５０食品与药品Food and Drug２００８年第１０卷第１１期
虾过敏原蛋白纯化中硫酸铵沉淀法的改进
张轶群１，林
洪＊１，李振兴１，吕
朋２
（１． 中国海洋大学食品学院水产品安全性实验室，山东青岛２６６００３；２． 山东出入境检验检疫局，
山东青岛２６６００１）
摘
要：目的
优化虾过敏原蛋白纯化的硫酸铵沉淀工艺，提高纯化效果。方法
测定不同饱和度硫酸铵溶液的体
积和ｐＨ，将过敏原蛋白粉末加入固定饱和度和ｐＨ的硫酸铵溶液中沉淀，并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法检测不同硫酸铵浓度下蛋白质组分的变化。结果一条电泳带的样品。结论中图分类号：Ｒ９８５．２
ＰＨ７．５的３０ ％饱和度硫酸铵溶液可有效地分离虾过敏原蛋白，进一步柱层析得到只有通过改进硫酸铵沉淀工艺，可提高虾过敏原蛋白的纯化效果。文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２－９７９ｘ（２００８）１１－００５０－０３
关键词：虾；过敏原；纯化；硫酸铵沉淀
Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈｒｉｍｐ （Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ） Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧ Ｙｉ－ｑｕｎ１， ＬＩＮ Ｈｏｎｇ＊１， ＬＩ Ｚｈｅｎ－ｘｉｎｇ１， ＬＶ Ｐｅｎｇ２
（１． Ｓｅａｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｌａｂ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｑｉｎｇｄａｏ２６６００３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６００１， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉ－ｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｐｏｗｄｅｒ ｔｏ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ３０ ％ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐＨ ７．５ ｃｏｕｌｄ ｄｅｐｏｓｉｔ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｙ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｎｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｈｒｉｍｐ； ａｌｌｅｒｇｅｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
近年，过敏疾病正成为一种常见、多发病。流行病学研究显示［１］，约３３ ％的过敏反应由食物诱发，１９９９年国际食品法典委员会公布的常见致敏食品清单中，虾类及其制品是主要的过敏食物之一［５］。过敏原性质的研究、生物体内化学变化过程的实验室再现以及多种抗体的制备，要求纯度较高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分对研究加工方式对过敏原活性的影响，开发能降低海产品过敏原的食品加工技术具有重要的意义。纯化过敏原还可在临床上明确过敏原
收稿日期：２００８－０５－１２
资助项目：国家“十一五”科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０２Ａ２７）
作者简介：张轶群（１９８３－ ），女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向为海产品过敏原＊通讯作者：林洪，男，教授，博士生导师，研究方向为水产品质量与安全
Ｔｅｌ： ０５３１－８２０３２２０３， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｎｈｏｎｇ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
类型，提高过敏症诊断的灵敏度。
研究表明，虾过敏原是一种相对分子质量约３６×１０３
化方法主要是用６０ ％饱和度硫酸铵沉淀，再经过凝胶柱层析、离子交换层析等一系列纯化步骤，方法繁琐。本课题组在研究中改进了传统的方法，获得了较好的结果，提高了纯化率。现以南美白对虾为例，介绍改进后的虾过敏原纯化法，为进一步研究虾过敏原的性质提供物质基础。１
材料与仪器
有时甚至造成过敏性休克，严重时可危及生命［２－４］。的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白［６］。传统的纯
食品与药品
Food and Drug２００８年第１０卷第１１期５１
１．１
材料
南美白对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ，购自青岛南山水产品市场，鲜活品）；优级纯硫酸铵（天津科密欧化学试剂开发中心）；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，生化试剂，青岛福林生物化学公司）；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ，生化试剂，山东爱博科技贸易公司）。其余试剂为分析纯。１．２
仪器
ＤＹＹ－７Ｃ 型电泳仪（北京六一仪器厂）；Ｔａｎｏｎ－３５００Ｒ 型凝胶成像及分析系统（上海天能科技公司）；ＦＤ１ 型冷冻干燥机（丹麦Ｈｅｔｏ公司）；ＰＨＳ－３Ｃ 型ｐＨ计（上海伟业仪器厂）；ＢＲ４ｉ 型冷冻离心机（法国Ｊｏｕａｎ公司）；ＴＵ－１８１０ 型紫外可见分光光度计（北京普析通用公司）。２
方法
２．１
虾过敏原提取物的制备
参照文献［７］的方法制作含虾肉的丙酮粉。取５ ｇ丙酮粉，加入１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ４０ ｍＬ，４ ℃条件下提取２４ ｈ，９ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。取上清，将沉淀物在１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ溶液２０ ｍＬ中重新溶解，４ ℃条件下提取４ ｈ，然后１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。取上清，混合２次上清液，沸水浴加热。５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心后，弃上清，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ７．４的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）透析７２ ｈ，每１２ ｈ换１次透析液。然后冷冻干燥提取物，置－２０ ℃冰箱备用。２．２
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ变化以原始体积为５０ ｍＬ，１０ ％为单位分别配制不同饱和度（２０ ％～９０ ％）的硫酸铵溶液，测定配制前后溶液的体积及ｐＨ变化。２．３
虾过敏原的硫酸铵沉淀
以１０ ％为单位，分别配制不同饱和度（３０ ％～６０ ％）的硫酸铵溶液，调ｐＨ至７．５，然后分别取２０ ｍＬ，将冻干后的虾过敏原提取物分别加入不同浓度的硫酸铵溶液中至浓度为５ ｍｇ／ｍＬ，０ ℃条件下搅拌３０ ｍｉｎ，充分沉淀后，４ ℃条件下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ。将上清和沉淀分别转移至透析袋中，于双蒸水中透析２４ ｈ，－２０ ℃冷冻备用。２．４
虾过敏原的柱层析纯化
硫酸铵沉淀经透析后的溶液在Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＶＧ－１００凝胶柱上进一步分离。缓冲液为０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），流速０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，收集主峰。２．５
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶扫描分析
用Ｌａｅｍｍｌｉ建立的不连续电泳体系［８］，其中分离胶浓度为１２ ％（Ｗ／Ｖ），堆积胶浓度为５ ％（Ｗ／Ｖ）。蛋白质样品稀释为１ ｍｇ／ｍＬ并经样品缓冲液处理，加样量１５ μＬ。电泳完毕，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，用ＧＩＳ凝胶成像系统拍照、分析。２．６ 蛋白质含量测定
用Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白质含量［９］ 。３结果与讨论
３．１
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ变化分析 硫酸铵沉淀广泛用于蛋白质纯化，是一种有效的分离方法。传统方法是在一定浓度的蛋白质溶液中加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，使溶液ｐＨ值降低到某些弱酸性蛋白质的等电点而沉淀，导致沉淀中杂蛋白增多。本研究比较了不同饱和度条件下溶液体积和ｐＨ的变化，为建立准确的硫酸铵沉淀条件提供基础数据。
表１
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ值
由表１可见，在５０ ｍＬ双蒸水中加入硫酸铵后，溶液体积随饱和度增高逐渐增大，由５０ ｍＬ增至６９．１２ｍＬ，ｐＨ则显著降低，由６．０４降至５．１１。随着饱和度增加，ｐＨ降低速度减缓。文献中虽可查到不同硫酸铵饱和度下所需硫酸铵的量，但在实际操作中，体积的变化很难控制。ｐＨ变化则会导致部分弱酸性蛋白沉淀，给分离蛋白质带来困难。通过研究不同饱和度硫酸铵的体积和ｐＨ值变化，用预先配制的不同饱和度、相同ｐＨ值的硫酸铵溶液，可有效的避免由于体积和ｐＨ值变化所致的误差。
由于虾过敏原蛋白的等电点约４．８，硫酸铵溶液的ｐＨ在５．１附近，很容易导致虾过敏原蛋白由于电荷的原因而沉淀。固定硫酸铵溶液的ｐＨ值在７．５，
消除了ｐＨ值变化因素的影响，取得了较好的效果。与大量硫酸铵相比，加入少量过敏原蛋白对溶液体积没有明显的影响，可忽略不计。此外，本研究在获取沉淀时，用相应饱和度的硫酸铵溶液洗涤沉淀，有效的去除了沉淀表面残留的上清液，对沉淀中的蛋白质有很好的净化效果。３．２
不同硫酸铵饱和度样品ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用电泳法可测定不同硫酸铵饱和度条件下蛋白质沉淀的变化。
图１为不同硫酸铵饱和度下虾过敏原提取物
５２食品与药品Food and Drug２００８年第１０卷第１１期
的电泳图，并用ＧＩＳ系统对蛋白质条带进行灰度扫描。饱和度沉淀的虾过敏原蛋白，有２条以上的条带，不
能取得满意的效果。分析其原因是，虾过敏原由２个亚基组成，每个亚基的相对分子质量均约３６×１０３，未变性前其相对分子质量约为７２×１０３。我们认为在２０×１０３出现的条带是肌钙蛋白的一条，过敏原纯化时这个蛋白质是最难消除的，其性质和过敏原有很多相似之处，相对分子质量约８０×１０３，由３个亚基组成，其中１条亚基的相对分子质量约２０×
１：ｍａｒｋｅｒ；２～５：依次为饱和度３０ ％，４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵沉淀后的上清液；６～９：依次为饱和度３０ ％，４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵沉淀后的沉淀
图１饱和度３０ ％～６０ ％硫酸铵沉淀的上清液和沉淀
液的电泳图
结果表明，在３０ ％上清液中，虾过敏原含量占
总蛋白质量的５３ ％；而在４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵浓度的上清液中占２９ ％，２３ ％，２５ ％。对硫酸铵沉淀后沉淀物的电泳可见，３０ ％的沉淀中，虾过
敏原蛋白占总蛋白质量的９０ ％，而在４０ ％，５０ ％，６０ ％的沉淀中分别为８１ ％，７６ ％，６７ ％。由图１可见，在４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵饱和度的沉淀中，杂蛋白含量明显增加，降低了目的蛋白质的纯度。综合不同饱和度硫酸铵的条件下上清液和沉淀中过敏原含量的变化，表明３０ ％硫酸铵沉淀中的过敏原蛋白纯度最高。考虑到后续的纯化，本研究在纯化虾过敏原蛋白时选用３０ ％硫酸铵饱和度进行沉淀。３．３
过敏原蛋白的柱层析纯化及分析
为进一步验证本研究的结果，将３０ ％和５０ ％硫酸铵沉淀的虾过敏原蛋白经过Ｓｅｐｈｄｅｘ ＶＧ－１００凝胶柱层析，收集蛋白质组分进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，见图２。
１． ｍａｒｋｅｒ；２． 原提取液；３． ３０ ％饱和度沉淀经凝胶层析纯化后的样品；４． ５０ ％饱和度沉淀经凝胶层析纯化后的样品
图２ 不同饱和度沉淀的虾过敏原蛋白经凝胶层析后
的组分分析电泳图
结果表明，３０ ％饱和度沉淀的虾过敏原蛋白经凝胶柱层析纯化后，显示该样品只有１条带；５０ ％
１０３。变性电泳时，亚基分开，导致在约２０×１０３处出现此条带。这可能是无法分离好的原因。４
结论
硫酸铵溶液的体积随着饱和度的增加而改变，９０ ％饱和度时比原始体积增加１９．１２ ｍＬ，ｐＨ从６．０４变为５．１１。通过配制３０ ％硫酸铵饱和溶液，调ｐＨ为７．５，将过敏原加入硫酸铵溶液，使得虾过敏原蛋白能有效的分离，通过进一步柱层析能得到电泳条件下只有１条带的样品，为大量纯化高纯度的虾过敏
原提供了技术支持。由于在硫酸铵沉淀过程中一些参数变化可能对实验结果有较大的影响，操作时须严格控制沉淀条件，以保证实验结果良好。
参考文献
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ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， １９７０，２２７ （５２５９）： ６８０－６８５．
［９］Ｌｏｗｒｙ Ｏ Ｈ， Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ Ｊ， Ｆａｒｒ Ａ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ
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１９５１， １９３ （１）： ２６７－２７５．
５０食品与药品Food and Drug２００８年第１０卷第１１期
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张轶群１，林
洪＊１，李振兴１，吕
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（１． 中国海洋大学食品学院水产品安全性实验室，山东青岛２６６００３；２． 山东出入境检验检疫局，
山东青岛２６６００１）
摘
要：目的
优化虾过敏原蛋白纯化的硫酸铵沉淀工艺，提高纯化效果。方法
测定不同饱和度硫酸铵溶液的体
积和ｐＨ，将过敏原蛋白粉末加入固定饱和度和ｐＨ的硫酸铵溶液中沉淀，并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法检测不同硫酸铵浓度下蛋白质组分的变化。结果一条电泳带的样品。结论中图分类号：Ｒ９８５．２
ＰＨ７．５的３０ ％饱和度硫酸铵溶液可有效地分离虾过敏原蛋白，进一步柱层析得到只有通过改进硫酸铵沉淀工艺，可提高虾过敏原蛋白的纯化效果。文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２－９７９ｘ（２００８）１１－００５０－０３
关键词：虾；过敏原；纯化；硫酸铵沉淀
Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈｒｉｍｐ （Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ） Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧ Ｙｉ－ｑｕｎ１， ＬＩＮ Ｈｏｎｇ＊１， ＬＩ Ｚｈｅｎ－ｘｉｎｇ１， ＬＶ Ｐｅｎｇ２
（１． Ｓｅａｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｌａｂ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｑｉｎｇｄａｏ２６６００３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６００１， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉ－ｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｐｏｗｄｅｒ ｔｏ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ３０ ％ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐＨ ７．５ ｃｏｕｌｄ ｄｅｐｏｓｉｔ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｙ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｎｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｈｒｉｍｐ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｈｒｉｍｐ； ａｌｌｅｒｇｅｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
近年，过敏疾病正成为一种常见、多发病。流行病学研究显示［１］，约３３ ％的过敏反应由食物诱发，１９９９年国际食品法典委员会公布的常见致敏食品清单中，虾类及其制品是主要的过敏食物之一［５］。过敏原性质的研究、生物体内化学变化过程的实验室再现以及多种抗体的制备，要求纯度较高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分对研究加工方式对过敏原活性的影响，开发能降低海产品过敏原的食品加工技术具有重要的意义。纯化过敏原还可在临床上明确过敏原
收稿日期：２００８－０５－１２
资助项目：国家“十一五”科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０２Ａ２７）
作者简介：张轶群（１９８３－ ），女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向为海产品过敏原＊通讯作者：林洪，男，教授，博士生导师，研究方向为水产品质量与安全
Ｔｅｌ： ０５３１－８２０３２２０３， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｎｈｏｎｇ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
类型，提高过敏症诊断的灵敏度。
研究表明，虾过敏原是一种相对分子质量约３６×１０３
化方法主要是用６０ ％饱和度硫酸铵沉淀，再经过凝胶柱层析、离子交换层析等一系列纯化步骤，方法繁琐。本课题组在研究中改进了传统的方法，获得了较好的结果，提高了纯化率。现以南美白对虾为例，介绍改进后的虾过敏原纯化法，为进一步研究虾过敏原的性质提供物质基础。１
材料与仪器
有时甚至造成过敏性休克，严重时可危及生命［２－４］。的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白［６］。传统的纯
食品与药品
Food and Drug２００８年第１０卷第１１期５１
１．１
材料
南美白对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ，购自青岛南山水产品市场，鲜活品）；优级纯硫酸铵（天津科密欧化学试剂开发中心）；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，生化试剂，青岛福林生物化学公司）；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ，生化试剂，山东爱博科技贸易公司）。其余试剂为分析纯。１．２
仪器
ＤＹＹ－７Ｃ 型电泳仪（北京六一仪器厂）；Ｔａｎｏｎ－３５００Ｒ 型凝胶成像及分析系统（上海天能科技公司）；ＦＤ１ 型冷冻干燥机（丹麦Ｈｅｔｏ公司）；ＰＨＳ－３Ｃ 型ｐＨ计（上海伟业仪器厂）；ＢＲ４ｉ 型冷冻离心机（法国Ｊｏｕａｎ公司）；ＴＵ－１８１０ 型紫外可见分光光度计（北京普析通用公司）。２
方法
２．１
虾过敏原提取物的制备
参照文献［７］的方法制作含虾肉的丙酮粉。取５ ｇ丙酮粉，加入１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ４０ ｍＬ，４ ℃条件下提取２４ ｈ，９ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。取上清，将沉淀物在１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ溶液２０ ｍＬ中重新溶解，４ ℃条件下提取４ ｈ，然后１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。取上清，混合２次上清液，沸水浴加热。５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心后，弃上清，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ７．４的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）透析７２ ｈ，每１２ ｈ换１次透析液。然后冷冻干燥提取物，置－２０ ℃冰箱备用。２．２
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ变化以原始体积为５０ ｍＬ，１０ ％为单位分别配制不同饱和度（２０ ％～９０ ％）的硫酸铵溶液，测定配制前后溶液的体积及ｐＨ变化。２．３
虾过敏原的硫酸铵沉淀
以１０ ％为单位，分别配制不同饱和度（３０ ％～６０ ％）的硫酸铵溶液，调ｐＨ至７．５，然后分别取２０ ｍＬ，将冻干后的虾过敏原提取物分别加入不同浓度的硫酸铵溶液中至浓度为５ ｍｇ／ｍＬ，０ ℃条件下搅拌３０ ｍｉｎ，充分沉淀后，４ ℃条件下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ。将上清和沉淀分别转移至透析袋中，于双蒸水中透析２４ ｈ，－２０ ℃冷冻备用。２．４
虾过敏原的柱层析纯化
硫酸铵沉淀经透析后的溶液在Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＶＧ－１００凝胶柱上进一步分离。缓冲液为０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），流速０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，收集主峰。２．５
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶扫描分析
用Ｌａｅｍｍｌｉ建立的不连续电泳体系［８］，其中分离胶浓度为１２ ％（Ｗ／Ｖ），堆积胶浓度为５ ％（Ｗ／Ｖ）。蛋白质样品稀释为１ ｍｇ／ｍＬ并经样品缓冲液处理，加样量１５ μＬ。电泳完毕，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，用ＧＩＳ凝胶成像系统拍照、分析。２．６ 蛋白质含量测定
用Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白质含量［９］ 。３结果与讨论
３．１
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ变化分析 硫酸铵沉淀广泛用于蛋白质纯化，是一种有效的分离方法。传统方法是在一定浓度的蛋白质溶液中加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，使溶液ｐＨ值降低到某些弱酸性蛋白质的等电点而沉淀，导致沉淀中杂蛋白增多。本研究比较了不同饱和度条件下溶液体积和ｐＨ的变化，为建立准确的硫酸铵沉淀条件提供基础数据。
表１
不同饱和度硫酸铵溶液的体积及ｐＨ值
由表１可见，在５０ ｍＬ双蒸水中加入硫酸铵后，溶液体积随饱和度增高逐渐增大，由５０ ｍＬ增至６９．１２ｍＬ，ｐＨ则显著降低，由６．０４降至５．１１。随着饱和度增加，ｐＨ降低速度减缓。文献中虽可查到不同硫酸铵饱和度下所需硫酸铵的量，但在实际操作中，体积的变化很难控制。ｐＨ变化则会导致部分弱酸性蛋白沉淀，给分离蛋白质带来困难。通过研究不同饱和度硫酸铵的体积和ｐＨ值变化，用预先配制的不同饱和度、相同ｐＨ值的硫酸铵溶液，可有效的避免由于体积和ｐＨ值变化所致的误差。
由于虾过敏原蛋白的等电点约４．８，硫酸铵溶液的ｐＨ在５．１附近，很容易导致虾过敏原蛋白由于电荷的原因而沉淀。固定硫酸铵溶液的ｐＨ值在７．５，
消除了ｐＨ值变化因素的影响，取得了较好的效果。与大量硫酸铵相比，加入少量过敏原蛋白对溶液体积没有明显的影响，可忽略不计。此外，本研究在获取沉淀时，用相应饱和度的硫酸铵溶液洗涤沉淀，有效的去除了沉淀表面残留的上清液，对沉淀中的蛋白质有很好的净化效果。３．２
不同硫酸铵饱和度样品ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用电泳法可测定不同硫酸铵饱和度条件下蛋白质沉淀的变化。
图１为不同硫酸铵饱和度下虾过敏原提取物
５２食品与药品Food and Drug２００８年第１０卷第１１期
的电泳图，并用ＧＩＳ系统对蛋白质条带进行灰度扫描。饱和度沉淀的虾过敏原蛋白，有２条以上的条带，不
能取得满意的效果。分析其原因是，虾过敏原由２个亚基组成，每个亚基的相对分子质量均约３６×１０３，未变性前其相对分子质量约为７２×１０３。我们认为在２０×１０３出现的条带是肌钙蛋白的一条，过敏原纯化时这个蛋白质是最难消除的，其性质和过敏原有很多相似之处，相对分子质量约８０×１０３，由３个亚基组成，其中１条亚基的相对分子质量约２０×
１：ｍａｒｋｅｒ；２～５：依次为饱和度３０ ％，４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵沉淀后的上清液；６～９：依次为饱和度３０ ％，４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵沉淀后的沉淀
图１饱和度３０ ％～６０ ％硫酸铵沉淀的上清液和沉淀
液的电泳图
结果表明，在３０ ％上清液中，虾过敏原含量占
总蛋白质量的５３ ％；而在４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵浓度的上清液中占２９ ％，２３ ％，２５ ％。对硫酸铵沉淀后沉淀物的电泳可见，３０ ％的沉淀中，虾过
敏原蛋白占总蛋白质量的９０ ％，而在４０ ％，５０ ％，６０ ％的沉淀中分别为８１ ％，７６ ％，６７ ％。由图１可见，在４０ ％，５０ ％，６０ ％硫酸铵饱和度的沉淀中，杂蛋白含量明显增加，降低了目的蛋白质的纯度。综合不同饱和度硫酸铵的条件下上清液和沉淀中过敏原含量的变化，表明３０ ％硫酸铵沉淀中的过敏原蛋白纯度最高。考虑到后续的纯化，本研究在纯化虾过敏原蛋白时选用３０ ％硫酸铵饱和度进行沉淀。３．３
过敏原蛋白的柱层析纯化及分析
为进一步验证本研究的结果，将３０ ％和５０ ％硫酸铵沉淀的虾过敏原蛋白经过Ｓｅｐｈｄｅｘ ＶＧ－１００凝胶柱层析，收集蛋白质组分进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，见图２。
１． ｍａｒｋｅｒ；２． 原提取液；３． ３０ ％饱和度沉淀经凝胶层析纯化后的样品；４． ５０ ％饱和度沉淀经凝胶层析纯化后的样品
图２ 不同饱和度沉淀的虾过敏原蛋白经凝胶层析后
的组分分析电泳图
结果表明，３０ ％饱和度沉淀的虾过敏原蛋白经凝胶柱层析纯化后，显示该样品只有１条带；５０ ％
１０３。变性电泳时，亚基分开，导致在约２０×１０３处出现此条带。这可能是无法分离好的原因。４
结论
硫酸铵溶液的体积随着饱和度的增加而改变，９０ ％饱和度时比原始体积增加１９．１２ ｍＬ，ｐＨ从６．０４变为５．１１。通过配制３０ ％硫酸铵饱和溶液，调ｐＨ为７．５，将过敏原加入硫酸铵溶液，使得虾过敏原蛋白能有效的分离，通过进一步柱层析能得到电泳条件下只有１条带的样品，为大量纯化高纯度的虾过敏
原提供了技术支持。由于在硫酸铵沉淀过程中一些参数变化可能对实验结果有较大的影响，操作时须严格控制沉淀条件，以保证实验结果良好。
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