lontiginosus 〔J 〕. Science , 1982,216,190～191.
{λ
2004年第5期 中兽医医药杂志 J TCV M
流感疫苗脂质体制备的初步研究
王 鸿1, 洪 泠2, 梁文权3
(1. 浙江医学高等专科学校, 浙江杭州 310053;2邵逸夫医院;3浙江大学药学院)
摘 要: 以包封率为依据, 采用薄膜分散法制备疫苗脂质体, 以Lowry 检测法测定包封率。结果制备得到包封率高于84%的疫苗脂质体。制备过程中冻融处理、磷脂用量对疫苗脂质体包封率影响较大, 该实验筛选得到的配方能制备得到较高包封率的疫苗脂质体。 关键词: 流感疫苗; 脂质体; 制备
中图分类号:S85214 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2004) 05-0016-03 脂质体1,2作为疫苗载体具有许多优点, 它兼有佐剂和载体的作用, 可延长疫苗在体内的停留时间、减少疫苗用量、降低毒副作用, 并可产生免疫记忆, 提高免疫功能。接种疫苗所产生的抗体滴度比常规疫苗要高10倍以上, 可增加细胞免疫应答能力, 同时可提高多肽等亚单位抗原的稳定性, 并延长保存期和免疫时间。能够弥补现有疫苗的一些不足。因此, 脂质体疫苗具有较好的发展前景和经济效益。
1 材料与仪器1. 1 材料
2 方法和结果
2. 1 制备方法的选择3,4
2. 1. 1 高速分散法 取适量大豆磷脂, 加入适量磷酸缓冲
液超声使溶, 缓慢注入高速搅拌下的适量的磷酸缓冲液, 搅拌, 得空白脂质体。
2. 1. 2 薄膜分散法 取大豆磷脂溶于适量乙醚, 旋转蒸发,
加入适量磷酸缓冲液, 旋涡震荡, 得空白脂质体。
2. 1. 3 两种方法的比较 用两种方法制得的脂质体在显微
镜16×40下观察, 用高速分散法制备的空白脂质体, 未能清楚看到脂质体微粒; 而用薄膜分散法制备的空白脂质体, 显微镜下观察到的粒子大都在2mm 左右, 粒子实际大小在
3112μm 左右。而所用病毒直径约为80～120nm , 脂质体粒
灭活流感病毒胆固醇; 大豆磷脂; 磷酸二氢钾; 磷酸氢二钾; 氢氧化钠; 乙醚; 牛血清白蛋白; 硫酸铜; 草酸钠; 磷酸; 柠檬酸; 碳酸钠; 钨酸钠; 钼酸钠; 盐酸; 硫酸锂。
1. 2 仪器
J Y92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所) ; FJ -200高速分散均质机(上海标本模型厂) ; RE -52C 旋转
径过小影响包封率, 故采用薄膜分散法制备疫苗脂质体。
2. 1. 4 疫苗脂质体的制备 取大豆磷脂、胆固醇适量, 溶于
乙醚, 旋转蒸发, 加入含有病毒液的磷酸缓冲液, 旋涡振荡, 得疫苗脂质体。
2. 2 实验设计和优化选择
2. 2. 1 设计 运用正交实验的方法进行处方筛选, 主要因
蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ; UV -V IS S pectrophotometer
TU -180(北京通用公司) ; 台式离心机TG L -16G (上海安
调查研究
亭科学仪器厂) ; 超速离心机S orgall Biofuge Statos (美国科径仪器公司) 。
收稿日期:2004-04-12
作者简介:王 鸿(1971-) , 女, 硕士, 讲师, 从事药剂学研究和教学。
子有缓冲液的p H 值、大豆磷脂和胆固醇的用量比、大豆磷脂的用量、冻融对包封率的影响。
2. 2. 2 包封率的测定 以蛋白质含量为包封率测定指标,
采用Lowry 检测法测定包封率。将疫苗脂质体稀释4倍, 以
Study on chemical component of oxytropis ka nsuensis Bunge.
Ⅰ. Analysis of component in extractive position of alkalized chloroform
TON G De -wen ,ZHAO Bao -yu ,L IAN Shi -gang ,FAN Ze -feng (College of Animal Science and Technology ,Northwest Sci -Tech University
of Agriculture and Forestry , Y angling Shaanxi ,712100,China )
Abstract :Oxyt ropis kansuensis Bunge. powder was dripped in methanol , the residue following evaporated of the methanol was dissolved in 1mol/l HCl and filtered. The acidified filtrate at first extracted 8times b y chloroform , second alkalized by NaOH , at last extracted 4times by chloroform to obtain position of alkalized chloroform. A pplied 22. 6g position of alkalized chloroform to a silica gel column and gradient eluted under system of chloroform -ethyl acetate -methanol , collected 30mL/fraction. 721fractions was col 2lected and monitored by TLC. Incorporated the same fraction to gain the crystal Ⅰwhich was identified by TLC and spectropho 2tometry. Analysed the position of alkalized chloroform with GC -MS to find 20com ponents , in which the structure of 1alkaloid , 6esters , 1alcohol , 1aromatic hydrocarbon , and 1fatty acid were defined.
K ey w ords :Oxyt ropis kansuensis Bunge. ; TLC ;column chromatography
中兽医医药杂志 J TCV M
2004年第5期ξλ
甘肃棘豆化学成分研究
Ⅰ. 碱水氯仿提取部位成分分析
童德文, 赵宝玉, 廉士刚, 樊泽峰
(西北农林科技大学动物科技学院, 陕西杨凌712100)
摘 要: 将甘肃棘豆草粉用甲醇浸提, 浓缩浸提液后,1mol/l 的盐酸酸解, 抽滤, 所得酸水液首先用氯仿萃取8次后, 然后用NaOH 碱化, 最后碱水液经氯仿萃取4次后所得氯仿液减压浓缩即得碱水氯仿提取部位。取碱水氯仿提取部位2216g , 在氯仿-乙酸乙酯-甲醇洗脱体系下, 柱层析梯度洗脱进行分离, 每30ml 收集1份, 共收集721份, TLC 检测, 合并同类, 得晶体Ⅰ, 对晶体Ⅰ进行了分光光度和TLC 鉴定。对碱水氯仿提取部位进行气质联用分析, 共有20种成分, 确定了结构的成分有10种, 分别是生物碱1种、酯6种、醇1种、芳香烃1种、脂肪酸1种, 其它10种成分的结构还待进一步分析确定。 关键词: 甘肃棘豆; TLC ; 柱层析
中图分类号:S85918 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2004) 05-0013-04 甘肃棘豆(Oxyt ropis kansuensis Bunge. ) 为多年生豆科棘2 试验方法
豆属草本植物, 是疯草(locoweed ) 的一种, 广泛分布于宁夏、2. 1
甘肃棘豆中碱水氯仿部位的提取
内蒙古、甘肃东部和南部、四川西部、云南西北部及青海西部和南部, 马、牛、羊采食后引起以神经症状为主的慢性中毒,
称“疯草病”
(Locodisease ) , 给畜牧业生产造成巨大损失, 是目前我国西部牧区危害最严重的毒草之一1～4。我国对疯草中毒的研究始于70年代末期, 经过多年的研究, 国内学者认为疯草中毒的主要毒性成分为生物碱, 目前在疯草中已分离鉴定出的生物碱主要有吲哚兹啶类生物碱、喹喏里西啶类生物碱和哌啶类生物碱5～9。本试验在醇类提取法分离苦马豆素的基础上, 试图通过柱层析分离甘肃棘豆碱性氯仿提取部位中的各组分, 并利用气质联用对其中的各组分进行分析, 以期达到对该部位化学成分系统分析的目的, 为进一步防治动物疯草中毒奠定基础。
1 试验材料1. 1 植物材料
甘肃棘豆,2002年8月采于青海泽库县, 自然干燥, 粉碎备用。
1. 2 主要仪器和试剂
循环式多用真空泵(郑州长城工贸有限公司生产) 、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产) 、可调式电热板(北京化玻联医疗器械有限公司生产) 、ZF -2型三用紫光仪(上海安亭电子仪器厂生产) 、HPG 6890/MS973联用仪(美国惠普公司) 、玻璃管层析柱(415cm ×70cm ) 、薄层层析硅胶(批号:
990903, 青岛海洋化工集团公司) 、柱层析硅胶(批号:图1 甘肃棘豆中碱水氯仿部位的提取流程
2001830, 青岛市北区海化干燥剂厂) 。
2. 2 碱水氯仿提取部位的处理
收稿日期:2004-04-30
将碱水氯仿提取部分置水浴锅上, 完全干燥后与60～
项目来源:国家自然科学基金资助项目(30371067) ; 西北农
100目的硅胶按1∶1(g/g ) 进行拌样, 将拌好的样品挥干, 研细
林科技大学重点科研项目资助(080807)
备用。
作者简介:童德文(1967-) , 男, 博士, 副教授, 主要从事兽医
2. 3 薄层层析(Thin -layer Chromatography , TLC )
病理学与毒理学教学与研究。
将甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、苯、石油醚、二氯甲烷等8种有机溶剂进行组合搭配作为展开剂, 进行氯仿碱水
调
查研究
ψλ
提取部位的TLC 试验, 根据展开效果选择柱层析理想的洗脱体系。
2. 4 碱水氯仿提取部位的柱层析分离
取处理好的样品3516g , 置硅胶柱。洗脱液用氯仿-乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱, 梯度顺序为氯仿→氯仿∶乙酸乙酯(501∶、201∶、11∶, v/v ) →乙酸乙酯→氯仿∶甲醇∶水∶氨水(76∶20∶2∶2,
v/v ) →甲醇。每30ml 收集1份, 共收集721份。2. 5 碱水氯仿提取部位柱层析后组分的TLC 检测
展开剂(v /v ) ∶氯仿∶乙醚为7∶1或4∶1; 氯仿∶甲醇为
7∶1或4∶1; 氯仿∶甲醇∶氨水为15∶4∶1; 氯仿∶甲醇∶氨水∶水为70∶26∶2∶2。
显色剂:改良碘化铋钾溶液; 5%硫酸乙醇溶液; 过氧化氢/
10%醋酐/Ehrlich 试剂。上行法展开, 显色后记录各斑点颜
色, 并计算R f 值。
2. 6 194～204号样品中结晶Ⅰ的初步鉴定
结晶I 为194～204合并液上层物质用甲醇重结晶析出的晶体, 对结晶I 进行TLC 鉴定和722可见光度计的吸收光谱测定(从180～860nm , 每20nm 测一次吸光度) 。
2. 7 气相-质谱(G as chromatography -Mass spectrum , GC -MS ) 分析
对碱水氯仿提取部位进行GC -MS 分析。GC -MS 接Ⅱ温度280℃, 检索数据库为DA TABASE/N IST98L 。GC 条件:色谱柱HP -1, 毛细管柱(30m ×0132mm ×0125μm ) , 柱温50～60℃, 柱温由50℃升至260℃, 升温程序4℃/
min , 进样口温度300℃。MS 条件:电子轰击(EI 电子源) , 电
子能量70ev , 离子源温度230℃, 四极杆15℃, 温度扫描范围15～550aum 。
3 分析结果
3. 1 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位TLC 检测
调结果见表1。
查表1 碱水氯仿提取部位TLC 检测结果
研改良碘化究
展开剂(v/v ) 铋钾显色 R f 值
氯仿-乙醚1∶1橙红色0. 36、0. 19氯仿-乙醚1∶3橙红色0. 61、0. 40氯仿-乙酸乙酯1∶1橙红色0. 84、0. 72、0. 59氯仿-乙酸乙酯1∶2橙红色0. 79、0. 60、0. 54氯仿-乙酸乙酯3∶2橙红色0. 69、0. 54、0. 41氯仿-乙酸乙酯-甲醇3∶1∶2橙红色0. 86、0. 34
苯-乙醚13∶42
橙红色
0. 77、0. 61、0. 50、0. 38
从表1中可以看出, 氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系和苯-乙醚体系展开效果较好, 但是由于苯的毒性太大, 而乙醚又有较大的挥发性, 因此, 二者不适合作展开剂, 所以最后的展开体系选择为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系。
3. 2 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位柱层析结果
在氯仿-乙酸乙酯-甲醇洗脱体系下梯度洗脱, 每30
ml 收集1份, 共收集721份, TLC 检测, 合并同类后, 氯仿洗
中兽医医药杂志 J TCV M
2004年第5期脱的1～16、17～60、1～143、144～193分别合并, 编号为1、
2、3、4。氯仿-乙酸乙酯(v/v ) 50∶1洗脱的194～204、205～244、245～267合并, 编号为5、6、7。氯仿-乙酸乙酯(v/v ) 20∶1洗脱的268～307、308～393合并, 编号为8、9。氯仿-
乙酸乙酯(v/v ) 1∶1洗脱的394～445、446～484合并, 编号为
10、11。乙酸乙酯洗脱的485～522合并, 编号为12。氯仿-
甲醇-氨水-水(v/v ) 70∶26∶2∶2洗脱的523～536、537～553、
554～625、626～669、670～709、710～721合并, 编号为13、14、15、16、17、18。并在5号样品中得到结晶Ⅰ。
3. 3 甘肃棘豆碱水氯仿提取部位柱层析后各组分TLC 检
测结果(见表2)
表2 碱水氯仿提取部位分离物TLC 鉴定结果
编号洗脱物特征
展开剂显色剂
显色R f 值1橘黄色液体氯仿Dr 橘红色0. 712橘黄色液体氯仿
Dr 橘红色
0. 43
3
棕色油状物
a Dr 橘红色0. 75、0. 66、0. 524橘黄有絮状沉淀
b Dr 浅褐色0. 57
b
5%硫酸乙醇黄色5
上层有结晶a 5%硫酸乙醇
黄色0. 58下层褐色液体a Dr 橘红色6深褐色液体a Dr 橘红色
0. 85、0. 77橘黄色液体b Dr 橘红色0. 74、0. 55、0. 368橘黄色液体a Dr 橘红色0. 64、0. 46、0. 309棕黑色液体a Dr 橘红带10黑褐色液体c Dr 显色较弱11黑褐色液体c Dr 不显色12黑褐色液体d Dr 橘红带13黑褐色液体e Eh 褐色0. 84、0. 67
14黑褐色液体f Dr 无斑点15棕黑油状液c Eh 褐色0. 80、0. 6816棕黑油状液e Eh 褐色0. 90、0. 7417棕黑油状液e Eh 褐色、紫黑色0. 90、0. 74、0. 52
18棕黑油状液
e
Eh 紫褐色0. 69Dr
显色较弱
注:a :氯仿-乙醚(7∶1, v/v ) 、b :氯仿-乙醚(4∶1, v/v ) 、c :氯仿
-甲醇-氨水(15∶4∶1, v/v ) 、d :氯仿-甲醇(10∶1, v/v ) 、e :氯仿-甲
醇(7∶1, v/v ) 、f :氯仿-甲醇-氨水-水(70∶26∶2∶2, v/v ) 、Dr :改良Dra 2
gendorff 试剂、Eh :Ehrlich ’s 试剂
3. 4 结晶Ⅰ初步鉴定结果
结晶Ⅰ为黄色针状结晶。以甲醇作溶剂溶解后, 可见光光度计测吸收光谱, 在420nm 处出现最大吸收峰,280nm 和660nm 处各有一小吸收峰, 具体结构待进一步检测确定。
TLC 检测结果见表3。
2004年第5期 中兽医医药杂志 J TCV M
ζλ
3. 5 GC -MS 检测结果
表3 结晶I TLC 鉴定结果
展开剂
显色剂
Ehrlich ’s 试剂
斑点数目无
11
斑点颜色
-
甘肃棘豆碱水氯仿提取部位G C -MS 分析, 共出峰20
R f 值-
个, 经NIST98L 质谱数据库检索, 确定了10种单体(见表
4) 。
4 讨论和结论
4. 1 本次试验中, 得到一种结晶Ⅰ, 为黄色针状结晶, 分光
氯仿-乙醚(7∶1,v/v ) 改良碘化铋钾
5%硫酸乙醇
浅褐色0. 58黄色
0. 58
光度计测定结果表明, 在420nm 处出现最大吸收峰, TLC 鉴定, 改良碘化铋钾和5%硫酸乙醇显色,R f 值为0158, 其具体
表4 碱水氯仿部位分离物GC -MS 分析鉴定结果
峰号
[1**********]
保留时间
6. 5487. 94820. 36224. 21726. 22829. 49433. 66530. 51631. 68832. 776
化合物名称苯甲醇
2-吡咯烷酮
分子式(分子量)
C 7H 8O (108) C 4H 7HO (85) C 12H 24O 4(232) C 14H 20(188) C 14H 26O 4(258) C 11H 12O 4(208) C 16H 32O 2(256) C 16H 22O 4(278) C 16H 22O 4(278) C 18H 24O 6(336)
相对含量
9. 3530. 5800. 9520. 8931. 2812. 7521. 5103. 12210. 72754. 608
丁二酸二(2-甲基) 丙酯
1,4-二甲基-2,5-二异丙基苯
己二酸二(2-甲基) 丙酯
3-(4-羟基-3-甲氧基苯酚) -2-丙稀酸甲酯
十六碳酸
邻苯二甲酸二(2-甲基) 丙酯
邻苯二甲酸二丁酯
结构还待进一步鉴定。
4. 2 在本次试验中应用了GC -MS 技术对甘肃棘豆碱水氯
参考文献:
12
王建华, 张树方主编. 动物中毒病及毒理学(第2版) 〔M 〕. 台北:台湾中草药杂志出版社,2002.
童德文, 曹光荣, 李绍君, 等. 甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定〔J 〕. 西北农林科技大学学报,2001,29(3) :5～
8.
仿提取部位进行了分析, 共检测出20种化学成分, 其中有10种成分与色谱数据库中数据相符合, 故可知其具体化学结构, 而另外10种成分的具体化学结构还待进一步确定。
4. 3 在洗脱体系的选择过程中, 要求的展开剂能在甘肃棘
调
查研究
豆的碱水氯仿提取部位的薄层层析试验中, 尽量多的显示出单一斑点, 且各斑点之间的距离要明显。根据这一要求, 在经多次试验后, 找出了两种展开体系, 为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系和苯-乙醚体系, 但是由于苯的毒性太大, 而乙醚的挥发性也较大, 因此二者不适合于作洗脱剂, 最终洗脱体系选择为氯仿-乙酸乙酯-甲醇体系。
4. 4 在甘肃棘豆的生物碱中, 主要为强极性多羟基吲哚里
3456
赵宝玉, 曹光荣, 童德文, 等. 甘肃棘豆毒性生物碱的研究〔J 〕. 中国兽医学报,2001,21(3) :174～176.
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徐任生, 陈仲良主编. 中草药有效成分提取与分离(第2版) 〔M 〕. 上海:上海科技出版社,1989.
Molyneux R J. Analysis and distributivn of swainsonine and related polytydroxy indotizidine alkaloids by thin -layer chromatography 〔J 〕. phytochemicul analysis , 1991,2,125
西啶生物碱, 还含有少量的弱、中极性生物碱。在本次试验中, 碱性氯仿提取部分中的生物碱在TLC 检测结果中, 大部分对改良Dragendorff 显色明显, 而仅有少部分对Ehrlich ’s 试剂显色明显, 还有极少部分对5%硫酸乙醇显黄色, 说明碱性氯仿提取部分以小极性生物碱为主, 同时也含有大极性生物碱。
7
～129.
Molyneux R J and James L F. Loco intoxicatim imdolizidine alkaloids of spotted Locoweed catragalus Lontiginosus 〔J 〕. Science , 1982,216,190～191.
{λ
2004年第5期 中兽医医药杂志 J TCV M
流感疫苗脂质体制备的初步研究
王 鸿1, 洪 泠2, 梁文权3
(1. 浙江医学高等专科学校, 浙江杭州 310053;2邵逸夫医院;3浙江大学药学院)
摘 要: 以包封率为依据, 采用薄膜分散法制备疫苗脂质体, 以Lowry 检测法测定包封率。结果制备得到包封率高于84%的疫苗脂质体。制备过程中冻融处理、磷脂用量对疫苗脂质体包封率影响较大, 该实验筛选得到的配方能制备得到较高包封率的疫苗脂质体。 关键词: 流感疫苗; 脂质体; 制备
中图分类号:S85214 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2004) 05-0016-03 脂质体1,2作为疫苗载体具有许多优点, 它兼有佐剂和载体的作用, 可延长疫苗在体内的停留时间、减少疫苗用量、降低毒副作用, 并可产生免疫记忆, 提高免疫功能。接种疫苗所产生的抗体滴度比常规疫苗要高10倍以上, 可增加细胞免疫应答能力, 同时可提高多肽等亚单位抗原的稳定性, 并延长保存期和免疫时间。能够弥补现有疫苗的一些不足。因此, 脂质体疫苗具有较好的发展前景和经济效益。
1 材料与仪器1. 1 材料
2 方法和结果
2. 1 制备方法的选择3,4
2. 1. 1 高速分散法 取适量大豆磷脂, 加入适量磷酸缓冲
液超声使溶, 缓慢注入高速搅拌下的适量的磷酸缓冲液, 搅拌, 得空白脂质体。
2. 1. 2 薄膜分散法 取大豆磷脂溶于适量乙醚, 旋转蒸发,
加入适量磷酸缓冲液, 旋涡震荡, 得空白脂质体。
2. 1. 3 两种方法的比较 用两种方法制得的脂质体在显微
镜16×40下观察, 用高速分散法制备的空白脂质体, 未能清楚看到脂质体微粒; 而用薄膜分散法制备的空白脂质体, 显微镜下观察到的粒子大都在2mm 左右, 粒子实际大小在
3112μm 左右。而所用病毒直径约为80～120nm , 脂质体粒
灭活流感病毒胆固醇; 大豆磷脂; 磷酸二氢钾; 磷酸氢二钾; 氢氧化钠; 乙醚; 牛血清白蛋白; 硫酸铜; 草酸钠; 磷酸; 柠檬酸; 碳酸钠; 钨酸钠; 钼酸钠; 盐酸; 硫酸锂。
1. 2 仪器
J Y92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所) ; FJ -200高速分散均质机(上海标本模型厂) ; RE -52C 旋转
径过小影响包封率, 故采用薄膜分散法制备疫苗脂质体。
2. 1. 4 疫苗脂质体的制备 取大豆磷脂、胆固醇适量, 溶于
乙醚, 旋转蒸发, 加入含有病毒液的磷酸缓冲液, 旋涡振荡, 得疫苗脂质体。
2. 2 实验设计和优化选择
2. 2. 1 设计 运用正交实验的方法进行处方筛选, 主要因
蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ; UV -V IS S pectrophotometer
TU -180(北京通用公司) ; 台式离心机TG L -16G (上海安
调查研究
亭科学仪器厂) ; 超速离心机S orgall Biofuge Statos (美国科径仪器公司) 。
收稿日期:2004-04-12
作者简介:王 鸿(1971-) , 女, 硕士, 讲师, 从事药剂学研究和教学。
子有缓冲液的p H 值、大豆磷脂和胆固醇的用量比、大豆磷脂的用量、冻融对包封率的影响。
2. 2. 2 包封率的测定 以蛋白质含量为包封率测定指标,
采用Lowry 检测法测定包封率。将疫苗脂质体稀释4倍, 以
Study on chemical component of oxytropis ka nsuensis Bunge.
Ⅰ. Analysis of component in extractive position of alkalized chloroform
TON G De -wen ,ZHAO Bao -yu ,L IAN Shi -gang ,FAN Ze -feng (College of Animal Science and Technology ,Northwest Sci -Tech University
of Agriculture and Forestry , Y angling Shaanxi ,712100,China )
Abstract :Oxyt ropis kansuensis Bunge. powder was dripped in methanol , the residue following evaporated of the methanol was dissolved in 1mol/l HCl and filtered. The acidified filtrate at first extracted 8times b y chloroform , second alkalized by NaOH , at last extracted 4times by chloroform to obtain position of alkalized chloroform. A pplied 22. 6g position of alkalized chloroform to a silica gel column and gradient eluted under system of chloroform -ethyl acetate -methanol , collected 30mL/fraction. 721fractions was col 2lected and monitored by TLC. Incorporated the same fraction to gain the crystal Ⅰwhich was identified by TLC and spectropho 2tometry. Analysed the position of alkalized chloroform with GC -MS to find 20com ponents , in which the structure of 1alkaloid , 6esters , 1alcohol , 1aromatic hydrocarbon , and 1fatty acid were defined.
K ey w ords :Oxyt ropis kansuensis Bunge. ; TLC ;column chromatography