蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法
(实验报告)
实验日期:年月日 实验温度:室温 实验地点:生物化学与遗传学实验室 指导老师:*** 班级:2013级生物技术1班 姓名:** 学号:********
I. 实验目的
1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法; 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II. 实验原理
考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的,这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大吸收波长465nm,与蛋白质结合后变为蓝色,最大吸收波长595nm,在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合,反应2min即可到达平衡,复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂
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(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液 。
(2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中,加85%的磷酸50mL,蒸馏水定容至500mL。
(3)正常人血浆。 2.实验器材
可见分光光度计,100μL 微量移液器16支,5mL刻度吸管8支,中试管。 IV. 实验操作步骤
1.绘制标准曲线 取中试管8支,按下表加入各种试剂 混匀,室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白,记录于下表,绘制标准曲线。
标准曲线绘制数据表
- 2 -
2.样品测定 中试管2支分别加未知浓度蛋白质(或人正常血浆)0.4mL,各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀,室温放置5min,以“0”号管为空白比色,以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。 V. 实验结果分析
结果分析:实验未能达到预期的一条直线,原因可能为:①血浆样本放置时间太久,蛋白质变性;②实验比色杯由于使用后未及时擦洗,导致比色误差(原因小);③人为操作不当,导致误差。 VI. 注意事项
1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5~20min内比色,布的超过1h;
2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯,不影响测定,
- 3 -
可用乙醇洗净。
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蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法
(实验报告)
实验日期:年月日 实验温度:室温 实验地点:生物化学与遗传学实验室 指导老师:*** 班级:2013级生物技术1班 姓名:** 学号:********
I. 实验目的
1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法; 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II. 实验原理
考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的,这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大吸收波长465nm,与蛋白质结合后变为蓝色,最大吸收波长595nm,在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合,反应2min即可到达平衡,复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂
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(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液 。
(2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中,加85%的磷酸50mL,蒸馏水定容至500mL。
(3)正常人血浆。 2.实验器材
可见分光光度计,100μL 微量移液器16支,5mL刻度吸管8支,中试管。 IV. 实验操作步骤
1.绘制标准曲线 取中试管8支,按下表加入各种试剂 混匀,室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白,记录于下表,绘制标准曲线。
标准曲线绘制数据表
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2.样品测定 中试管2支分别加未知浓度蛋白质(或人正常血浆)0.4mL,各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀,室温放置5min,以“0”号管为空白比色,以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。 V. 实验结果分析
结果分析:实验未能达到预期的一条直线,原因可能为:①血浆样本放置时间太久,蛋白质变性;②实验比色杯由于使用后未及时擦洗,导致比色误差(原因小);③人为操作不当,导致误差。 VI. 注意事项
1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5~20min内比色,布的超过1h;
2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯,不影响测定,
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可用乙醇洗净。
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