胶原_明胶和水解胶原蛋白的性能差异_李国英

DOI :10. 15961/j . jsuese . 2005. 04. 012

第37卷第4期2005年7月

四川大学学报(工程科学版)

JOUR NAL OF SICHUAN U NIVER SITY (ENGINEERING SCIENCE EDITION )

Vol . 37No . 4Jul y 2005

文章编号:1009-3087(2005) 04-0054-05

胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异

李国英, 张忠楷, 雷　苏, 石　碧＊

(四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室, 四川成都610065)

摘　要:由于胶原、明胶和水解胶原蛋白制备工艺的差异, 造成它们在结构和性能上存在较大的差别。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE ) 方法确定3种样品的相对分子质量及其分布。结果表明:胶原的相对分子质量大约为30万, 分布很窄; 明胶的相对分子质量从几千到10万, 分布很宽; 水解胶原蛋白相对分子质量从几千到3万, 分布也很宽。3种样品中只有胶原和明胶能够成膜, 但是胶原膜的抗张强度(58N /mm 2) 大于明胶膜(36N /mm 2) , 并且只有胶原膜在扫描电子显微镜(SEM ) 下呈现出纤维结构。纤维成形实验表明只有胶原才具有成纤维能力。角质形成细胞培养实验证明了只有胶原有利于细胞的吸附和生长, 明胶和水解胶原蛋白与培养皿培养的参比样相似, 都对细胞的吸附和生长无明显的促进作用。由此得出结论:只有胶原才有生物活性, 具有比明胶和水解胶原蛋白更大的潜在生物医学用途。关键词:胶原; 明胶; 水解胶原蛋白中图分类号:TS59

文献标识码:A

Differences in Properties of Collagen , Gelatin and Collagen Hydrolysate

LI G uo -ying , ZH ANG Zhong -kai , LEI Su , SHI Bi

＊

(The Key Lab . of Leather Che m . and Eng . of Minis try of Education . Sichuan Univ . , Chengdu 610065, China )

A bstract :There are many differences in structures and pr operties a mong collagen , gelatin and collagen hydrolysate be -cause of different preparation processes . The molecular weight and distribution of sa mples were determined by sodium do -decyl sulphate -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS -PAGE ) . The r esults showed that the molecular weight of colla -gen is about 300, 000daltons and narr ow distribution , which is greater than those of gelatin (from several thousands to 100, 000Daltons and wide distribution ) and colla gen hydr olysate (from several thousands to 30, 000Daltons and wide distribution ) . Fibril formation experiments demonstrated that only collagen has the ability to form fibril . In addition , col -lagen membrane (58N /mm ) has higher extension strength than gelatin membrane (36N /mm ) and presented remarkable fibril shape as obser ved by scanning electron microscope (SEM ) , and c ollagen hydr olysate could not form membrane . Furthermore , keratinocyte culture experiment proved that only collagen has significant effects on cell attachment and pro -liferation , and cells cultured on gelatin and collagen hydrolysate showed similar properties to those of cells cultured on dish . It can be c oncluded that collagen with its biological activity has greater potential to be used as biological material compared to gelatin or collagen hydrolysate . Key words :colla gen ; gelatin ; colla gen hydrolysate

收稿日期:2005-03-10

基金项目:高等学校优秀青年教师教学科研奖励基金资助项目(2001-2005) ; 四川大学归国留学人员科研启动基金资助项目(2004-2005) 作者简介:李国英(1967-) , 女, 教授. 研究方向:动物生物质利用. 　＊通讯联系人

第4期李国英, 等:胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异

　　胶原是构成动物机体的重要功能物质, 遍布动物内的各处器官, 并对各器官的正常生理功能的调节起着举足轻重的作用。胶原具有其他合成材料无

法比拟的生物相容性、可生物降解性以及生物活性, 比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等。胶原经特殊处理后, 可用于烧伤和创伤治疗、美容、矫形、组织修复、创面止血等医药卫生领域。现已运用于临床中的有用于烧伤创伤治疗的胶原膜, 用于美容矫形的胶原医用注射剂, 用于创伤止血的胶原止血海绵等。胶原作为一种皮肤结构蛋白质, 在护肤品中起着滋润、调理和保湿等作用。因此, 胶原作为天然的生物资源, 可以广泛应用于食品、医药、组织工程、化妆品等领域

[1]

甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、MCDB153和KGM -2细胞培养液, 胰酶1∶250; B 型明胶, 华美生物工程公司; 牛血清白蛋白, 北京元亨圣马生物技术

研究所; L -羟脯氨酸、考马斯亮蓝R250, 上海伯奥生物科技公司; 对二甲氨基苯甲醛, 天津傲然精细化工研究所; 氯氨T , 成都科龙化工试剂厂。

水浴振荡器HZS -H , 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司; 高速冷冻离心机GL -20G -Ⅱ, 上海安亭科学仪器厂; 电泳仪Mini -PROTEAN 3Cell As -sembly , 美国BI O -RAD 公司; 恒温水浴锅B -260, 上海亚荣生化仪器厂; 紫外可见分光光度计UV751GD , 上海分析仪器总厂; 扫描电子显微镜JSM -5900LV , 日本JEOL 公司; 显微镜IMT -2, 日本OLY MPUS 公司。1. 2　胶原的制备

新鲜牛皮, 脱脂、脱毛后充分水洗, 再切成碎块匀浆。称取20g 匀浆后的物料, 在4℃用适量的胃蛋白酶作用24h 。以10, 000r /min 速度离心30min 得到上清液, 经盐析、透析处理后, 冷藏备用。用Bergman 和Loxley 方法测定羟脯氨酸含量, 确定胶原的浓度。1. 3　水解胶原蛋白的制备

称20g 明胶溶于去离子水, 用适量胰蛋白酶在42℃水解明胶液得到水解胶原蛋白。用Biuret 方法测定水解胶原蛋白的浓度。1. 4　电泳(SDS -PAGE ) 分析

先配制相同浓度的胶原、明胶和水解胶原蛋白溶液, 与样品处理液(将SDS 、甘油、B PB 、β-巯基乙醇溶于Tris -HCl 缓冲液中) 混合, 在沸水中加热5min , 冷却备用。用7. 5%丙烯酰胺凝胶对胶原、明胶以及水解胶原蛋白进行电泳分析。采用考马斯亮蓝R250染色, 7. 5%醋酸和5%甲醇溶液脱色。1. 5　成膜及其性能表征

分别将10ml 浓度为5mg /ml 的胶原、明胶和水解胶原蛋白溶液倒入培养皿中, 在室温下干燥、成膜。用扫描电子显微镜观察膜的形貌特征, 并测定膜的抗张强度和断裂伸长率。1. 6　再纤维试验

取胶原、明胶和水解胶原蛋白溶液各10ml , 浓度均为0. 5mg /ml , 装入透析袋中, 用缓冲液(0. 1mol /L Na 2HPO 4, 0. 05mol /L 柠檬酸, pH =7. 2) 透析后于313nm 处观察其吸光度随时间变化情况, 得到它们的纤维形成曲线[7]。用扫描电子显微镜观察形[6]

[5]

。

明胶是胶原在高温作用下的变性产物, 在食品、

医药卫生等方面也有重要的应用价值[2]。明胶是一种营养价值较高的低卡保健食品, 在食品中的应用有:糖果添加剂, 使糖果更富弹性、韧性和透明性; 冷冻食品添加剂, 比如胶冻剂、稳定剂等; 肉制品改良剂, 比如作为胶冻剂添加到肉制品中, 可以提高产品的质量; 此外, 还可用作乳制品添加剂, 食品涂层材料及蛋糕制作。明胶在医药卫生方面主要用于制作药物胶囊。

水解胶原蛋白是胶原的水解产物, 具有更小的相对分子质量, 并且更易降解, 所以在营养保健品和日用化学品开发方面拥有一定的市场。水解胶原蛋白可用于生物发酵培养基, 也可以作为一种高蛋白饲料营养添加剂替代进口鱼粉用于混、配合饲料生产。

胶原、明胶和水解胶原蛋白这3种物质虽具有同源性, 但在结构和性能上却有很大的区别。胶原保留特有的天然螺旋结构, 在某些方面表现出明显优于明胶和水解胶原蛋白的性能, 如胶原止血海绵止血性能优于明胶海绵[3], 作为澄清剂用的鱼胶原如果变性则沉降能力明显降低。然而, 目前人们对这3种物质的认识常常产生混淆, 认为它们具有相同性质, 甚至认为它们是同一种物质。作者选用胶原、明胶和水解胶原蛋白来源于牛皮I 型胶原, 从它们性能差异着手, 用实验说明它们之间的区别以指导各自的开发利用。

[4]

1　实验部分

1. 1　试剂及仪器

1. 7　角质形成细胞的分离和培养

四川大学学报(工程科学版) 第37卷

验制备过程中, 胶原是在低温下用胃蛋白酶提取的, 该酶仅作用胶原的端肽, 不作用于胶原分子的3股螺旋结构部分, 即胶原未发生变性。由于胶原的3

条分子链形成的3股螺旋结构完整保留, 因此胶原的相对分子质量最大, 一个胶原分子的相对分子质量约为30万。明胶是胶原纤维经高温作用后的产物, 其组成复杂, 相对分子质量分布宽, 由于高温造成胶原蛋白变性, 胶原分子的3股螺旋结构被破坏, 但可能有部分α链的螺旋链还存在, 因此一定浓度的明胶溶液能成凝胶状。水解胶原蛋白是在较高温度下用蛋白酶水解胶原或明胶得到的, 受温度和酶的双重作用, 使水解胶原蛋白的相对分子质量比明胶更小。由于在较高温度条件下, 蛋白酶对胶原肽键的水解是随机的, 使水解得到的蛋白液组成也很复杂, 是相对分子质量从几千到几万的蛋白多肽的混合物。

2. 2　成膜性能对比

实验发现:水解胶原蛋白不能成膜, 而胶原和明胶可以成膜。用扫描电子显微镜观察到的胶原膜和明胶膜的微观结构, 如图2所示。

取新出生的小白鼠皮肤, 用胰蛋白酶处理2h , 剥取表皮层, 粉碎匀浆, 反复用含有微量牛胎盘白蛋白的MCDB153培养液冲洗, 然后用40μm 细胞过滤器过滤, 经离心后收集角质形成细胞。在37℃、5%CO 2培养箱环境中, 将提取的角质形成细胞在KGM -2介质培养液中培养。大约3～4d 后, 细胞繁殖成锥形, 可用于研究其在不同样品膜上的吸附和繁殖情况。

1. 8　细胞吸附和生长

在室温下, 分别在35ml 培养皿上涂上相同浓度的胶原、明胶和水解胶原蛋白, 2h 后在培养皿中加入细胞密度为4×104/cm 2的角质形成细胞, 培养10h 后, 用显微镜观察细胞的生长情况。

2　结果与讨论

2. 1　相对分子质量的对比

从图1所示的电泳分析图谱可以看出:胶原的相对分子质量最大, 胶原的电泳图有3条泳带, 在100kD 附近出现的2条泳带分别是胶原分子的α1链和α2链, 在200kD 附近出现的1条泳带是胶原分子的β链。即胶原的每条多肽链相对分子质量为10万, 3条多肽链构成一个胶原分子, 1个胶原分子相对分子质量为30万; 明胶的电泳分离带为一个连续带, 相对分子质量主要分布在几万到10万; 水解胶原蛋白也是一个连续分离带, 但其相对分子质量比明胶小, 主要分布在几千到3万

。

(a ) 胶原膜

a :标准相对分子质量; b :胶原; c :明胶; d :水解胶原蛋白

图1　胶原、明胶和水解胶原蛋白的电泳分析Fig . 1　SDS -PAGE analysis (7. 5%) of collagen , gelatin

and collagen hydro lysate . SDS -PAGE molecular weight standards , collagen , gelatin , collagen hy -drolysate

(b ) 明胶膜

图2　胶原膜和明胶膜的表面形貌

Fig . 2　Surface morphologies of collagen membrane

and gelatin membrane

导致胶原、明胶和水解胶原蛋白三者之间相对

从图2(a ) 可以看出, 胶原成膜后仍保持网状纤, 2

特征, 电子显微镜观察到的只是一个平滑表面。此外, 实验中发现明胶膜性脆、无韧性, 易破碎; 而胶原膜具有一定的柔韧性、延伸性, 强度较好。实验测得

明胶膜和胶原膜的抗张强度分别为(36±4) N /mm 2, (58±5) N /mm 2, 断裂伸长率分别为(3. 0±0. 5) %和(7. 0±0. 5) %。

由于胶原、明胶和水解胶原蛋白的相对分子质量和结构差异, 造成它们具有不同的成膜能力。胶原相对分子质量最大且保持三股螺旋结构, 因而它的成膜能力最强, 并且膜的机械性能最好。明胶虽还具有成膜能力, 但由于丧失了胶原分子的螺旋构象, 膜的机械性能不如胶原膜。而水解胶原蛋白则完全丧失成膜能力。

2. 3　再纤维性的对比

将胶原、明胶和水解胶原蛋白在模拟生理条件(与动物体内相似的温度和中性盐含量) 下放置25min , 期间不断观察其吸光度的变化, 得到它们的纤维形成曲线, 如图3所示

。

而明胶和水解胶原蛋白的三股螺旋结构都被破坏, 而且这种破坏是不可逆的, 因而丧失了再纤维性。所以, 胶原、明胶和水解胶原蛋白中, 只有胶原才具

有再纤维的生物活性。这也决定了它们在应用上的不同

。

图4　胶原再纤维的扫描电子显微镜图Fig . 4　SEM im age of collagen -reconstructed fibril

2. 4　细胞生物学性能对比

胶原和明胶以及水解胶原蛋白对细胞生长的影响也存在很大的区别[8～9]。采用角质形成细胞分别在胶原、明胶和水解胶原蛋白底物上进行细胞培养时, 培养10h 后用显微镜观察到的细胞生长繁殖情况如图5、图6所示

。

图3　胶原、明胶和水解胶原蛋白的纤维形成性能Fig . 3　Fibril formation properties o f collaren , relation ,

and collagen hydrolysate

从图3可以看出, 在实验条件下胶原溶液吸光度在短时间内即快速增大, 然后到达一个相对稳定

的平台。而明胶和水解胶原蛋白在实验的整个过程中吸光度都基本保持不变。这是由于胶原溶液在生理条件下, 胶原分子之间能再度相互连接形成纤维, 导致吸光度上升。由此说明:只有胶原溶液具有独特的再纤维性质, 而它的变性产物明胶和降解产物水解胶原蛋白则不具有这样的性质。

用扫描电子显微镜观察胶原按照以上条件形成的胶原纤维的结构, 如图4所示。图4表明, 胶原的再纤维呈多孔网状结构。这是因为胶原溶液中的胶原分子仍然保留其三股螺旋结构, 所以在适当的条件下, 溶液中的胶原分子靠氢键或分子间作用力连接, 再度以四分之一交错排列的方式形成纤维束。

(a )

胶原

(b ) 明胶

图5　角质形成细胞在胶原和明胶的培养图片Fig . 5　Photomicrographs of keratinocytes cultrured on col -lagen and gelatin

参考文献:

[1]Chen J X , Cao J , Tan g K Y . Application of collagen and gelatin

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(a )

水解胶原蛋白

[2]Tang C H , Peng Z Y . The development and application of colla -gen [J ]. Meat Research , 2000, (3) :41～43. [唐传核, 彭志英. 胶原的开发和利用[J ]. 肉类研究, 2000, (3) :41～43. ][3]Wu J M , Li R , Wan g Y . Clinical experiments of collagen sponge

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(b ) 培养皿

图6　角质形成细胞在水解胶原蛋白和培养皿上的培养

图片

Fig . 6　Photomicrographs of keratinocytes cultrured on col -lagen hydrolysate and culture dish

[4]Hick man D , Sims T J , Miles C A , et al . Isinglass /collagen :de -naturation and functionality [J ]. Journal of Biotechnology , 2000, 79:245～257.

[5]Bergman I , Loxley R . Two improved and simplified methods for

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[6]Gornall A G , Bardawill C J , David M M . Determination of serum

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[8]Li G Y , Fukunaga S K , Takenouchi F N . Physiological and cell

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[9]Li G Y , Fukunaga S K , Takenouchi F N . Comparative study of

the physiological properties of collagen , gelatin and collagen hy -drolysate as cosmetic materials [J ]. International Journal of Cos -metic Science , 2005, 27:101～106.

(编辑　黄小川)

　　图5, 图6的结果证明, 胶原上培养的细胞的生长繁殖能力明显优于在明胶和水解胶原蛋白上的培养效果, 实际上明胶和水解胶原蛋白对细胞的生长繁殖作用与空白样相差不大。因此可以认为明胶和

胶原水解蛋白丧失了胶原的天然结构, 已不具有生物活性。

3　结　论

胶原属于结构蛋白质, 在体内以胶原纤维的形式存在。在低温下提取得到的胶原, 仍然保持三股螺旋结构, 相对分子质量为30万, 形成的膜具有较好的柔韧性、弹性和强度, 在模拟生理条件下能再形成纤维, 能明显激活细胞的生长。明胶的三股螺旋结构已被破坏, 相对分子质量分布较宽, 从几万到10万; 明胶能成冻、成膜, 但明胶膜性脆、强度比胶原膜差。水解胶原蛋白是多肽混合物, 相对分子质量为几千到几万, 相对分子质量分布很宽; 水解胶原蛋白不能成膜。明胶和水解胶原蛋白均不能再度形成纤维, 而且细胞生长实验证明, 它们不具有促进细胞生长的性质, 即明胶和水解胶原蛋白不具有生物活性。