生物化学大实验
第一部分 实验一 一、原理与目的
多酚氧化酶（PPO ）的分离提取
蛋白质提取、纯化及分析技术
多酚氧化酶（有3类，儿茶酚酶、戚酶、甲苯酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节，属于末端氧化酶的一种。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO 催化酚与O 2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：
NADH ＋H +醌2O
底物 NAD + 酚2
但是PPO 的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。
多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO 的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。 二、材料与试剂
（1）马铃薯（大约每小组150-200g ） （2）试剂：
0.03M 磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m 巯基乙醇，0.001m EDTA ，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮) 配制时配×10倍的浓缩液1000ml ；固体硫酸铵；0.03M 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m 巯基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置时配。 （3）实验器械与仪器设备：
试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH 计和PH 试纸；GL-20C 高速冷冻离心机；
DL-7A 大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤
1．粗酶提取：
马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001m EDTA ，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm 离心10min ，弃除沉淀获得酶提取液。 2．盐析分级沉淀：
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm 离心20min 弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm 离心20min ，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。沉淀用0.03M 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02N KCL 溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。 四、实验结果
获得PPO 粗酶液供上柱使用。
实验二 胰酶分离提取
一、原理与目的
胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取时普通生物化学实验的最主要、最经典的实验。
胰蛋白酶结晶最初以牛的胰脏为材料而制备，现用羊、猪、马、鼠等哺乳动物的胰脏亦可制备结晶。所不同的是，在提取制备的过程中所需的pH 值、PI 和结晶的构型上有区别。
提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。
胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH 酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH 下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理
条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N 端Lys 与Ile 之间的 一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI 变成10.8。
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。 二、材料与试剂
1．仪器
紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH 计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH 试纸，滤纸、玻璃器皿等。
2．材料：新鲜猪胰脏 3．试剂及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH 溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL 溶液、0.01M HCL 溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M ，用时稀释一倍）、Tris 、硫酸铵。0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M 四硼酸钠溶液，混合后用PH 计校正。 三、操作步骤
（1）新鲜猪胰脏一个，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，低温下用绞肉机绞碎，加入1-2倍体积预冷的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液（100ml ）提取。用10%乙酸调节pH 在3.0以下，冷室5℃提取20h 。胰蛋白酶提取关键：控制低温；控制pH 低于3.0，维持胰蛋白酶提取过程中的稳定。操作过程中的问题：乙酸调节酸度不稳定。
（2）过夜后粗提取物四层纱布过滤，滤液呈乳白色，滤渣再加入50ml 乙酸溶液浸提残渣，浸提2h 。合并滤液。
（3）浸提液离心，取上层黄绿色清液，加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度， 盐析1hr 。
（4）冷置后离心12000rpm 离心 10min，得胰蛋白酶粗制品。
（5）上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr ；12000rpm 离心 10min； 沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1M Tris 透析过夜，4 ℃保存。
四、实验结果
获得胰酶粗提液。
实验三 卵清蛋白分离提取
一、原理与目的
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1.鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同的组份，PI 的范围为3.9-4.5,280nm 的消光系数为A=4.13（1%，1cm ）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。
由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱。 二、材料与试剂：
1．材料：新鲜鸡蛋2只
2：仪器：抽滤瓶500－1000ml 、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂：
10％TCA ，用固体NaOH 调调PH 至1.05－1.10，需要50ml 、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M ，PH8.0Tris-HCL 缓冲液（每ml 含0.34BAEE 和2.22mgCaCL2），50ml ；pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤
（1）新鲜鸡蛋两枚取蛋清50ml 于烧杯中。25℃外用热水浴中缓慢加入50ml 三氯乙酸-丙酮（V/V1:2）, 再继续搅拌30min 。4℃静置过夜
操作关键：要在热水浴中缓慢加入有机溶剂，不可在热水浴之前加入；取蛋清时注意不能混入蛋黄，否则引入杂蛋白。
（2）粗提取物于50ml 离心管10000g 离心10min ，取上清液50ml ，加入4℃预冷的丙酮200 ml，4℃放置2h 。
（3）放置后取沉淀离心10000 rpm离心5 min，收集沉淀加沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次。收集沉淀，再对碳酸钠缓冲溶液透
析过夜。
（4）透析液离心4000g 10min ，取上层清液，加蒸馏水至35ml ，用于亲和柱层析。
四、实验结果
得到卵清蛋白纯化物。
实验四 离子交换层析和凝胶色谱层析纯化PPO
一、原理与目的
柱层析技术是最常用的蛋白质纯化手段，在普通生化操作中通过离子交换层析和凝胶层析连用实现蛋白质的纯化。
离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有解离基团，在水中能与溶液中其他离子起交换作用。当一定量的溶液通过交换柱时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被吸附到树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至把离子交换剂上的原离子全部洗脱下来。以上两种成分被交换着吸附在离子交换剂上，用洗脱剂洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。
本实验中用凝胶色谱技术分离纯化PPO 。其原理是通过分子筛效应，将样品中某一固定大小的蛋白质分子分离出来。 二、材料与试剂
试剂：0.02M Tris-HCL 缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA) 配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL; 聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等；
实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH 计和pH 试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A 大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤
1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 （1）柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h, 去掉悬浮
的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm 处，保持液面比胶面高1-2cm ，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
3）平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH 值与平衡缓冲液的PH 值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL 缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。
2．上样：将粗酶液上柱。
3．洗脱：用0.02M Tris-HCL 缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA ）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4．测定酶活性和蛋白质浓度 四、实验结果
加考马司亮兰检测蛋白，取含有蛋白的洗脱液，以供后续实验检测蛋白含量和酶活用。
实验五 酶含量及活性测定
一、原理与目的
蛋白质含量测定是生物化学实验中一个重要的实验技术。测定方法主要有：1，根据蛋白质中N 含量基本恒定（16%）为基础的凯氏定氮法；2，根据组成蛋白质的Phe 、Trp 、Tyr 3个带苯环氨基酸在280nm 具有吸收的特性为基础的紫外吸收法；3，利用蛋白质的一些特殊理化反应，使蛋白质与一些专一性化学试剂反应产生颜色，其颜色深浅与蛋白质浓度相关为基础的双缩脲法和Lawry 法、考马斯亮蓝G-250法等。
双缩脲法：蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm 下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线，求出未知样品的蛋白质浓度。
考马斯亮蓝G-250测量蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm 转变为595nm 。在一定的蛋白质浓度范围内，595nm 处的光密度值与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋白质定量测定。 二、仪器与试剂
1．材料：经硫酸铵沉淀获得PPO 粗酶液，Sephadex G-200分离纯化的酶液样品。 2．仪器与器皿： 分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。 3．试剂：考马斯亮蓝G-100蛋白试剂：称取100mg 考马斯亮蓝G-100溶于50ml90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100ml ，最后加入无离子水或蒸馏水定容到1000ml ，此溶液可在常温下放置一个月。 三、操作步骤
样品中蛋白质浓度的测定：
蛋白质含量测定（595nm ）。96孔酶标板依次加入考马斯亮兰100微升，样品20微升，原酶液20微升，对照为Tris-HCl 缓冲液20微升。用DG5031型酶联免疫检测仪测定蛋白质含量。
样品中PPO 活性的测定：酶标板依次加入磷酸-柠檬酸缓冲液20μL →底物邻苯二酚20μL →样品20μL ，原酶液20μL ，对照为Tris-HCl 缓冲液20μL 。
四、实验结果
1. 葡聚糖凝胶纯化结果：
表1 葡聚糖凝胶柱处理后PPO 蛋白含量和酶活性（OD 值）
洗脱体积 CK 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
粗 酶
酶 活 0 0 0.05 0.57 0.60 0.67 0.2 0.3 0.21 0.12 0.07 0.07 0.77 蛋白含量 0 0 0 0.43 0.37 0.44 0.18 0.43 0.12 0.07 0.05 0.04 0.51
从上图和上表中可得出如下结论：随着洗脱体积的变化，纯化后蛋白质含量和酶活性都出现峰值，从第2管开始蛋白质含量迅速增加，第5管时达到最大值（0.44）。酶活性在第5管时达到最大值，酶活曲线与蛋白质含量曲线走势相似。比酶活在第5管时达到最大。初酶蛋白含量很高，但酶活性却很低，即比酶活较低，主要是因为其中非酶的杂蛋白含量较高。 2. 离子交换柱纯化结果：
表2 离子交换柱纯化后PPO 的酶活与蛋白质含量测定（OD 值）
管号 酶活 蛋白含量 管号 酶活
管号 酶活 蛋白含量
18 0.12 0.058
19 0.13 0.067
20 0.17 0.056
21 0.16 0. 098
22 0.17 0.071
23 0.19 0.067
24 0.16 0.048
粗酶 0.45 0.315
一纯 0.52 0.430
9 0.23
10 0.23 0.104
11 0.18 0.104
12 0.15 0.094
13 0.14 0.086
14 0.12 0.065
15 0.09 0.058
16 0.10 0.06
17 0.10 0.088
CK 0 0
1 0 0
2 0.04 0.035
3 0.09 0.049
4 0.13 0.056
5 0.13 0.052
6 0.15 0.074
7 0.16 0.08
8 0.20 0.10
蛋白含量 0.102
从上述图表中可得离子交换层析法纯化PPO 后，在第9管和23管处，无论蛋白含量还是酶活均出现了两个峰值，据此可得出，PPO 存在至少两种同工酶。两次纯化差异大，说明纯化效果明显。
实验六 亲和层析纯化胰酶
一、原理与目的
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
本实验通过将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。 二、仪器与试剂
1. 鸡卵粘蛋白制备
2．Sephadex-G75的活化和偶联。2．5g 干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL 溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml 水）
3．亲和层析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml 、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N 甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml
仪器器材：抽滤瓶500-1000ml 、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器 三、操作步骤 1. 鸡卵粘蛋白的制备 2.Sephadex-G75的活化及偶联
2.5g 干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL
溶液50ml ,30min ，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml 水，加入活化葡聚糖凝胶，75％K2CO3，调pH7.5-9.0, 缓慢搅拌3h 。反应过程随时加入5％K2CO3, 以维持pH 的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml 水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h ，pH 维持在6.5-7.5，洗涤。
3．胰蛋白酶的亲和层析
（1）亲和层析
将鸡卵粘蛋白－Sephadex-G75装柱（1×10cm ）, 用pH7.5,0.1M 含 0.5M
KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2－3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm 处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N 的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。
当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱
可以反复使用。
（2）胰酶蛋白和活性测定
四、实验结果
表3 亲和层析处理过柱后酶活与蛋白质含量（OD 值）
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 蛋白含量 0.043 0.101 0.121 0.065 0.171 0.150 0.132 0.078 0.073 0.098
管号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 粗酶 蛋白含量 0.049 0.047 0.050 0.048 0.065 0.038 0.051 0.047 0.043 0.045 0.433
从图表中可以看出，蛋白质含量曲线随着洗脱体积的不同出现了两个大的个峰值。第5管蛋白质含量达到最高。表明杂蛋白洗除的比较好。
实验七 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定
一、原理与目的
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS 是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较
PAGE 电泳中各种成分及其作用：过硫酸铵：凝胶聚合的催化剂（过量会使离子强度升高），四甲基乙二胺：加速剂。（碱性条件下容易聚合）丙烯酰胺与双丙烯酰胺（P133) 二者总浓度及相对比例决定凝胶的孔径、交联度，硬度及弹性。
不连续性SDS-PAGE 浓缩胶与分离胶的性质和作用
浓缩胶：胶浓度低，交联度低，pH=6.7，蛋白带负电荷少，大孔胶。 pH=6.7时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较少（慢离子），氯离子是快离子，蛋白迁移速率介于两者中间，局部电位梯度大，（快离子移动快，形成局部低电导区，产生高电位，使移动加快）从而产生浓缩效应。
分离胶：胶浓度高，交联度高， pH=8，蛋白带负电荷多，小孔胶， pH=8.0时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较多，与氯离子一样，迁移速度加快，蛋白迁移速率最慢，部电位梯度小。
二、仪器与试剂
1．材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。
2．试剂：
（1）丙稀酰胺(Acr母液) ：30％Acr （Acr/Bis）
（2）10％的SDS 溶液
（3）10％的过硫酸铵溶液
（4）四甲基乙二胺（TEMED ）
（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8
（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8
（7）电极缓冲液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS ，加水溶解定容至1000ml,pH8.3
（8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰
（9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液
（10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液
（11）标准分子量蛋白。
3．仪器设备： 电泳仪，垂直电泳槽等。
三、操作步骤
1. 凝胶制备：
用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。
分离胶和浓缩胶的配备分别是：
30%的胶母 12.5mL 胶母液 2.5 mL PH8.8Tris 缓冲液 10 mL PH8.8Tris 缓冲液 2.5 mL
水 7.4 mL 水
14.5 mL
SDS 800 uL SDS 400 uL
AP 150uL AP 150uL
TEMED 25uL TEMED 25uL
2. 上样：分别取样品若干ml 于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min ，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul 不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA （2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm 时，即可停止电泳。
3．染色：电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h 后，即可看到清晰的蛋白质条带。
4. 脱色。
四、实验结果
1 2 3 4 5
1，粗酶；2，葡聚糖凝胶柱层析纯化酶；3，离子交换柱层析纯化酶；
4，粗胰酶；5，亲和层析纯化酶。
图4 PPO 和胰酶提取纯化效果
SDS-PAGE 电泳图可见，纯化过程中目的条带逐渐明显，即目的蛋白相对含量逐渐增加，杂条带逐渐消失。但进一步提纯后，条带消失，可能在进一步的柱层析过程中，制作的柱材料有问题，目的蛋白没有挂柱，随缓冲液流走了，故未得到目的蛋白。
实验八 Western-blotting
一、原理
Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE 电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western Blot编辑本段回目录此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶) 来检测，此方法可检测1ng 抗原蛋白。Western 杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng 的特异性的目的蛋白。
二、仪器与试剂
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L 水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)考马斯亮蓝溶液
三、操作步骤
(1)用已制备好的SDS-PAGE 分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad 上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入考马斯亮蓝S 溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL 封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中) ，封闭特异性抗体结合位点，室温1h ，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL 新配制的DAB 底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
四、结果分析
目的条带
分析阳性(显色) 条带的分子量大小，而且根据信号(颜色) 强弱分析蛋白表达量。
图5 Western-blotting
图示表明，目的条带清晰可见，无杂带出现。
二 核酸部分
实验九 染色体DNA 的提取
一、原理
DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA 的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA 提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。本实验通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA 进入水相与蛋白质分开，在RNase 的作用下，降解RNA 以纯化DNA 。通过实验学习和掌握提取基因组DNA 的原理和方法。
二、材料
1．材料： 培养菌体
2．仪器设备：
超净工作台、培养箱、摇床、高速冷冻离心机、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、取液器一套、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪
3．试剂：
细胞裂解液
100m M Tris-HCL
5mM EDTA
5OOm M NaCL
1.25%SDS
pH7.5
饱和酚 氯仿/异戊醇 酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70％无水乙醇 3M NaAC RNase 50×TAE 缓冲液 电泳载样缓冲液
三、操作步骤：
培养菌体；
培养好的菌液1.5ml 离心收集菌体 + 600ul细胞裂解液（65℃预热）悬浮菌体，60ul 酚混合（变性蛋白，操作应缓和，不可剧烈振荡，以免DNA 烈解）；
65℃ 30min(5-10min,混匀一次) ；
+600ul 氯仿，混匀，静置4-5min ；
15000g 离心，10min ；取上清，等体积氯仿抽提一次。
吸取上清，+1/10体积的乙酸钠，2倍体积的乙醇，置于-70℃,20min ；
10000g 离心10min, 复溶于40-100ul 的无菌水中；
70％乙醇洗沉淀，离心10min, 真空干燥；
复溶于30-40ul 的无菌水中，电泳。
四、实验结果
目的条带
图6 大肠杆菌基因组DNA 电泳图
所提取的大肠杆菌基因组DNA 由琼脂糖凝胶电泳分析结果，泳道较清晰，有一条很亮的DNA 条带，其下方有三条亮带，可能为未降解的RNA ，获得染色体DNA 用于后续实验。
实验十 质粒DNA 的提取与纯化
一、实验目的与原理
细菌质粒为双链、环状、共价的DNA 分子，其大小范围从1Kb-200Kb 不等。他们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋予菌体一些特殊的表型，这些表型主要有针对抗生素的抗性、修饰酶等。有些质粒DNA 分子量较小，特别是与自身遗传相关的DNA 分子极小，可携带外源基因量较大，且转移性强、拷贝数高、还带有选择性标记，因此质粒是进行分子生物学操作和进行遗传改良物种等工作的主要DNA 载体。
质粒DNA 的提取是分子生物学试验中最重要、最基本的实验之一。根据实验目的的不同，质粒DNA 的提取方法不同。但基本步骤为三步。第一，细菌的培养和质粒的扩增；第二，细菌菌体的破碎；第三，质粒DNA 的纯化。菌体裂解方法不同决定了质粒DNA 提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS 法，碱解法，Triton-溶菌酶法等。质粒DNA 纯化主要有梯度离心法、柱层析法等。
二、材料与方法
1．材料：大肠杆菌
2．仪器：
超净工作台，培养箱，摇床，超级恒温箱或恒温水浴，台式离心机，取液器一套，低温水箱或冰柜，冷冻真空干燥器，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪
3．试剂：
Solution Ⅰ 50mM葡萄糖
25mM Tris-HCL(Ph 8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)
高压灭菌，4℃保存
Solution Ⅱ 0.2M NaOH ,1%SDS,现配现用
Solution Ⅲ 5N KAC pH4.8, 高压灭菌，4℃保存
3M NaAC Ph5.2 高压灭菌，4℃保存，氨苄青霉素 25mg/ml,溶菌酶 8mg/ml,氯仿/酚，异丙醇，LB 培养基，电泳试剂
4．操作步骤：
含氨卞（100ug/ml）的LB 培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜
吸取1.5ml, 5000rpm,1－2min 离心，取沉淀（菌体细胞），加入预冷的100ul Solution Ⅰ, 充分震荡悬浮菌体；
加入200ul Solution Ⅱ, 颠倒3-5次，冰浴3-5min ；
加入150ul Solution Ⅲ, 颠倒3-5次，冰浴5min, 离心 12000rpm 5min； 取上清，加等体积氯仿，混匀静置2-4min ；
离心 12000g 2-4min；
取上清，加2倍体积乙醇，1/10 体积乙酸钠，-80℃,5-10min ；
12000g 离心10min ；
取沉淀；
冷冻干燥，在悬浮于30ul ddw中，1.2%Argose胶电泳鉴定。
三、实验结果
开环
线性
超螺旋
图7 大肠杆菌质粒DNA 电泳图
对提取的质粒DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，共得到三条带，跑的最慢的是我们提取的开环的质粒DNA 分子，中间的条带是操作过程中断裂的线性DNA 分子，跑在最前面的应该是超螺旋的质粒DNA 分子。
实验十一 酶切技术
一、目的与原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来DNA 的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的DNA 片段5’端为Ｐ，3’端为OH 。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA 链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA 结构或克隆基因。这类酶如EcoB 、EcoK
等。第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性
内切酶。它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA 片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4～6个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生3种不同的切口：5’端突出；3’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。
二、材料与方法
1．材料：λ DNA
2．仪器：离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪
3．试剂：EcoRI 及缓冲液，HindIII 及缓冲液，λDNA,TAE缓冲液
4．操作
EcoRI 、HindIII 双酶切， 取2只干净、灭菌新Eppendorf 管，分别如下加入（μl） 试剂 A 管
（gene ）
ddw
样品
Buffer
EcoRI
HindIII
总体积 10 6 2 1 1 20 B 管 （λDNA） 13 3 2 1 1 20 C 管（plasmid ） 12 4 2 1 1 20
37℃保温2小时。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。
三、实验结果
双酶切的结果表明DNA 已被切割成若干段，由maker 可以得到带相对的大小，带的亮度表明了相对量的多少。
实验十二 DNA 片段的连接技术
一、目的与原理
酶切片段的联接是两DNA 片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA 连接酶和T4DNA 连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA 连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA 连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA 片段的连接技术。
二、材料和方法
1．仪器：离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器
2．试剂：T4DNA 连接酶，10×T4DNA 连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE 缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAC
3．操作：
取干净、灭菌新Eppendorf 管，加入各试液如下（μl）
试液
ddw
T4DNA 连接酶缓冲液
质粒载体(酶切后的)
λDNA
T4连接酶
总体积 体积 13.5 1.5 3 1 1 15
4℃ 保温过夜，提取已连接好的DNA 片段，电泳分析。
三、实验结果
1 2 3
1、基因组DNA ；2，λDNA；3，质粒DNA
图8 双酶切电泳图
可见酶切后各片段大小。第一泳道，亮白色的一堆，可能是RNA 残留的。在3泳道中有2个酶切片段。
实验十三 受体菌感受态细胞的制备
一、目的与原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年) ，因此 CaCl2法为使用更广泛。
二、材料与方法
1. 材料：大肠杆菌
2. 仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
3. 试剂：LB 培养基，0.1M MgCl2，3mM 氯化6氮合高钴
TFB ：10Mm MES（Ph6.3）
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作
大肠杆菌在LB 培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB 培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml 培养物7000rpm ，离心3min ，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm 离心3min 。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm 离心3min 。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙（或TFB ），放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。
四、实验结果
获得感受态细胞用于实验中的转化受体。
实验十四 遗传转化
一、目的与原理
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，M ˉ) ，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA 分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞) 。克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA 分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的
平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。
重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有a- 互补、小规模制备质粒DNA 进行酶切分析、插入失活、PCR 以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA 进行酶切分析，对于带有LacZ 基因的载体还可以结合a-互补现象来筛选。
a-互补现象：
因为许多载体都带有一个LacZ 基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码a-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型a-半乳糖苷酶实现基因内互补（a-互补）。当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG ）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为a-互补现象。
由互补产生的β-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b －D －半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA 片段时，会造成LacZ(a-)基因的失活，破坏a-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
二、材料与方法
1．材料：大肠杆菌
2．仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
试剂：
LB 培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; 3mM氯化6氨高钴。TFB ：10mM MES（pH
6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作过程
1. 现制感受态细胞可直接使用; b:冻存感受态细胞在手心缓慢融化.
2. 加入待转化外源DNA(40ng左右) ，冰浴30min 。
3．42℃热冲击1分30秒
4．冰浴5min
5．加入1mlLB 液体培养基，37℃保温45分钟－1小时。
6．取20－200ul 菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB 培养基上（本实验中为100ug/ml的安卞青霉素培养基），３７℃保温过夜。
温浴后加菌液到培养基上同时加入4ulIPTG,20ulX-gal(如用兰白斑筛选）。 观察菌落形态与颜色。
四、实验结果
培养皿上会出现白色菌落和蓝色菌落，但蓝色菌落数量很少。蓝色菌落表示其中的转化子能产生有功能的β-半乳糖苷酶，是由于转化的是切割后自连接的载体。虽然是转化子，却不是我们需要的。只有白色菌落，才是含有外源DNA 的转化子，由于外源DNA 的插入使不能产生有功能的β-半乳糖苷酶，所以不能分解X-gal ，这就是我们所需要的重组子。
本实验观察：蓝、白色菌落散落分布，白色菌落较少。
五、结果分析：
未得到所需重组子原因很多，首先连接的效率不是很高，由电泳图片可以观察到，但连接的产物应该还是可以转化成功的。其次，感受态细胞制备操作过程中可能有失误，造成转化失败。再者，用于培养转化细胞的固体培养基可能出了问题（可能放置时间太长），由平板上蓝色菌落也很少，可以得出这方面的失误的可能性较大。还或者是在操作过程中，由于操作不规范造成质粒载体效率下降。
生物化学大实验
第一部分 实验一 一、原理与目的
多酚氧化酶（PPO ）的分离提取
蛋白质提取、纯化及分析技术
多酚氧化酶（有3类，儿茶酚酶、戚酶、甲苯酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节，属于末端氧化酶的一种。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO 催化酚与O 2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：
NADH ＋H +醌2O
底物 NAD + 酚2
但是PPO 的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。
多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO 的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。 二、材料与试剂
（1）马铃薯（大约每小组150-200g ） （2）试剂：
0.03M 磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m 巯基乙醇，0.001m EDTA ，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮) 配制时配×10倍的浓缩液1000ml ；固体硫酸铵；0.03M 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m 巯基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置时配。 （3）实验器械与仪器设备：
试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH 计和PH 试纸；GL-20C 高速冷冻离心机；
DL-7A 大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤
1．粗酶提取：
马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001m EDTA ，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm 离心10min ，弃除沉淀获得酶提取液。 2．盐析分级沉淀：
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm 离心20min 弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm 离心20min ，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。沉淀用0.03M 磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02N KCL 溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。 四、实验结果
获得PPO 粗酶液供上柱使用。
实验二 胰酶分离提取
一、原理与目的
胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取时普通生物化学实验的最主要、最经典的实验。
胰蛋白酶结晶最初以牛的胰脏为材料而制备，现用羊、猪、马、鼠等哺乳动物的胰脏亦可制备结晶。所不同的是，在提取制备的过程中所需的pH 值、PI 和结晶的构型上有区别。
提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。
胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH 酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH 下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理
条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N 端Lys 与Ile 之间的 一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI 变成10.8。
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。 二、材料与试剂
1．仪器
紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH 计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH 试纸，滤纸、玻璃器皿等。
2．材料：新鲜猪胰脏 3．试剂及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH 溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL 溶液、0.01M HCL 溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M ，用时稀释一倍）、Tris 、硫酸铵。0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M 四硼酸钠溶液，混合后用PH 计校正。 三、操作步骤
（1）新鲜猪胰脏一个，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，低温下用绞肉机绞碎，加入1-2倍体积预冷的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液（100ml ）提取。用10%乙酸调节pH 在3.0以下，冷室5℃提取20h 。胰蛋白酶提取关键：控制低温；控制pH 低于3.0，维持胰蛋白酶提取过程中的稳定。操作过程中的问题：乙酸调节酸度不稳定。
（2）过夜后粗提取物四层纱布过滤，滤液呈乳白色，滤渣再加入50ml 乙酸溶液浸提残渣，浸提2h 。合并滤液。
（3）浸提液离心，取上层黄绿色清液，加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度， 盐析1hr 。
（4）冷置后离心12000rpm 离心 10min，得胰蛋白酶粗制品。
（5）上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr ；12000rpm 离心 10min； 沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1M Tris 透析过夜，4 ℃保存。
四、实验结果
获得胰酶粗提液。
实验三 卵清蛋白分离提取
一、原理与目的
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1.鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同的组份，PI 的范围为3.9-4.5,280nm 的消光系数为A=4.13（1%，1cm ）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。
由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱。 二、材料与试剂：
1．材料：新鲜鸡蛋2只
2：仪器：抽滤瓶500－1000ml 、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂：
10％TCA ，用固体NaOH 调调PH 至1.05－1.10，需要50ml 、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M ，PH8.0Tris-HCL 缓冲液（每ml 含0.34BAEE 和2.22mgCaCL2），50ml ；pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤
（1）新鲜鸡蛋两枚取蛋清50ml 于烧杯中。25℃外用热水浴中缓慢加入50ml 三氯乙酸-丙酮（V/V1:2）, 再继续搅拌30min 。4℃静置过夜
操作关键：要在热水浴中缓慢加入有机溶剂，不可在热水浴之前加入；取蛋清时注意不能混入蛋黄，否则引入杂蛋白。
（2）粗提取物于50ml 离心管10000g 离心10min ，取上清液50ml ，加入4℃预冷的丙酮200 ml，4℃放置2h 。
（3）放置后取沉淀离心10000 rpm离心5 min，收集沉淀加沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次。收集沉淀，再对碳酸钠缓冲溶液透
析过夜。
（4）透析液离心4000g 10min ，取上层清液，加蒸馏水至35ml ，用于亲和柱层析。
四、实验结果
得到卵清蛋白纯化物。
实验四 离子交换层析和凝胶色谱层析纯化PPO
一、原理与目的
柱层析技术是最常用的蛋白质纯化手段，在普通生化操作中通过离子交换层析和凝胶层析连用实现蛋白质的纯化。
离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有解离基团，在水中能与溶液中其他离子起交换作用。当一定量的溶液通过交换柱时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被吸附到树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至把离子交换剂上的原离子全部洗脱下来。以上两种成分被交换着吸附在离子交换剂上，用洗脱剂洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。
本实验中用凝胶色谱技术分离纯化PPO 。其原理是通过分子筛效应，将样品中某一固定大小的蛋白质分子分离出来。 二、材料与试剂
试剂：0.02M Tris-HCL 缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA) 配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL; 聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等；
实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH 计和pH 试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A 大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤
1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 （1）柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h, 去掉悬浮
的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm 处，保持液面比胶面高1-2cm ，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
3）平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH 值与平衡缓冲液的PH 值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL 缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。
2．上样：将粗酶液上柱。
3．洗脱：用0.02M Tris-HCL 缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA ）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4．测定酶活性和蛋白质浓度 四、实验结果
加考马司亮兰检测蛋白，取含有蛋白的洗脱液，以供后续实验检测蛋白含量和酶活用。
实验五 酶含量及活性测定
一、原理与目的
蛋白质含量测定是生物化学实验中一个重要的实验技术。测定方法主要有：1，根据蛋白质中N 含量基本恒定（16%）为基础的凯氏定氮法；2，根据组成蛋白质的Phe 、Trp 、Tyr 3个带苯环氨基酸在280nm 具有吸收的特性为基础的紫外吸收法；3，利用蛋白质的一些特殊理化反应，使蛋白质与一些专一性化学试剂反应产生颜色，其颜色深浅与蛋白质浓度相关为基础的双缩脲法和Lawry 法、考马斯亮蓝G-250法等。
双缩脲法：蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm 下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线，求出未知样品的蛋白质浓度。
考马斯亮蓝G-250测量蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm 转变为595nm 。在一定的蛋白质浓度范围内，595nm 处的光密度值与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋白质定量测定。 二、仪器与试剂
1．材料：经硫酸铵沉淀获得PPO 粗酶液，Sephadex G-200分离纯化的酶液样品。 2．仪器与器皿： 分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。 3．试剂：考马斯亮蓝G-100蛋白试剂：称取100mg 考马斯亮蓝G-100溶于50ml90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100ml ，最后加入无离子水或蒸馏水定容到1000ml ，此溶液可在常温下放置一个月。 三、操作步骤
样品中蛋白质浓度的测定：
蛋白质含量测定（595nm ）。96孔酶标板依次加入考马斯亮兰100微升，样品20微升，原酶液20微升，对照为Tris-HCl 缓冲液20微升。用DG5031型酶联免疫检测仪测定蛋白质含量。
样品中PPO 活性的测定：酶标板依次加入磷酸-柠檬酸缓冲液20μL →底物邻苯二酚20μL →样品20μL ，原酶液20μL ，对照为Tris-HCl 缓冲液20μL 。
四、实验结果
1. 葡聚糖凝胶纯化结果：
表1 葡聚糖凝胶柱处理后PPO 蛋白含量和酶活性（OD 值）
洗脱体积 CK 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
粗 酶
酶 活 0 0 0.05 0.57 0.60 0.67 0.2 0.3 0.21 0.12 0.07 0.07 0.77 蛋白含量 0 0 0 0.43 0.37 0.44 0.18 0.43 0.12 0.07 0.05 0.04 0.51
从上图和上表中可得出如下结论：随着洗脱体积的变化，纯化后蛋白质含量和酶活性都出现峰值，从第2管开始蛋白质含量迅速增加，第5管时达到最大值（0.44）。酶活性在第5管时达到最大值，酶活曲线与蛋白质含量曲线走势相似。比酶活在第5管时达到最大。初酶蛋白含量很高，但酶活性却很低，即比酶活较低，主要是因为其中非酶的杂蛋白含量较高。 2. 离子交换柱纯化结果：
表2 离子交换柱纯化后PPO 的酶活与蛋白质含量测定（OD 值）
管号 酶活 蛋白含量 管号 酶活
管号 酶活 蛋白含量
18 0.12 0.058
19 0.13 0.067
20 0.17 0.056
21 0.16 0. 098
22 0.17 0.071
23 0.19 0.067
24 0.16 0.048
粗酶 0.45 0.315
一纯 0.52 0.430
9 0.23
10 0.23 0.104
11 0.18 0.104
12 0.15 0.094
13 0.14 0.086
14 0.12 0.065
15 0.09 0.058
16 0.10 0.06
17 0.10 0.088
CK 0 0
1 0 0
2 0.04 0.035
3 0.09 0.049
4 0.13 0.056
5 0.13 0.052
6 0.15 0.074
7 0.16 0.08
8 0.20 0.10
蛋白含量 0.102
从上述图表中可得离子交换层析法纯化PPO 后，在第9管和23管处，无论蛋白含量还是酶活均出现了两个峰值，据此可得出，PPO 存在至少两种同工酶。两次纯化差异大，说明纯化效果明显。
实验六 亲和层析纯化胰酶
一、原理与目的
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
本实验通过将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。 二、仪器与试剂
1. 鸡卵粘蛋白制备
2．Sephadex-G75的活化和偶联。2．5g 干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL 溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml 水）
3．亲和层析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml 、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N 甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml
仪器器材：抽滤瓶500-1000ml 、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器 三、操作步骤 1. 鸡卵粘蛋白的制备 2.Sephadex-G75的活化及偶联
2.5g 干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL
溶液50ml ,30min ，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml 水，加入活化葡聚糖凝胶，75％K2CO3，调pH7.5-9.0, 缓慢搅拌3h 。反应过程随时加入5％K2CO3, 以维持pH 的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml 水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h ，pH 维持在6.5-7.5，洗涤。
3．胰蛋白酶的亲和层析
（1）亲和层析
将鸡卵粘蛋白－Sephadex-G75装柱（1×10cm ）, 用pH7.5,0.1M 含 0.5M
KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2－3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm 处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N 的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。
当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱
可以反复使用。
（2）胰酶蛋白和活性测定
四、实验结果
表3 亲和层析处理过柱后酶活与蛋白质含量（OD 值）
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 蛋白含量 0.043 0.101 0.121 0.065 0.171 0.150 0.132 0.078 0.073 0.098
管号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 粗酶 蛋白含量 0.049 0.047 0.050 0.048 0.065 0.038 0.051 0.047 0.043 0.045 0.433
从图表中可以看出，蛋白质含量曲线随着洗脱体积的不同出现了两个大的个峰值。第5管蛋白质含量达到最高。表明杂蛋白洗除的比较好。
实验七 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定
一、原理与目的
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS 是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较
PAGE 电泳中各种成分及其作用：过硫酸铵：凝胶聚合的催化剂（过量会使离子强度升高），四甲基乙二胺：加速剂。（碱性条件下容易聚合）丙烯酰胺与双丙烯酰胺（P133) 二者总浓度及相对比例决定凝胶的孔径、交联度，硬度及弹性。
不连续性SDS-PAGE 浓缩胶与分离胶的性质和作用
浓缩胶：胶浓度低，交联度低，pH=6.7，蛋白带负电荷少，大孔胶。 pH=6.7时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较少（慢离子），氯离子是快离子，蛋白迁移速率介于两者中间，局部电位梯度大，（快离子移动快，形成局部低电导区，产生高电位，使移动加快）从而产生浓缩效应。
分离胶：胶浓度高，交联度高， pH=8，蛋白带负电荷多，小孔胶， pH=8.0时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较多，与氯离子一样，迁移速度加快，蛋白迁移速率最慢，部电位梯度小。
二、仪器与试剂
1．材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。
2．试剂：
（1）丙稀酰胺(Acr母液) ：30％Acr （Acr/Bis）
（2）10％的SDS 溶液
（3）10％的过硫酸铵溶液
（4）四甲基乙二胺（TEMED ）
（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8
（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8
（7）电极缓冲液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS ，加水溶解定容至1000ml,pH8.3
（8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰
（9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液
（10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液
（11）标准分子量蛋白。
3．仪器设备： 电泳仪，垂直电泳槽等。
三、操作步骤
1. 凝胶制备：
用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。
分离胶和浓缩胶的配备分别是：
30%的胶母 12.5mL 胶母液 2.5 mL PH8.8Tris 缓冲液 10 mL PH8.8Tris 缓冲液 2.5 mL
水 7.4 mL 水
14.5 mL
SDS 800 uL SDS 400 uL
AP 150uL AP 150uL
TEMED 25uL TEMED 25uL
2. 上样：分别取样品若干ml 于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min ，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul 不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA （2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm 时，即可停止电泳。
3．染色：电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h 后，即可看到清晰的蛋白质条带。
4. 脱色。
四、实验结果
1 2 3 4 5
1，粗酶；2，葡聚糖凝胶柱层析纯化酶；3，离子交换柱层析纯化酶；
4，粗胰酶；5，亲和层析纯化酶。
图4 PPO 和胰酶提取纯化效果
SDS-PAGE 电泳图可见，纯化过程中目的条带逐渐明显，即目的蛋白相对含量逐渐增加，杂条带逐渐消失。但进一步提纯后，条带消失，可能在进一步的柱层析过程中，制作的柱材料有问题，目的蛋白没有挂柱，随缓冲液流走了，故未得到目的蛋白。
实验八 Western-blotting
一、原理
Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE 电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western Blot编辑本段回目录此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶) 来检测，此方法可检测1ng 抗原蛋白。Western 杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng 的特异性的目的蛋白。
二、仪器与试剂
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L 水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)考马斯亮蓝溶液
三、操作步骤
(1)用已制备好的SDS-PAGE 分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad 上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入考马斯亮蓝S 溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL 封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中) ，封闭特异性抗体结合位点，室温1h ，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL 新配制的DAB 底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
四、结果分析
目的条带
分析阳性(显色) 条带的分子量大小，而且根据信号(颜色) 强弱分析蛋白表达量。
图5 Western-blotting
图示表明，目的条带清晰可见，无杂带出现。
二 核酸部分
实验九 染色体DNA 的提取
一、原理
DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA 的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA 提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。本实验通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA 进入水相与蛋白质分开，在RNase 的作用下，降解RNA 以纯化DNA 。通过实验学习和掌握提取基因组DNA 的原理和方法。
二、材料
1．材料： 培养菌体
2．仪器设备：
超净工作台、培养箱、摇床、高速冷冻离心机、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、取液器一套、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪
3．试剂：
细胞裂解液
100m M Tris-HCL
5mM EDTA
5OOm M NaCL
1.25%SDS
pH7.5
饱和酚 氯仿/异戊醇 酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70％无水乙醇 3M NaAC RNase 50×TAE 缓冲液 电泳载样缓冲液
三、操作步骤：
培养菌体；
培养好的菌液1.5ml 离心收集菌体 + 600ul细胞裂解液（65℃预热）悬浮菌体，60ul 酚混合（变性蛋白，操作应缓和，不可剧烈振荡，以免DNA 烈解）；
65℃ 30min(5-10min,混匀一次) ；
+600ul 氯仿，混匀，静置4-5min ；
15000g 离心，10min ；取上清，等体积氯仿抽提一次。
吸取上清，+1/10体积的乙酸钠，2倍体积的乙醇，置于-70℃,20min ；
10000g 离心10min, 复溶于40-100ul 的无菌水中；
70％乙醇洗沉淀，离心10min, 真空干燥；
复溶于30-40ul 的无菌水中，电泳。
四、实验结果
目的条带
图6 大肠杆菌基因组DNA 电泳图
所提取的大肠杆菌基因组DNA 由琼脂糖凝胶电泳分析结果，泳道较清晰，有一条很亮的DNA 条带，其下方有三条亮带，可能为未降解的RNA ，获得染色体DNA 用于后续实验。
实验十 质粒DNA 的提取与纯化
一、实验目的与原理
细菌质粒为双链、环状、共价的DNA 分子，其大小范围从1Kb-200Kb 不等。他们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋予菌体一些特殊的表型，这些表型主要有针对抗生素的抗性、修饰酶等。有些质粒DNA 分子量较小，特别是与自身遗传相关的DNA 分子极小，可携带外源基因量较大，且转移性强、拷贝数高、还带有选择性标记，因此质粒是进行分子生物学操作和进行遗传改良物种等工作的主要DNA 载体。
质粒DNA 的提取是分子生物学试验中最重要、最基本的实验之一。根据实验目的的不同，质粒DNA 的提取方法不同。但基本步骤为三步。第一，细菌的培养和质粒的扩增；第二，细菌菌体的破碎；第三，质粒DNA 的纯化。菌体裂解方法不同决定了质粒DNA 提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS 法，碱解法，Triton-溶菌酶法等。质粒DNA 纯化主要有梯度离心法、柱层析法等。
二、材料与方法
1．材料：大肠杆菌
2．仪器：
超净工作台，培养箱，摇床，超级恒温箱或恒温水浴，台式离心机，取液器一套，低温水箱或冰柜，冷冻真空干燥器，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪
3．试剂：
Solution Ⅰ 50mM葡萄糖
25mM Tris-HCL(Ph 8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)
高压灭菌，4℃保存
Solution Ⅱ 0.2M NaOH ,1%SDS,现配现用
Solution Ⅲ 5N KAC pH4.8, 高压灭菌，4℃保存
3M NaAC Ph5.2 高压灭菌，4℃保存，氨苄青霉素 25mg/ml,溶菌酶 8mg/ml,氯仿/酚，异丙醇，LB 培养基，电泳试剂
4．操作步骤：
含氨卞（100ug/ml）的LB 培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜
吸取1.5ml, 5000rpm,1－2min 离心，取沉淀（菌体细胞），加入预冷的100ul Solution Ⅰ, 充分震荡悬浮菌体；
加入200ul Solution Ⅱ, 颠倒3-5次，冰浴3-5min ；
加入150ul Solution Ⅲ, 颠倒3-5次，冰浴5min, 离心 12000rpm 5min； 取上清，加等体积氯仿，混匀静置2-4min ；
离心 12000g 2-4min；
取上清，加2倍体积乙醇，1/10 体积乙酸钠，-80℃,5-10min ；
12000g 离心10min ；
取沉淀；
冷冻干燥，在悬浮于30ul ddw中，1.2%Argose胶电泳鉴定。
三、实验结果
开环
线性
超螺旋
图7 大肠杆菌质粒DNA 电泳图
对提取的质粒DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，共得到三条带，跑的最慢的是我们提取的开环的质粒DNA 分子，中间的条带是操作过程中断裂的线性DNA 分子，跑在最前面的应该是超螺旋的质粒DNA 分子。
实验十一 酶切技术
一、目的与原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来DNA 的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的DNA 片段5’端为Ｐ，3’端为OH 。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA 链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA 结构或克隆基因。这类酶如EcoB 、EcoK
等。第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性
内切酶。它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA 片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4～6个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生3种不同的切口：5’端突出；3’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。
二、材料与方法
1．材料：λ DNA
2．仪器：离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪
3．试剂：EcoRI 及缓冲液，HindIII 及缓冲液，λDNA,TAE缓冲液
4．操作
EcoRI 、HindIII 双酶切， 取2只干净、灭菌新Eppendorf 管，分别如下加入（μl） 试剂 A 管
（gene ）
ddw
样品
Buffer
EcoRI
HindIII
总体积 10 6 2 1 1 20 B 管 （λDNA） 13 3 2 1 1 20 C 管（plasmid ） 12 4 2 1 1 20
37℃保温2小时。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。
三、实验结果
双酶切的结果表明DNA 已被切割成若干段，由maker 可以得到带相对的大小，带的亮度表明了相对量的多少。
实验十二 DNA 片段的连接技术
一、目的与原理
酶切片段的联接是两DNA 片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA 连接酶和T4DNA 连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA 连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA 连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA 片段的连接技术。
二、材料和方法
1．仪器：离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器
2．试剂：T4DNA 连接酶，10×T4DNA 连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE 缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAC
3．操作：
取干净、灭菌新Eppendorf 管，加入各试液如下（μl）
试液
ddw
T4DNA 连接酶缓冲液
质粒载体(酶切后的)
λDNA
T4连接酶
总体积 体积 13.5 1.5 3 1 1 15
4℃ 保温过夜，提取已连接好的DNA 片段，电泳分析。
三、实验结果
1 2 3
1、基因组DNA ；2，λDNA；3，质粒DNA
图8 双酶切电泳图
可见酶切后各片段大小。第一泳道，亮白色的一堆，可能是RNA 残留的。在3泳道中有2个酶切片段。
实验十三 受体菌感受态细胞的制备
一、目的与原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年) ，因此 CaCl2法为使用更广泛。
二、材料与方法
1. 材料：大肠杆菌
2. 仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
3. 试剂：LB 培养基，0.1M MgCl2，3mM 氯化6氮合高钴
TFB ：10Mm MES（Ph6.3）
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作
大肠杆菌在LB 培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB 培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml 培养物7000rpm ，离心3min ，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm 离心3min 。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm 离心3min 。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙（或TFB ），放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。
四、实验结果
获得感受态细胞用于实验中的转化受体。
实验十四 遗传转化
一、目的与原理
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，M ˉ) ，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA 分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞) 。克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA 分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的
平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。
重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有a- 互补、小规模制备质粒DNA 进行酶切分析、插入失活、PCR 以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA 进行酶切分析，对于带有LacZ 基因的载体还可以结合a-互补现象来筛选。
a-互补现象：
因为许多载体都带有一个LacZ 基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码a-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型a-半乳糖苷酶实现基因内互补（a-互补）。当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG ）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为a-互补现象。
由互补产生的β-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b －D －半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA 片段时，会造成LacZ(a-)基因的失活，破坏a-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
二、材料与方法
1．材料：大肠杆菌
2．仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
试剂：
LB 培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; 3mM氯化6氨高钴。TFB ：10mM MES（pH
6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作过程
1. 现制感受态细胞可直接使用; b:冻存感受态细胞在手心缓慢融化.
2. 加入待转化外源DNA(40ng左右) ，冰浴30min 。
3．42℃热冲击1分30秒
4．冰浴5min
5．加入1mlLB 液体培养基，37℃保温45分钟－1小时。
6．取20－200ul 菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB 培养基上（本实验中为100ug/ml的安卞青霉素培养基），３７℃保温过夜。
温浴后加菌液到培养基上同时加入4ulIPTG,20ulX-gal(如用兰白斑筛选）。 观察菌落形态与颜色。
四、实验结果
培养皿上会出现白色菌落和蓝色菌落，但蓝色菌落数量很少。蓝色菌落表示其中的转化子能产生有功能的β-半乳糖苷酶，是由于转化的是切割后自连接的载体。虽然是转化子，却不是我们需要的。只有白色菌落，才是含有外源DNA 的转化子，由于外源DNA 的插入使不能产生有功能的β-半乳糖苷酶，所以不能分解X-gal ，这就是我们所需要的重组子。
本实验观察：蓝、白色菌落散落分布，白色菌落较少。
五、结果分析：
未得到所需重组子原因很多，首先连接的效率不是很高，由电泳图片可以观察到，但连接的产物应该还是可以转化成功的。其次，感受态细胞制备操作过程中可能有失误，造成转化失败。再者，用于培养转化细胞的固体培养基可能出了问题（可能放置时间太长），由平板上蓝色菌落也很少，可以得出这方面的失误的可能性较大。还或者是在操作过程中，由于操作不规范造成质粒载体效率下降。