模式生物与microRNA研究

中国科学 C 辑:生命科学 2009年 第39卷 第1期: 129 ~ 136 www.scichina.com life.scichina.com

《中国科学》杂志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

模式生物与microRNA 研究

邹俊, 荆清*

中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所, 上海 200025 * 联系人, E-mail: qjing325303@yahoo.cn 收稿日期: 2008-09-26; 接受日期: 2008-12-29

国家重点基础研究发展计划(批准号: 2005CB724602和2007CB947002) 、国家自然科学基金(批准号: 30670437和30770457) 、浦江人才计划(批准号: 05PJ14105)和中国科学院重要方向性项目(批准号: KSCX2-YW-R-096和KSCX1-YW-R-64) 资助

摘要 microRNA(miRNA)是一类内源性、长度在19~25个碱基的小分子非编码RNA, 其在基因的转录后调控中发挥重要功能. miRNA的研究在最近得到了快速发展, 模式生物在这一过程中起到了重要作用. 本文介绍了不同模式生物在miRNA 的发现、作用机制和生物学功能研究中的作用.

关键词

miRNA

模式生物 非编码RNA

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度在19~ 25个碱基的小分子非编码RNA, 在基因的转录后调控发挥重要功能. 从1993年发现第1个miRNA 以来, 到目前为止在miRNA 研究领域已发表的论文近5000篇, 包括很多发表在国际权威杂志上和入选当年十大研究进展的研究论文. 纵观miRNA 研究的历史和现状, 不同模式生物在miRNA 研究的各个方面起到了重要作用. 一方面, miRNA 的广泛存在决定了在各种模式生物中对其进行研究的必要性; 另一方面, miRNA 的形成机制以及相当一部分miRNA 是高度保守的, 比较不同模式生物中的研究结果有助于更好地理解这一类重要分子的生物学功能. 本文就模式生物在miRNA 研究中的几个方面: miRNA的发现、产生和作用机制、生物学功能中的重要作用进行了介绍.

1993 年, Lee等人通过定位克隆的方法发现发育时序调控基因lin-4不编码蛋白, 而是编码一个小RNA, 提出lin-4可能通过结合到lin-14的3′非翻译区(3′UTR) 下调LIN-14的蛋白表达, 并且lin-4成熟序列附近可以形成一个茎环结构. 时隔7年之后, Reinhart等人[2]又在线虫中发现了第2个有发育时序调控作用的小RNA ——let-7. 这两个miRNA 的发现为整个miRNA 领域的发展打开了突破口. 随后, Pasquinelli等人用Northern blot 以及S1 核酸酶作图(S1 nuclease mapping) 等实验手段证明let-7在各物种中高度保守, 进一步为即将到来的miRNA 快速发展时期作好铺垫. 不久, 德国和美国的3个实验室在同一期Science [4~6]上第一次发表了用克隆的方法在线虫、果蝇(Droso- phila melanogaster) 以及哺乳动物细胞里发现了miRNA. miRNA在线虫中的发现与线虫这一模式生物便于进行突变筛选、互补实验以及线虫清晰的发育过程是密不可分的.

结合miRNA 的序列保守性以及侧翼序列二级结构的特点, Lim等人开发出第一个预测miRNA 的软件MirScan, 在线虫中预测了35个新的miRNA, 在人类中预测了107个miRNA, 并实验确认了其中相当一

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1 模式生物与miRNA 的发现

在miRNA 的发现过程中, 各种模式生物由于其自身的特点而起不同的作用.

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)易于进行遗传学操作, 在早期miRNA 的发现中起着关键作用.

邹俊等: 模式生物与microRNA 研究

部分. 随后, Grad等人[8]也基于miRNA 保守性开发了snarloop 软件, 在线虫里预测了214个miRNA. 果蝇是第一批克隆到miRNA 的物种之一, 并且由于它的基因组相对简单, 用生物信息学方法预测miRNA 的工作在果蝇中也开展得比较早. 基于miRNA 的保守性和miRNA 特有的序列模式, Lai等人[9]开发了miRSeeker 软件, 在果蝇里预测了48个miRNA. 近期, Stark 等人利用12种果蝇的基因组预测了41个新的miRNA 并验证了其中28个. 2002年, Lagos- Quintana 等人通过克隆小鼠(Mus musculus) 各组织的小RNA, 发现了34个新的miRNA, 从空间表达谱上弥补了前期小RNA 克隆的疏漏. 斑马鱼 (Danio rerio ) 是一种新型的脊椎模式生物, 具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明等特点. 在这种模式生物中第一次运用锁核苷酸(locked nucleic acid, LNA)技术完成了115个miRNA 的时空表达谱[12]. 在早期的克隆研究中, 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 是植物中最早进行miRNA 克隆鉴定的物种. 2005年, Dee等人首先在拟南芥中采用大规模测序方法MPSS 鉴定拟南芥miRNA. MPSS和SAGE, RAKE, 454, solexa等大规模测序技术的应用将miRNA 的发现推向了高潮. 在2007年, Molnar等人[16]和Zhao 等人[17]分别在单细胞绿萍莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 中发现了miRNA 和miRNA 相关的蛋白, 更新了人们对miRNA 的认识. 而对不同病毒编码miRNA 的研究进一

步拓宽了我们的研究领域.

在发现miRNA 的历史中, 不得不提及Landgraf 等人[22]的工作. 在2007年, 欧洲20多个实验室通过传统小RNA 克隆方法, 用人、大鼠(Rattus norvegicus) 、小鼠的各个组织器官、细胞系以及人的病理样本构建了250个克隆文库. 这一系统性工作绘制了哺乳动物的miRNA 表达谱, 为此后的miRNA 功能研究提供了很大便利.

通过对比分析不同模式生物miRNA 的信息, 对miRNA 的特点作出了一些归纳: 很多miRNA 的成熟序列在物种间是保守的; 一部分miRNA 成熟序列得到修饰, 包括由A 到I 的编辑造成的A 到G 碱基变化, 及在3′末端加A 或者U; 成熟miRNA 在基因组上的侧翼序列可以折叠成热力学稳定的发卡结构, 侧翼序列存在某些影响miRNA 成熟的基元(motif);

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相当一部分miRNA 位于基因的内含子区域. 另外, 不同模式生物中的miRNA 的信息为进化生物学和比较基因组学的研究提供了很好的材料.

2 模式生物与miRNA 机制的研究

在miRNA 机制研究中, 多数研究在线虫、果蝇和哺乳动物细胞等模型中进行. 在一些有关miRNA 运输机制的研究中, 非洲爪蟾(Xenopus laevis) 起着重要作用. 在关键机制的发现中, 各模式生物研究结果之间往往相互印证.

早在2001年, Bernstein等人在果蝇里发现了siRNA 产生过程中的关键蛋白DICER, 在线虫里发现了miRNA 系统的一些成分和siRNA 系统共享. Grishok等人[24]通过干扰和敲除实验发现, siRNA系统的关键蛋白DICER 同时也是miRNA 产生和发挥功能所必需的. Dicer 敲除的线虫不能正常发育, 而且与miRNA 产生相关的其他几个蛋白与线虫的时序发育密切关联[25~27].

值得一提的是DGCR8的发现. 2003年, Lee等 人在哺乳动物细胞发现DROSHA 介导pri-miRNA 的剪切. Denli等人和Landthaler 等人分别根据果蝇蛋白的酵母双杂交数据推测, DROSHA可能与DGCR8同源蛋白相互作用, 并实验确认了DGCR8是pri-miRNA 加工复合体的一部分. 特别应该提到的是Gregory 等人用体外重构的DROSHA 和DGCR8成功实现pri-miRNA 的加工. 最近在哺乳动物细胞中的研究发现, DROSHA对pri-miRNA 的加工与mRNA 转录连接在一起, 先于内含子剪切进行.

对miRNA 从核内运输到核外的研究又一次体现了多种模式生物研究交叉整合的优势. Yi等人和Bohnsack 等人[35]分别在哺乳动物细胞中发现, 用siRNA 干扰exportin-5能抑制miRNA 出核. 几乎同时, Lund 等人[36]在爪蟾卵细胞中发现敲除Ran-GTP 能够抑制pre-miRNA 出核, 并进一步证明EXPORTIN-5是关键的运输蛋白, 而且在哺乳动物细胞中也重复出这一结果. 这3个实验室几乎同时发现了这一重要过程, 其中两个(Bohnsack和Lund 实验室) 都采用了爪蟾卵这一经典的细胞核-细胞质运输模型.

Chendrimada 等人在哺乳动物细胞中发现, TRBP 与DICER 相互作用, 并与AGO2构成一个稳定

的复合体执行miRNA 的剪切成熟. Forstemann等人[38]在果蝇中寻找与DCR1相互作用并含有双链RNA 结合结构域(dsRBD)的蛋白时, 发现TRBP 的同源蛋白LOQS 可能是其中之一. 随后他们证明了敲除loqs 确实能够抑制miRNA 的成熟, 导致pre-miRNA 的堆积, 而且LOQS 和DCR1相互作用, 存在于同一复合体中. Saito 等人[39]也独立发现了这一蛋白. Jiang等人[40]运用类似的策略发现了miRNA 成熟过程中另一蛋白R3D1-L.

在miRNA 机制的研究历史中, 线虫被最早用来研究其产生机理, 随后在果蝇和哺乳动物细胞里进一步找到了pri-miRNA 加工复合物的重要成分. 在miRNA 作用机制的研究中, 这些模式生物又发挥了不同的作用.

动物的miRNA 的作用机理早在第一个miRNA lin-4发现时就有所推测. Lee等人发现lin-14的3′UTR 中有几个lin-4的互补位点, 突变lin-4的互补区碱基能导致lin-4缺失的表型. 并且lin-14的 3′UTR 缺失导致lin-14蛋白水平升高, 但mRNA 水平并没有明显变化. 基于这些现象, 他们提出了miRNA 作用机制的一个初步想法, 即lin-4通过与lin-14的3′UTR 结合抑制lin-14蛋白的翻译. 后期研究发现, miRNA在pre-miRNA 被DICER 剪切成miRNA: miRNA*二聚体之后, TRBP募集AGO2[41,42]与DICER 组成复合物, 促使RISC 的组装. 之后在miRNA 介导下, RISC复合体结合到与miRNA 序列完全匹配或不完全匹配的mRNA 上, 导致mRNA 的降解或翻译抑制.

植物中miRNA 的产生和作用机制与动物有所不同[51]. 植物miRNA 从pri-miRNA 至pre- miRNA以及pre-miRNA 到成熟miRNA 的剪切过程都是在核内由DICER 的同源蛋白DCL1执行, 并且需要HYL1和SE 等蛋白. 在成熟miRNA 的3′末端碱基的2位羟基上由HEN1加上甲基, 而miRNA 从核内由EXPOTIN- 5的同源蛋白HASTY 运输到核外. 植物里miRNA 主要通过完全匹配导致靶基因的mRNA 降解[52,53]. 但也有报道

, 在植物里个别miRNA 通过抑制翻译执行其功能.

3 模式生物与miRNA 的生物学功能研究

miRNA 的功能研究一直以来是本领域的核心部分, 近几年的研究已经揭示了部分miRNA 的功能.

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miRNA 参与胚胎发育、器官形成以及肿瘤发生等方面. 在各模式生物中, 线虫和果蝇因其易于进行突变筛选等遗传操作, 在早期几个miRNA 的功能研究中起着关键作用. 斑马鱼对于胚胎发育及器官形成等过程中miRNA 的功能研究, 发挥着重要作用. 后期由于基因敲除及转基因技术的成功应用, 小鼠在特定组织系统内miRNA 的功能研究以及单个miRNA 的功能研究中发挥了很大作用.

由于线虫各个细胞的命运比较清楚, miRNA在线虫发育过程中作用的研究进行得最早. Ketting等 人[26]发现, dicer 同源基因(dcr-1) 突变的线虫生殖系统发育异常, 而且在成年之前外阴爆裂(burst vulva). 如果同时抑制母系和子代的DICER 则可导致胚胎死 亡[24]. 提示dicer 和miRNA 对胚胎的发育是必需的. 通过正向遗传学方法, 人们在线虫中发现了一些miRNA 的功能, 其中lin-4和let-7家族是著名的发育调控miRNA, lys-4[55]和miR-273[56]则调控神经元不对称发育. 最近, 在线虫里进行系统性的miRNA 基因座突变[57,58], 又发现了几个miRNA 分别在发育和凋亡中起作用.

基因敲除和转基因技术, 广泛应用于果蝇个体和器官发育中的miRNA 功能研究. 在果蝇里敲除Loqs 这一miRNA 产生的重要分子, 将导致雌性不育, dcr-1敲除后果蝇的生殖干细胞分裂异常[59], ago1和dcr-1同时敲除后, 果蝇体节形成出现异常. 对果蝇特异miRNA 的功能研究开始于bantam 和miR-14. Brennecke等人[60]发现用Gal4 系统诱导bantam 过表达能导致细胞数目增多, 引起组织过度增生. 序列保守性分析及实验表明, bantam编码一个21个碱基的miRNA. 这个miRNA 可以通过负调控HID 蛋白的表达抑制细胞凋亡. Xu等人[61]发现敲除miR-14能增强REAPER 依赖的细胞凋亡, 异位表达miR-14抑制凋亡.

在此之后, 又发现一些miRNA 的功能. 果蝇中的miR-1受twist 和mef2调控, miR-1的敲除导致果蝇在二龄幼虫期死亡, 肌肉畸形, 体型变小. 另一个miRNA Mir-iab-4-5p 直接调节UBX 蛋白的表达, 过表达Mir-iab-4-5p 导致平衡杆向翅的转化[63]. 生长因子Spitz 通过EGFR 激活Ras-ERK 信号通路, 引起果蝇视网膜前体细胞向光受体细胞的分化. 这一过程中, 关键蛋白YAN 被ERK 磷酸化后降解, 一些被YAN 转录

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抑制的基因得以表达. Li和Carthew [64]发现, 在前体细胞中YAN 抑制miR-7的转录, 使其表达量维持在一个较低的水平. EGFR通路激活后, YAN被磷酸化并降解, 引起miR-7的表达量增加. 此时, miR-7通过结合到YAN 的3′UTR 区抑制YAN 的翻译, 把EGFR 通路激活的效应进一步放大, 促进视网膜前体细胞的分化过程.

除此之外, 人们在果蝇里发现其他几个miRNA 参与调节感觉器官前体分化[65], 调节神经细胞凋亡进而影响果蝇行为, 调节电离辐射引起的细胞凋亡[67], 以及调节神经肌肉结构在变态发育时期的重塑[68].

斑马鱼的胚胎发育时间短, 胚胎期通体透明, 是研究miRNA 在胚胎发育和器官建成中作用的理想模型. 在斑马鱼中突变dicer-1

引起胚胎发育迟缓, 原

肠运动、体节形成以及心脏和脑的发育异常并最终导致斑马鱼在2~3周后死亡. 采用吗啉寡核苷酸(morpholino)和突变的方法的研究结果, 揭示了若干个miRNA 的功能[70]. 抑制miR-430可延迟在从母性到杂合体的转换时期母系来源mRNA 的降解, 并

造成原肠运动期的Nodal 信号通路的抑制[73]; 过表达

m i R -133导致鱼鳍再生过程受抑制

; 抑制

miR-451影响红细胞的成熟, 造成严重的贫血[75]

; 降

低miR-375水平能抑制胰岛细胞的聚集. 另外, 在

斑马鱼里也确认了let-7能够负调控lin-41

, 提示

这一关系从线虫到斑马鱼是保守的. 最近有报道[79], 在斑马鱼里抑制miR-126可引起vegf 通路抑制, 从而影响血管完整性.

在小鼠中, 转基因和基因敲除技术应用得很成功, 而且在研究复杂的器官形成中, 小鼠比果蝇等低等模式生物更有优势, 这为研究miRNA 在复杂系统中的作用提供了可能. 在小鼠敲除dicer 后导致引起胚胎发育迟缓, 突变体胚胎在体轴形成之前死亡

[80]

.

近期在小鼠中用条件性基因敲除方法, 研究dicer 在各个组织器官的功能上取得不少成果. dicer 敲除的小鼠胚胎干细胞增殖受到影响, 分化和着丝粒基因沉

默受到抑制

[81]

; 在卵细胞里敲除dicer 会导致卵细胞

停滞在减数分裂Ⅰ期, 这与在线虫中的研究结果 类似. 在表皮敲除dicer , 引起毛囊发育不良以及过度 增生[83,84]; 在小鼠胚胎肢芽中胚层敲除dicer , 引起肢

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芽细胞死亡, 四肢短小; 在骨骼肌中敲除dicer , 造成四肢发育不全, 进一步的组织学研究确认了肌肉发育不全引发在四肢和舌头的肌肉明显比对照少; 用shh 驱动的CRE 酶介导的条件性敲除, 会导致小鼠肺脏细胞凋亡增加, fgf10表达紊乱, 表现出肺脏分支缺陷; T细胞敲除dicer 后αβ T 细胞的增殖和存活受到抑制, 但CD4/CD8 T细胞不受影响; 在兴奋性前脑神经元特异敲除dicer 会导致小鼠产生头小畸形, 神经元树突分支形成减少, 树突棘长度减短, 但树突棘的密度没有改变, 其中头小畸形与细胞凋亡增加相关.

在小鼠多个组织特异敲除dicer 引起的各种表型变化, 说明了miRNA 功能的多样性, 对小鼠单个miRNA 的研究进一步证明了这一点.

2005年, Zhao等人报道了肌肉特异表达的miR-1调控心肌分化, 这是在小鼠中单个miRNA 功能的最早研究. 在此之后, 在心血管系统及其他系统中关于miRNA 的研究成果不断出现. 在肌肉特异表达的几个miRNA 参与调控细胞增殖、肌肉和心脏发育、心脏电传导以及应激条件下心脏重塑. 血细胞特异表达的miRNA 调节血细胞的发育、分化和功能. 在免疫系统中, miRNA也起着重要作用, 从免疫细胞发育到免疫反应和病毒感染均有miRNA 参与. 甚至病毒也会利用宿主或自身编码的miRNA 来完成自己的生活史.

在植物里, miRNA的功能涉及各个方面. miRNA通路上的各关键蛋白的敲除以及对特定miRNA 的研究表明, miRNA参与植物发育, 对病毒的反应及生物抗性等方面.

miRNA 的功能研究开始于线虫和果蝇, 大规模突变等遗传学技术在这两个模式生物中的运用, 为阐明单个miRNA 在细胞发育、代谢、凋亡等生物学过程中的功能提供了便利. 其后在小鼠中运用转基因和基因敲除等技术使miRNA 功能研究更有针对性. 而斑马鱼由于其自身胚胎发育周期短, 胚胎期通体透明等特性, 成为研究miRNA 在胚胎发育和器官发育中作用的一个有力工具.

4 总结

miRNA 在不同物种的研究充分说明miRNA 广泛地存在于许多物种, 而且在动物和植物中miRNA 的

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产生和作用机制是相当保守的. 对于一些从线虫到哺乳动物都保守的miRNA 如let-7, miR-1等, 在不同模式生物中的研究结果提示, 它们的一部分功能也是保守的. 整合不同模式生物中的研究结果对深入了解miRNA 的作用机制和功能也是非常重要的. 目

前看来, 相对于miRbase12.0[95]中收录的8273个miRNA, 已知确切功能的miRNA 还是少数, 不同模式生物的运用必将为破译这一系列小分子RNA 的秘密提供便利.

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《中国科学》杂志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

模式生物与microRNA 研究

邹俊, 荆清*

中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所, 上海 200025 * 联系人, E-mail: qjing325303@yahoo.cn 收稿日期: 2008-09-26; 接受日期: 2008-12-29

国家重点基础研究发展计划(批准号: 2005CB724602和2007CB947002) 、国家自然科学基金(批准号: 30670437和30770457) 、浦江人才计划(批准号: 05PJ14105)和中国科学院重要方向性项目(批准号: KSCX2-YW-R-096和KSCX1-YW-R-64) 资助

摘要 microRNA(miRNA)是一类内源性、长度在19~25个碱基的小分子非编码RNA, 其在基因的转录后调控中发挥重要功能. miRNA的研究在最近得到了快速发展, 模式生物在这一过程中起到了重要作用. 本文介绍了不同模式生物在miRNA 的发现、作用机制和生物学功能研究中的作用.

关键词

miRNA

模式生物 非编码RNA

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度在19~ 25个碱基的小分子非编码RNA, 在基因的转录后调控发挥重要功能. 从1993年发现第1个miRNA 以来, 到目前为止在miRNA 研究领域已发表的论文近5000篇, 包括很多发表在国际权威杂志上和入选当年十大研究进展的研究论文. 纵观miRNA 研究的历史和现状, 不同模式生物在miRNA 研究的各个方面起到了重要作用. 一方面, miRNA 的广泛存在决定了在各种模式生物中对其进行研究的必要性; 另一方面, miRNA 的形成机制以及相当一部分miRNA 是高度保守的, 比较不同模式生物中的研究结果有助于更好地理解这一类重要分子的生物学功能. 本文就模式生物在miRNA 研究中的几个方面: miRNA的发现、产生和作用机制、生物学功能中的重要作用进行了介绍.

1993 年, Lee等人通过定位克隆的方法发现发育时序调控基因lin-4不编码蛋白, 而是编码一个小RNA, 提出lin-4可能通过结合到lin-14的3′非翻译区(3′UTR) 下调LIN-14的蛋白表达, 并且lin-4成熟序列附近可以形成一个茎环结构. 时隔7年之后, Reinhart等人[2]又在线虫中发现了第2个有发育时序调控作用的小RNA ——let-7. 这两个miRNA 的发现为整个miRNA 领域的发展打开了突破口. 随后, Pasquinelli等人用Northern blot 以及S1 核酸酶作图(S1 nuclease mapping) 等实验手段证明let-7在各物种中高度保守, 进一步为即将到来的miRNA 快速发展时期作好铺垫. 不久, 德国和美国的3个实验室在同一期Science [4~6]上第一次发表了用克隆的方法在线虫、果蝇(Droso- phila melanogaster) 以及哺乳动物细胞里发现了miRNA. miRNA在线虫中的发现与线虫这一模式生物便于进行突变筛选、互补实验以及线虫清晰的发育过程是密不可分的.

结合miRNA 的序列保守性以及侧翼序列二级结构的特点, Lim等人开发出第一个预测miRNA 的软件MirScan, 在线虫中预测了35个新的miRNA, 在人类中预测了107个miRNA, 并实验确认了其中相当一

129

1 模式生物与miRNA 的发现

在miRNA 的发现过程中, 各种模式生物由于其自身的特点而起不同的作用.

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)易于进行遗传学操作, 在早期miRNA 的发现中起着关键作用.

邹俊等: 模式生物与microRNA 研究

部分. 随后, Grad等人[8]也基于miRNA 保守性开发了snarloop 软件, 在线虫里预测了214个miRNA. 果蝇是第一批克隆到miRNA 的物种之一, 并且由于它的基因组相对简单, 用生物信息学方法预测miRNA 的工作在果蝇中也开展得比较早. 基于miRNA 的保守性和miRNA 特有的序列模式, Lai等人[9]开发了miRSeeker 软件, 在果蝇里预测了48个miRNA. 近期, Stark 等人利用12种果蝇的基因组预测了41个新的miRNA 并验证了其中28个. 2002年, Lagos- Quintana 等人通过克隆小鼠(Mus musculus) 各组织的小RNA, 发现了34个新的miRNA, 从空间表达谱上弥补了前期小RNA 克隆的疏漏. 斑马鱼 (Danio rerio ) 是一种新型的脊椎模式生物, 具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明等特点. 在这种模式生物中第一次运用锁核苷酸(locked nucleic acid, LNA)技术完成了115个miRNA 的时空表达谱[12]. 在早期的克隆研究中, 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 是植物中最早进行miRNA 克隆鉴定的物种. 2005年, Dee等人首先在拟南芥中采用大规模测序方法MPSS 鉴定拟南芥miRNA. MPSS和SAGE, RAKE, 454, solexa等大规模测序技术的应用将miRNA 的发现推向了高潮. 在2007年, Molnar等人[16]和Zhao 等人[17]分别在单细胞绿萍莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 中发现了miRNA 和miRNA 相关的蛋白, 更新了人们对miRNA 的认识. 而对不同病毒编码miRNA 的研究进一

步拓宽了我们的研究领域.

在发现miRNA 的历史中, 不得不提及Landgraf 等人[22]的工作. 在2007年, 欧洲20多个实验室通过传统小RNA 克隆方法, 用人、大鼠(Rattus norvegicus) 、小鼠的各个组织器官、细胞系以及人的病理样本构建了250个克隆文库. 这一系统性工作绘制了哺乳动物的miRNA 表达谱, 为此后的miRNA 功能研究提供了很大便利.

通过对比分析不同模式生物miRNA 的信息, 对miRNA 的特点作出了一些归纳: 很多miRNA 的成熟序列在物种间是保守的; 一部分miRNA 成熟序列得到修饰, 包括由A 到I 的编辑造成的A 到G 碱基变化, 及在3′末端加A 或者U; 成熟miRNA 在基因组上的侧翼序列可以折叠成热力学稳定的发卡结构, 侧翼序列存在某些影响miRNA 成熟的基元(motif);

130

相当一部分miRNA 位于基因的内含子区域. 另外, 不同模式生物中的miRNA 的信息为进化生物学和比较基因组学的研究提供了很好的材料.

2 模式生物与miRNA 机制的研究

在miRNA 机制研究中, 多数研究在线虫、果蝇和哺乳动物细胞等模型中进行. 在一些有关miRNA 运输机制的研究中, 非洲爪蟾(Xenopus laevis) 起着重要作用. 在关键机制的发现中, 各模式生物研究结果之间往往相互印证.

早在2001年, Bernstein等人在果蝇里发现了siRNA 产生过程中的关键蛋白DICER, 在线虫里发现了miRNA 系统的一些成分和siRNA 系统共享. Grishok等人[24]通过干扰和敲除实验发现, siRNA系统的关键蛋白DICER 同时也是miRNA 产生和发挥功能所必需的. Dicer 敲除的线虫不能正常发育, 而且与miRNA 产生相关的其他几个蛋白与线虫的时序发育密切关联[25~27].

值得一提的是DGCR8的发现. 2003年, Lee等 人在哺乳动物细胞发现DROSHA 介导pri-miRNA 的剪切. Denli等人和Landthaler 等人分别根据果蝇蛋白的酵母双杂交数据推测, DROSHA可能与DGCR8同源蛋白相互作用, 并实验确认了DGCR8是pri-miRNA 加工复合体的一部分. 特别应该提到的是Gregory 等人用体外重构的DROSHA 和DGCR8成功实现pri-miRNA 的加工. 最近在哺乳动物细胞中的研究发现, DROSHA对pri-miRNA 的加工与mRNA 转录连接在一起, 先于内含子剪切进行.

对miRNA 从核内运输到核外的研究又一次体现了多种模式生物研究交叉整合的优势. Yi等人和Bohnsack 等人[35]分别在哺乳动物细胞中发现, 用siRNA 干扰exportin-5能抑制miRNA 出核. 几乎同时, Lund 等人[36]在爪蟾卵细胞中发现敲除Ran-GTP 能够抑制pre-miRNA 出核, 并进一步证明EXPORTIN-5是关键的运输蛋白, 而且在哺乳动物细胞中也重复出这一结果. 这3个实验室几乎同时发现了这一重要过程, 其中两个(Bohnsack和Lund 实验室) 都采用了爪蟾卵这一经典的细胞核-细胞质运输模型.

Chendrimada 等人在哺乳动物细胞中发现, TRBP 与DICER 相互作用, 并与AGO2构成一个稳定

的复合体执行miRNA 的剪切成熟. Forstemann等人[38]在果蝇中寻找与DCR1相互作用并含有双链RNA 结合结构域(dsRBD)的蛋白时, 发现TRBP 的同源蛋白LOQS 可能是其中之一. 随后他们证明了敲除loqs 确实能够抑制miRNA 的成熟, 导致pre-miRNA 的堆积, 而且LOQS 和DCR1相互作用, 存在于同一复合体中. Saito 等人[39]也独立发现了这一蛋白. Jiang等人[40]运用类似的策略发现了miRNA 成熟过程中另一蛋白R3D1-L.

在miRNA 机制的研究历史中, 线虫被最早用来研究其产生机理, 随后在果蝇和哺乳动物细胞里进一步找到了pri-miRNA 加工复合物的重要成分. 在miRNA 作用机制的研究中, 这些模式生物又发挥了不同的作用.

动物的miRNA 的作用机理早在第一个miRNA lin-4发现时就有所推测. Lee等人发现lin-14的3′UTR 中有几个lin-4的互补位点, 突变lin-4的互补区碱基能导致lin-4缺失的表型. 并且lin-14的 3′UTR 缺失导致lin-14蛋白水平升高, 但mRNA 水平并没有明显变化. 基于这些现象, 他们提出了miRNA 作用机制的一个初步想法, 即lin-4通过与lin-14的3′UTR 结合抑制lin-14蛋白的翻译. 后期研究发现, miRNA在pre-miRNA 被DICER 剪切成miRNA: miRNA*二聚体之后, TRBP募集AGO2[41,42]与DICER 组成复合物, 促使RISC 的组装. 之后在miRNA 介导下, RISC复合体结合到与miRNA 序列完全匹配或不完全匹配的mRNA 上, 导致mRNA 的降解或翻译抑制.

植物中miRNA 的产生和作用机制与动物有所不同[51]. 植物miRNA 从pri-miRNA 至pre- miRNA以及pre-miRNA 到成熟miRNA 的剪切过程都是在核内由DICER 的同源蛋白DCL1执行, 并且需要HYL1和SE 等蛋白. 在成熟miRNA 的3′末端碱基的2位羟基上由HEN1加上甲基, 而miRNA 从核内由EXPOTIN- 5的同源蛋白HASTY 运输到核外. 植物里miRNA 主要通过完全匹配导致靶基因的mRNA 降解[52,53]. 但也有报道

, 在植物里个别miRNA 通过抑制翻译执行其功能.

3 模式生物与miRNA 的生物学功能研究

miRNA 的功能研究一直以来是本领域的核心部分, 近几年的研究已经揭示了部分miRNA 的功能.

中国科学 C 辑: 生命科学 2009年 第39卷 第1期

miRNA 参与胚胎发育、器官形成以及肿瘤发生等方面. 在各模式生物中, 线虫和果蝇因其易于进行突变筛选等遗传操作, 在早期几个miRNA 的功能研究中起着关键作用. 斑马鱼对于胚胎发育及器官形成等过程中miRNA 的功能研究, 发挥着重要作用. 后期由于基因敲除及转基因技术的成功应用, 小鼠在特定组织系统内miRNA 的功能研究以及单个miRNA 的功能研究中发挥了很大作用.

由于线虫各个细胞的命运比较清楚, miRNA在线虫发育过程中作用的研究进行得最早. Ketting等 人[26]发现, dicer 同源基因(dcr-1) 突变的线虫生殖系统发育异常, 而且在成年之前外阴爆裂(burst vulva). 如果同时抑制母系和子代的DICER 则可导致胚胎死 亡[24]. 提示dicer 和miRNA 对胚胎的发育是必需的. 通过正向遗传学方法, 人们在线虫中发现了一些miRNA 的功能, 其中lin-4和let-7家族是著名的发育调控miRNA, lys-4[55]和miR-273[56]则调控神经元不对称发育. 最近, 在线虫里进行系统性的miRNA 基因座突变[57,58], 又发现了几个miRNA 分别在发育和凋亡中起作用.

基因敲除和转基因技术, 广泛应用于果蝇个体和器官发育中的miRNA 功能研究. 在果蝇里敲除Loqs 这一miRNA 产生的重要分子, 将导致雌性不育, dcr-1敲除后果蝇的生殖干细胞分裂异常[59], ago1和dcr-1同时敲除后, 果蝇体节形成出现异常. 对果蝇特异miRNA 的功能研究开始于bantam 和miR-14. Brennecke等人[60]发现用Gal4 系统诱导bantam 过表达能导致细胞数目增多, 引起组织过度增生. 序列保守性分析及实验表明, bantam编码一个21个碱基的miRNA. 这个miRNA 可以通过负调控HID 蛋白的表达抑制细胞凋亡. Xu等人[61]发现敲除miR-14能增强REAPER 依赖的细胞凋亡, 异位表达miR-14抑制凋亡.

在此之后, 又发现一些miRNA 的功能. 果蝇中的miR-1受twist 和mef2调控, miR-1的敲除导致果蝇在二龄幼虫期死亡, 肌肉畸形, 体型变小. 另一个miRNA Mir-iab-4-5p 直接调节UBX 蛋白的表达, 过表达Mir-iab-4-5p 导致平衡杆向翅的转化[63]. 生长因子Spitz 通过EGFR 激活Ras-ERK 信号通路, 引起果蝇视网膜前体细胞向光受体细胞的分化. 这一过程中, 关键蛋白YAN 被ERK 磷酸化后降解, 一些被YAN 转录

131

邹俊等: 模式生物与microRNA 研究

抑制的基因得以表达. Li和Carthew [64]发现, 在前体细胞中YAN 抑制miR-7的转录, 使其表达量维持在一个较低的水平. EGFR通路激活后, YAN被磷酸化并降解, 引起miR-7的表达量增加. 此时, miR-7通过结合到YAN 的3′UTR 区抑制YAN 的翻译, 把EGFR 通路激活的效应进一步放大, 促进视网膜前体细胞的分化过程.

除此之外, 人们在果蝇里发现其他几个miRNA 参与调节感觉器官前体分化[65], 调节神经细胞凋亡进而影响果蝇行为, 调节电离辐射引起的细胞凋亡[67], 以及调节神经肌肉结构在变态发育时期的重塑[68].

斑马鱼的胚胎发育时间短, 胚胎期通体透明, 是研究miRNA 在胚胎发育和器官建成中作用的理想模型. 在斑马鱼中突变dicer-1

引起胚胎发育迟缓, 原

肠运动、体节形成以及心脏和脑的发育异常并最终导致斑马鱼在2~3周后死亡. 采用吗啉寡核苷酸(morpholino)和突变的方法的研究结果, 揭示了若干个miRNA 的功能[70]. 抑制miR-430可延迟在从母性到杂合体的转换时期母系来源mRNA 的降解, 并

造成原肠运动期的Nodal 信号通路的抑制[73]; 过表达

m i R -133导致鱼鳍再生过程受抑制

; 抑制

miR-451影响红细胞的成熟, 造成严重的贫血[75]

; 降

低miR-375水平能抑制胰岛细胞的聚集. 另外, 在

斑马鱼里也确认了let-7能够负调控lin-41

, 提示

这一关系从线虫到斑马鱼是保守的. 最近有报道[79], 在斑马鱼里抑制miR-126可引起vegf 通路抑制, 从而影响血管完整性.

在小鼠中, 转基因和基因敲除技术应用得很成功, 而且在研究复杂的器官形成中, 小鼠比果蝇等低等模式生物更有优势, 这为研究miRNA 在复杂系统中的作用提供了可能. 在小鼠敲除dicer 后导致引起胚胎发育迟缓, 突变体胚胎在体轴形成之前死亡

[80]

.

近期在小鼠中用条件性基因敲除方法, 研究dicer 在各个组织器官的功能上取得不少成果. dicer 敲除的小鼠胚胎干细胞增殖受到影响, 分化和着丝粒基因沉

默受到抑制

[81]

; 在卵细胞里敲除dicer 会导致卵细胞

停滞在减数分裂Ⅰ期, 这与在线虫中的研究结果 类似. 在表皮敲除dicer , 引起毛囊发育不良以及过度 增生[83,84]; 在小鼠胚胎肢芽中胚层敲除dicer , 引起肢

132

芽细胞死亡, 四肢短小; 在骨骼肌中敲除dicer , 造成四肢发育不全, 进一步的组织学研究确认了肌肉发育不全引发在四肢和舌头的肌肉明显比对照少; 用shh 驱动的CRE 酶介导的条件性敲除, 会导致小鼠肺脏细胞凋亡增加, fgf10表达紊乱, 表现出肺脏分支缺陷; T细胞敲除dicer 后αβ T 细胞的增殖和存活受到抑制, 但CD4/CD8 T细胞不受影响; 在兴奋性前脑神经元特异敲除dicer 会导致小鼠产生头小畸形, 神经元树突分支形成减少, 树突棘长度减短, 但树突棘的密度没有改变, 其中头小畸形与细胞凋亡增加相关.

在小鼠多个组织特异敲除dicer 引起的各种表型变化, 说明了miRNA 功能的多样性, 对小鼠单个miRNA 的研究进一步证明了这一点.

2005年, Zhao等人报道了肌肉特异表达的miR-1调控心肌分化, 这是在小鼠中单个miRNA 功能的最早研究. 在此之后, 在心血管系统及其他系统中关于miRNA 的研究成果不断出现. 在肌肉特异表达的几个miRNA 参与调控细胞增殖、肌肉和心脏发育、心脏电传导以及应激条件下心脏重塑. 血细胞特异表达的miRNA 调节血细胞的发育、分化和功能. 在免疫系统中, miRNA也起着重要作用, 从免疫细胞发育到免疫反应和病毒感染均有miRNA 参与. 甚至病毒也会利用宿主或自身编码的miRNA 来完成自己的生活史.

在植物里, miRNA的功能涉及各个方面. miRNA通路上的各关键蛋白的敲除以及对特定miRNA 的研究表明, miRNA参与植物发育, 对病毒的反应及生物抗性等方面.

miRNA 的功能研究开始于线虫和果蝇, 大规模突变等遗传学技术在这两个模式生物中的运用, 为阐明单个miRNA 在细胞发育、代谢、凋亡等生物学过程中的功能提供了便利. 其后在小鼠中运用转基因和基因敲除等技术使miRNA 功能研究更有针对性. 而斑马鱼由于其自身胚胎发育周期短, 胚胎期通体透明等特性, 成为研究miRNA 在胚胎发育和器官发育中作用的一个有力工具.

4 总结

miRNA 在不同物种的研究充分说明miRNA 广泛地存在于许多物种, 而且在动物和植物中miRNA 的

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产生和作用机制是相当保守的. 对于一些从线虫到哺乳动物都保守的miRNA 如let-7, miR-1等, 在不同模式生物中的研究结果提示, 它们的一部分功能也是保守的. 整合不同模式生物中的研究结果对深入了解miRNA 的作用机制和功能也是非常重要的. 目

前看来, 相对于miRbase12.0[95]中收录的8273个miRNA, 已知确切功能的miRNA 还是少数, 不同模式生物的运用必将为破译这一系列小分子RNA 的秘密提供便利.

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