传感器技术(JournalofTransducerTechnology) 2002年第21卷第6期 54
前沿技术
基因芯片及其应用3
杨明星1,高志贤1,王升启2
(1.军事医学科学院卫生学与环境医学研究所,天津300050;2.军事医学科学院,100850)
摘 要:基因芯片技术作为一种新的技术平台,、单核苷酸多态性分析、。越来越重要的作用。、研究进展和应用作一介绍。关键词:基因芯片;;: 文章编号:1000-9787(2002)06-0054-05
Genechipanditsapplication
YANGMing2xing1,GAOZhi2xian1,WANGSheng2qi2
(1.InstofHygieneandEnvironmentalMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Tianjin300050,China;
2.InstofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)
Abstract:Genechiphasbeenwidelyusedinbioscienceresearchasanewtechnicalflat.Theappliedfieldin2cludesanalysisofgeneexpress,genepolymorphismstudiesandclinicaldiagnoseetal.Withthedevelopmentofthistechnology,itwillplayaveryimportanteffectinbioscienceresearch.Thereviewdescribesbasicprinciple,classify,detectionprocess,unsolvedproblem,researchandapplicationongenechip.Keywords:genechip;biochip;detection
0 前 言hybridization,SBH)。SBH是指用一系列短的、已知
随着人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的完成,大量的核苷酸序列呈现在人们面前,
序列的寡核苷酸探针与目标DNA进行杂交,根据杂交模式构建目标DNA的序列。例如一个长度为12个寡核苷酸的DNA单链,其碱基组成为AGCC2TAGCTGAA,和由A、T、C、G四种核苷酸任意组合
此时研究特定条件下基因是如何表达的以及各个基因的功能是人们面临的又一挑战。用传统的方法进行这项工作将耗费大量的人力、物力。而基因芯片技术因具有高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点[1],将是进行这项研究的最有力工具。基因芯片(genechip)又称DNA芯片(DNAchip),是指在面积不大的基片表面有序地固定大量的基因探针(geneprobe),从而形成的DNA微阵列。芯片上每
形成的八聚体寡核苷酸探针(65536个)进行杂交反应,结果有5种探针可以和目标DNA互补结合,它们分别是TCGGATCG、CGGATCGA、GGATC2GAC、GATCGACT、ATCGACTT,将这些具有重叠
序列的探针进行重排就可以构建目标DNA的互补序列。
2 基因芯片的分类
一特定位置的核苷酸序列都是已知的,杂交后根据各点产生的荧光信号强弱,利用激光共聚焦扫描和电荷耦合器件(CCD)成像等方法对杂交结果进行检测,从而实现样品的分析。1 基因芯片的基本原理
根据基因芯片上固定的探针不同,可以将基因芯片分为寡核苷酸芯片及cDNA芯片两种类型。2.1 片上就位合成寡核苷酸点阵芯片
此种芯片制作技术是利用就位合成法在基片表面上直接合成寡核苷酸,最初合成的是八核苷酸的
基因芯片的基本原理是杂交测序(sequenceby
收稿日期:2002-03-14
3基金项目:国家自然科学基金项目(30000137);天津市自然科
学基金项目(013608811)
第6期 杨明星等:基因芯片及其应用 55
探针,目前已可合成长为20个核苷酸的探针。美国某公司利用原位寡核苷酸光刻合成技术直接在硅片表面合成了高密度的寡核苷酸点阵。该技术主要包括以下几个基本部分:
(1)利用表面化学技术使载体(玻璃片、硅片、聚
浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度及杂交温度、时间等,所以应根据具体情况选择合适的杂交条件。如进行基因表达检测时,需要在低温、高盐浓度下进行较长时间的反应,相反进行基因突变检测时需要在高温、低盐浓度下进行较短时间的反应[3]。4 基因芯片技术存在的问题
丙烯酰胺凝胶膜、尼龙膜等)表面活化,然后固定核酸探针;
(2)将可感光保护基团连在核苷酸单体的5’羟
目前,制,,、人类(HIV)及p53基因等一系列基因芯片。但是基因芯片技术要普遍应用于临床及实验室
还有许多问题需要解决,如(1)85%的RNA转录后得到的产物是微量的,如何对其表达的微小变化进行检测。(2)在杂交反应中存在着探针与靶分子的错配、未配问题,基因芯片的特异性有待进一步提高。(3)简化样品的制备及标记过程。(4)靶DNA形成二级甚至三级结构,影响结果的判断[4]。(5)信号检测的灵敏度有待进一步提高。(6)从样品制备、标记、杂交反应直至检测全过程的集成化,也就是建立缩微芯片实验室(laboratoryonachip)。(7)如何确定一个合适的标准用来比较来自不同实
基上;
(3),护,5体,此单体和脱保护的羟基发生化合反应从而实现其固定,应用不同的光刻底片,反复进行就可合成所需的寡核苷酸阵列。目前用这种方法可以在1cm2的基片上合成40万个寡核苷酸点阵。2.2 点样法制作基因芯片
此种方法是将预先合成好的探针、cDNA克隆通过精密的机械装置吸入加样器中,然后将样品点加于基片上从而制得的DNA阵列。每次加样结束后,都要清洗加样器,以保证下一个样品不受污染。此方法根据点样时针头是否与芯片接触而分为直接打印法和喷墨法两种。前者针头与芯片接触,后者通过驱动装置定量的将样品喷于芯片上。
光刻合成法虽然可以在基片上合成高密的寡核苷酸阵列,但是其操作复杂、耗时、成本高且只能合成短的寡核苷酸探针。点样法合成的寡核苷酸探针密度虽低,但其操作简单、成本低、探针的长度比前者大得多,目前许多公司采用点样法进行芯片制作。3 基因芯片的检测过程
验室的结果?如何实现实验室间的数据共享[5～7]。
上述问题是近期和今后一段时间内基因芯片研究的主要问题,也是此技术由实验室研究阶段进入实际应用阶段需要解决的关键问题。5 基因芯片技术的研究进展
自从基因芯片技术问世以来,在基因芯片的制作、样品的扩增、杂交条件的优化及检测系统的选择等方面出现了许多新方法,为这一技术的成熟提供了条件。有关进展介绍如下:
在利用基因芯片进行检测时,如果靶DNA较长,往往会形成内部的二级乃至三级结构,使其不能与芯片上的探针结合,影响结果的判断。AlekseiDrobyshev等人[4]在用基因芯片进行β-地中海贫血突变检测中,将靶RNA切成长度为20～40个核苷酸的片段,发现其扩散进入聚丙烯酰胺凝胶的速度明显加快,杂交信号的强度比以前增加5倍,杂交时间从原来的1～10h减到10～20min,并且有效地防止了二级结构的形成,在样品的制备过程中采用这种方法将会成为解决上述问题的有效手段。
目前有许多研究者采用聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的固定[4,8,9],这种方法有许多优点:凝胶可以提供一个三维的固定空间,固定容量大,是常规二
从组织细胞等样品中获得的DNA或RNA由于所含的目的基因少,为提高检测的灵敏度,样品在与芯片进行杂交反应前,需要进行一系列的处理,包括DNA或RNA的分离纯化,纯化后样品的扩增及标记。标记的方法通常是在扩增的底物中加入荧光标记的寡核苷酸单体[2]。将标记好的样品与芯片进行杂交反应,样品中的核酸片段会与和其互补的探针结合,待反应结束后将芯片上未杂交上的样品洗去,然后用激光共聚焦检测系统对芯片表面各个点荧光信号的强弱进行定量分析,从而对结果进行判断。因基因芯片上的杂交属于固-液相反应,许多因素会影响异源双链的形成,如靶分子浓度、探针
传感器技术 第21卷 56
维固定容量的100倍,荧光背景低,芯片可以长时间保存并可以反复利用(15～50次),凝胶上固定的寡核苷酸在空间上均匀分布彼此互不干扰,在其上进行的杂交反应接近于液相反应,这样有利于提高检测的灵敏度,而且容易识别出有错配碱基的杂交双链。
与普通的利用荧光信号进行检测不同,CMS(ClinicalMicroSensors)公司利用电信号进行芯片检
片表面的众多微电极构成。根据需要可以在电极的表面产生不同的电场,从而可以将多种带电分子(DNA,RNA,蛋白质,酶,抗体及微粒子)转移或者
固定到特定的电极表面。制作这种电极的关键步骤
是在电极表面形成渗透层(9～10μm厚的多孔水凝胶物质)。地与电极面接触,子(寡核苷酸、)。渗透层可以
测[10],在芯片表面,,Yershov(contiguousstacking)进行β-地中海贫血基
,,改善在杂交过程中电解产物导致的不利作用。用普通的基因芯片进行杂交反应时,反应的效率受靶DNA浓度、温度、溶液及冲洗液中的盐浓度等多种因素的影响[3]。这种“被动式”的杂交反应限制了杂交反应的速度和选择性的提高。而“主动式微电子基因芯片”可以克服“被动式”芯片的不足,可以将DNA探针快速地转移到阵列的任何位置并实现探针的固定;利用电场可以加速杂交反应的速度;迅速地识别出仅有一个碱基发生错配的双链。这种由微电极构成的基因芯片之所以被称为术,并应用电场进行分子转移及杂交反应[14,15]。6 基因芯片的应用6.1 疾病的诊断与治疗
因突变的检测,发现用CSH法进行序列分析比常规的芯片检测更灵敏,可靠,而且CSH可以简化大规模的基因突变检测和多态性分析。其原理是先在芯片上固定一系列具有重叠序列的探针,这些探针与突变发生部位邻近,当第一轮反应完成之后,再加入含有5个寡核苷酸的荧光标记探针,后者可以和结当荧光标记探针与靶DNA不完全互补时,这种堆集反应大大减弱,从而使荧光标记探针不能与靶DNA结合。利用CSH进行基因突变检测具有灵敏
合上的待测物结合,并和固定的探针发生堆集反应。“主动式芯片”是因为它应用了微加工及微电子技
度高,信号强等许多优点。
由于目前的检测系统尚不能检出未扩增的标记样品,所以从组织或血液中得到的核酸样品在与芯片进行反应之前需要扩增。但目前存在的问题是在溶液中进行PCR(聚合酶链反应,polymerasechainreaction)反应时,存在着引物竞争问题,以至于低丰
在这一领域基因芯片将会有广阔的应用前景,如对病原微生物感染的诊断,目前临床检验室需要很长时间,往往结果出来时已经没有参考价值,而且检测结果的特异性差,医生只能根据经验用药。如果在检验中应用基因芯片技术,就可以在短时间内判定是哪一种微生物导致的感染,及时地指导医生的治疗。利用芯片技术还可以对易患某些疾病的高危人群进行普查。此外它还可用于内分泌系统、免役系统、血液系统等疾病的早期诊断。6.2 基因表达分析
度的靶序列难以有效的扩增出来。针对这一问题许
多公司都进行了研究。(注:丰度指细胞内某个基因表达的拷贝数)。
美国的MosaicTechnologies公司设计出一种固相PCR系统[12],它将两套引物固定在丙烯酰胺膜上,每套引物都可以从靶序列的两头开始延伸。将膜置于含有核酸样品和PCR试剂的溶液中,如果样品含有靶序列DNA就从引物的两头开始合成,并在引物之间形成双链DNA环。这种在固相上进行的PCR反应避免了引物竞争,减少了操作步骤及残留物污染,是一种有效的扩增低丰度靶序列的方法。
近年,Heller等人[13]发明了一种“主动式微电子基因芯片”,这种芯片可以用来进行多重DNA杂交、各种基因组研究及疾病的诊断。它由固定在基
同一组织细胞在不同的发育阶段,不同外界环境因素影响下,其基因的表达模式不同。同一个体的不同组织器官的基因表达模式也不相同。如何研究众多基因表达与否及其表达丰度是人们关注的一个焦点问题。用传统的方法一次只能研究某个基因的表达情况,远不能满足这一要求,而基因芯片技术由于具有高度并行性,高通量的特点正适合于此项研究。文献[1]中,斯坦福大学的DeRisi等人用基因芯片检测肿瘤抑制系统对基因表达的影响,他将与细胞衰老调控有关的人第六号染色体引入到黑素
第6期 杨明星等:基因芯片及其应用 57
瘤细胞中,结果发现黑素瘤细胞中癌基因受到了抑制,在被检测的900多个基因中有1.7%的基因表达下调,7%的基因表达上调。Miki等人[16]研制出一种含有18816个cDNA的基因芯片,利用这一芯片对鼠的胚胎组织和成熟组织的基因表达模式进行比较研究,从而对鼠生长发育过程中基因表达的变化有了较全面的认识。6.3 基因型及多态性分析
质结合位点发挥重要作用。6.7 在营养与食品卫生领域的应用
采用生物芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系,将为揭示肥胖的发生机理及预防打下基础。此外,营养与肿瘤相关基因表达的研究,如癌基因、抑癌基因的表达与突变;、糖尿病、免疫系。还/金属硫蛋、转运与分布的关系;视黄醇受体/视黄醇受体基因与维生素A的吸收、转运与代谢的关系等。
生物芯片在食品卫生方面也具有较好的应用前景。食品营养成分的分析(蛋白质),食品中有毒、有害化学物质的分析、检测食品中污染的致病微生物的检测,食品中生物毒素(细菌毒素、真菌毒素)的检测等大量的监督检测工作几乎都可以用生物芯片来完成。
6.8 在环境科学领域中的应用
在进化过程中,存在着不同的基因型,片可以对基因状关进行研究。Affymetrixp53基因芯片可以检测该基
因的400多个突变型,而这些突变型又与肿瘤的发生有密切的关系,通过对该基因的检测就可以预测个体肿瘤发生的机率。Koial等人用基因芯片对HIV蛋白酶基因进行检测时发现该基因有许多突变
型,这一结果与用标准方法进行测序的一致性达98%。6.4 杂交测序
由A、T、C、G四种核苷酸单体组合所形成的所有可能八体寡核苷酸探针共有65536种。将这些种类的探针全部固定于活化的载体表面,形成寡核苷酸阵列。然后芯片与样品进行杂交,通过计算机对杂交模式进行分析,就可以得出样品的核苷酸序列信息。6.5 药物开发
基因芯片技术在环境科学领域具有广阔的应用前景。首先是环境污染物的检测、监测与评价:环境污染物主要包括有机化学性污染物、无机污染物、微生物及毒素等,可以用基因芯片检测环境中的各种微生物。通过这些技术,可以对环境质量进行评价。其次,可以利用生物芯片技术研究环境污染物对人体健康的影响:包括环境污染物致癌机理研究,环境污染物对人体敏感基因的作用研究等。此外,生物芯片技术还可以在环境污染物的分布与转归研究,环境污染物治理效果评价,环境修复微生物的筛选与改造等领域发挥作用。
毒理芯片(ToxChip)目前已成为环境毒理学研究的热点。ToxChip可帮助预防环境暴露引起的疾病,还可用于新药的临床试验甚至建议合适的治疗剂量[18]。
6.9 在生物战剂和化学战剂侦检中的应用
基因芯片技术在药物的开发领域也有着广阔的应用前景,例如通过比较正常组织与疾病组织的表达情况,可以发现许多与疾病相关的基因,为寻找药物的靶分子提供了一条新途径。6.6 核酸和蛋白质相互作用的研究
蛋白质与特定的核酸片段结合对基因的表达起着重要的调控作用,通过对蛋白质与核酸相互作用的研究,人们可以更深入的了解生命活动的内在机制。对这些DNA片段的研究一般是通过测定DNA发生突变后核酸和蛋白质的结合情况来推测的。这些测定包括硝化纤维素结合反应,凝胶转换分析,Southwesternblotting,但应用这些方法工作量大,操
生物战剂与化学战剂的侦检是一项很复杂而又十分重要的工作,目前很难对所有的生物与化学战剂进行快速而准确的检测。然而,采用生物芯片技术却可以较容易地完成这一艰巨任务。我们可以采用基因芯片技术检测细菌及其毒素、真菌毒素、病毒、支原体、依原体、立克次氏体等生物战剂;利用免疫芯片或酶芯片检测各种蛋白毒素类生物战剂和侦
作繁琐。Bulyk等人[17]发明了一种方法,可以将单链DNA阵列转换成双链DNA阵列,并且可以对这些双链DNA进行修饰(如甲基化)。经研究证明这些双链DNA阵列可应用于大规模的核酸和蛋白质相互作用的研究,尤其是揭示基因组中特异的蛋白
传感器技术 第21卷 58
检化学战剂。据悉,目前外军都在积极研制用于生物战剂与化学战剂侦检的生物芯片。7 结束语
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综上所述,基因芯片作为生命科学研究的一种新的技术平台,日益受到人们的关注,并已经广泛的应用于生命科学研究的各个领域。随着这一技术的不断完善,它将使科研人员从繁重的常规操作中解脱出来,可以预见在不久的将来它成为实验室中不可缺少的技术平台。参考文献:
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作者简介:
杨明星(1975-),男,河北承德人,硕士生,目前从事生物芯片技术及其在卫生监测中的应用研究。
(上接第53页)
有机地与PSP校准系统结合在一起,充分发挥Lab2VIEW的优势,使PSP校准系统达到了全面自动
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四川绵阳:国防科学技术预先研究空气动力学项目管理办公室,2001.
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化。人机界面友好、直观,操作简单、快捷,大大提高了该系统的运行效率;保证了系统测试参数的准确度;为在风洞中的光学压敏涂料测压试验奠定了坚实可靠的基础。参考文献:
作者简介:
肖亚克(1953-),男,山西原平人,工程师。从事自动化测量、控制工作。
传感器技术(JournalofTransducerTechnology) 2002年第21卷第6期 54
前沿技术
基因芯片及其应用3
杨明星1,高志贤1,王升启2
(1.军事医学科学院卫生学与环境医学研究所,天津300050;2.军事医学科学院,100850)
摘 要:基因芯片技术作为一种新的技术平台,、单核苷酸多态性分析、。越来越重要的作用。、研究进展和应用作一介绍。关键词:基因芯片;;: 文章编号:1000-9787(2002)06-0054-05
Genechipanditsapplication
YANGMing2xing1,GAOZhi2xian1,WANGSheng2qi2
(1.InstofHygieneandEnvironmentalMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Tianjin300050,China;
2.InstofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)
Abstract:Genechiphasbeenwidelyusedinbioscienceresearchasanewtechnicalflat.Theappliedfieldin2cludesanalysisofgeneexpress,genepolymorphismstudiesandclinicaldiagnoseetal.Withthedevelopmentofthistechnology,itwillplayaveryimportanteffectinbioscienceresearch.Thereviewdescribesbasicprinciple,classify,detectionprocess,unsolvedproblem,researchandapplicationongenechip.Keywords:genechip;biochip;detection
0 前 言hybridization,SBH)。SBH是指用一系列短的、已知
随着人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的完成,大量的核苷酸序列呈现在人们面前,
序列的寡核苷酸探针与目标DNA进行杂交,根据杂交模式构建目标DNA的序列。例如一个长度为12个寡核苷酸的DNA单链,其碱基组成为AGCC2TAGCTGAA,和由A、T、C、G四种核苷酸任意组合
此时研究特定条件下基因是如何表达的以及各个基因的功能是人们面临的又一挑战。用传统的方法进行这项工作将耗费大量的人力、物力。而基因芯片技术因具有高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点[1],将是进行这项研究的最有力工具。基因芯片(genechip)又称DNA芯片(DNAchip),是指在面积不大的基片表面有序地固定大量的基因探针(geneprobe),从而形成的DNA微阵列。芯片上每
形成的八聚体寡核苷酸探针(65536个)进行杂交反应,结果有5种探针可以和目标DNA互补结合,它们分别是TCGGATCG、CGGATCGA、GGATC2GAC、GATCGACT、ATCGACTT,将这些具有重叠
序列的探针进行重排就可以构建目标DNA的互补序列。
2 基因芯片的分类
一特定位置的核苷酸序列都是已知的,杂交后根据各点产生的荧光信号强弱,利用激光共聚焦扫描和电荷耦合器件(CCD)成像等方法对杂交结果进行检测,从而实现样品的分析。1 基因芯片的基本原理
根据基因芯片上固定的探针不同,可以将基因芯片分为寡核苷酸芯片及cDNA芯片两种类型。2.1 片上就位合成寡核苷酸点阵芯片
此种芯片制作技术是利用就位合成法在基片表面上直接合成寡核苷酸,最初合成的是八核苷酸的
基因芯片的基本原理是杂交测序(sequenceby
收稿日期:2002-03-14
3基金项目:国家自然科学基金项目(30000137);天津市自然科
学基金项目(013608811)
第6期 杨明星等:基因芯片及其应用 55
探针,目前已可合成长为20个核苷酸的探针。美国某公司利用原位寡核苷酸光刻合成技术直接在硅片表面合成了高密度的寡核苷酸点阵。该技术主要包括以下几个基本部分:
(1)利用表面化学技术使载体(玻璃片、硅片、聚
浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度及杂交温度、时间等,所以应根据具体情况选择合适的杂交条件。如进行基因表达检测时,需要在低温、高盐浓度下进行较长时间的反应,相反进行基因突变检测时需要在高温、低盐浓度下进行较短时间的反应[3]。4 基因芯片技术存在的问题
丙烯酰胺凝胶膜、尼龙膜等)表面活化,然后固定核酸探针;
(2)将可感光保护基团连在核苷酸单体的5’羟
目前,制,,、人类(HIV)及p53基因等一系列基因芯片。但是基因芯片技术要普遍应用于临床及实验室
还有许多问题需要解决,如(1)85%的RNA转录后得到的产物是微量的,如何对其表达的微小变化进行检测。(2)在杂交反应中存在着探针与靶分子的错配、未配问题,基因芯片的特异性有待进一步提高。(3)简化样品的制备及标记过程。(4)靶DNA形成二级甚至三级结构,影响结果的判断[4]。(5)信号检测的灵敏度有待进一步提高。(6)从样品制备、标记、杂交反应直至检测全过程的集成化,也就是建立缩微芯片实验室(laboratoryonachip)。(7)如何确定一个合适的标准用来比较来自不同实
基上;
(3),护,5体,此单体和脱保护的羟基发生化合反应从而实现其固定,应用不同的光刻底片,反复进行就可合成所需的寡核苷酸阵列。目前用这种方法可以在1cm2的基片上合成40万个寡核苷酸点阵。2.2 点样法制作基因芯片
此种方法是将预先合成好的探针、cDNA克隆通过精密的机械装置吸入加样器中,然后将样品点加于基片上从而制得的DNA阵列。每次加样结束后,都要清洗加样器,以保证下一个样品不受污染。此方法根据点样时针头是否与芯片接触而分为直接打印法和喷墨法两种。前者针头与芯片接触,后者通过驱动装置定量的将样品喷于芯片上。
光刻合成法虽然可以在基片上合成高密的寡核苷酸阵列,但是其操作复杂、耗时、成本高且只能合成短的寡核苷酸探针。点样法合成的寡核苷酸探针密度虽低,但其操作简单、成本低、探针的长度比前者大得多,目前许多公司采用点样法进行芯片制作。3 基因芯片的检测过程
验室的结果?如何实现实验室间的数据共享[5～7]。
上述问题是近期和今后一段时间内基因芯片研究的主要问题,也是此技术由实验室研究阶段进入实际应用阶段需要解决的关键问题。5 基因芯片技术的研究进展
自从基因芯片技术问世以来,在基因芯片的制作、样品的扩增、杂交条件的优化及检测系统的选择等方面出现了许多新方法,为这一技术的成熟提供了条件。有关进展介绍如下:
在利用基因芯片进行检测时,如果靶DNA较长,往往会形成内部的二级乃至三级结构,使其不能与芯片上的探针结合,影响结果的判断。AlekseiDrobyshev等人[4]在用基因芯片进行β-地中海贫血突变检测中,将靶RNA切成长度为20～40个核苷酸的片段,发现其扩散进入聚丙烯酰胺凝胶的速度明显加快,杂交信号的强度比以前增加5倍,杂交时间从原来的1～10h减到10～20min,并且有效地防止了二级结构的形成,在样品的制备过程中采用这种方法将会成为解决上述问题的有效手段。
目前有许多研究者采用聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的固定[4,8,9],这种方法有许多优点:凝胶可以提供一个三维的固定空间,固定容量大,是常规二
从组织细胞等样品中获得的DNA或RNA由于所含的目的基因少,为提高检测的灵敏度,样品在与芯片进行杂交反应前,需要进行一系列的处理,包括DNA或RNA的分离纯化,纯化后样品的扩增及标记。标记的方法通常是在扩增的底物中加入荧光标记的寡核苷酸单体[2]。将标记好的样品与芯片进行杂交反应,样品中的核酸片段会与和其互补的探针结合,待反应结束后将芯片上未杂交上的样品洗去,然后用激光共聚焦检测系统对芯片表面各个点荧光信号的强弱进行定量分析,从而对结果进行判断。因基因芯片上的杂交属于固-液相反应,许多因素会影响异源双链的形成,如靶分子浓度、探针
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维固定容量的100倍,荧光背景低,芯片可以长时间保存并可以反复利用(15～50次),凝胶上固定的寡核苷酸在空间上均匀分布彼此互不干扰,在其上进行的杂交反应接近于液相反应,这样有利于提高检测的灵敏度,而且容易识别出有错配碱基的杂交双链。
与普通的利用荧光信号进行检测不同,CMS(ClinicalMicroSensors)公司利用电信号进行芯片检
片表面的众多微电极构成。根据需要可以在电极的表面产生不同的电场,从而可以将多种带电分子(DNA,RNA,蛋白质,酶,抗体及微粒子)转移或者
固定到特定的电极表面。制作这种电极的关键步骤
是在电极表面形成渗透层(9～10μm厚的多孔水凝胶物质)。地与电极面接触,子(寡核苷酸、)。渗透层可以
测[10],在芯片表面,,Yershov(contiguousstacking)进行β-地中海贫血基
,,改善在杂交过程中电解产物导致的不利作用。用普通的基因芯片进行杂交反应时,反应的效率受靶DNA浓度、温度、溶液及冲洗液中的盐浓度等多种因素的影响[3]。这种“被动式”的杂交反应限制了杂交反应的速度和选择性的提高。而“主动式微电子基因芯片”可以克服“被动式”芯片的不足,可以将DNA探针快速地转移到阵列的任何位置并实现探针的固定;利用电场可以加速杂交反应的速度;迅速地识别出仅有一个碱基发生错配的双链。这种由微电极构成的基因芯片之所以被称为术,并应用电场进行分子转移及杂交反应[14,15]。6 基因芯片的应用6.1 疾病的诊断与治疗
因突变的检测,发现用CSH法进行序列分析比常规的芯片检测更灵敏,可靠,而且CSH可以简化大规模的基因突变检测和多态性分析。其原理是先在芯片上固定一系列具有重叠序列的探针,这些探针与突变发生部位邻近,当第一轮反应完成之后,再加入含有5个寡核苷酸的荧光标记探针,后者可以和结当荧光标记探针与靶DNA不完全互补时,这种堆集反应大大减弱,从而使荧光标记探针不能与靶DNA结合。利用CSH进行基因突变检测具有灵敏
合上的待测物结合,并和固定的探针发生堆集反应。“主动式芯片”是因为它应用了微加工及微电子技
度高,信号强等许多优点。
由于目前的检测系统尚不能检出未扩增的标记样品,所以从组织或血液中得到的核酸样品在与芯片进行反应之前需要扩增。但目前存在的问题是在溶液中进行PCR(聚合酶链反应,polymerasechainreaction)反应时,存在着引物竞争问题,以至于低丰
在这一领域基因芯片将会有广阔的应用前景,如对病原微生物感染的诊断,目前临床检验室需要很长时间,往往结果出来时已经没有参考价值,而且检测结果的特异性差,医生只能根据经验用药。如果在检验中应用基因芯片技术,就可以在短时间内判定是哪一种微生物导致的感染,及时地指导医生的治疗。利用芯片技术还可以对易患某些疾病的高危人群进行普查。此外它还可用于内分泌系统、免役系统、血液系统等疾病的早期诊断。6.2 基因表达分析
度的靶序列难以有效的扩增出来。针对这一问题许
多公司都进行了研究。(注:丰度指细胞内某个基因表达的拷贝数)。
美国的MosaicTechnologies公司设计出一种固相PCR系统[12],它将两套引物固定在丙烯酰胺膜上,每套引物都可以从靶序列的两头开始延伸。将膜置于含有核酸样品和PCR试剂的溶液中,如果样品含有靶序列DNA就从引物的两头开始合成,并在引物之间形成双链DNA环。这种在固相上进行的PCR反应避免了引物竞争,减少了操作步骤及残留物污染,是一种有效的扩增低丰度靶序列的方法。
近年,Heller等人[13]发明了一种“主动式微电子基因芯片”,这种芯片可以用来进行多重DNA杂交、各种基因组研究及疾病的诊断。它由固定在基
同一组织细胞在不同的发育阶段,不同外界环境因素影响下,其基因的表达模式不同。同一个体的不同组织器官的基因表达模式也不相同。如何研究众多基因表达与否及其表达丰度是人们关注的一个焦点问题。用传统的方法一次只能研究某个基因的表达情况,远不能满足这一要求,而基因芯片技术由于具有高度并行性,高通量的特点正适合于此项研究。文献[1]中,斯坦福大学的DeRisi等人用基因芯片检测肿瘤抑制系统对基因表达的影响,他将与细胞衰老调控有关的人第六号染色体引入到黑素
第6期 杨明星等:基因芯片及其应用 57
瘤细胞中,结果发现黑素瘤细胞中癌基因受到了抑制,在被检测的900多个基因中有1.7%的基因表达下调,7%的基因表达上调。Miki等人[16]研制出一种含有18816个cDNA的基因芯片,利用这一芯片对鼠的胚胎组织和成熟组织的基因表达模式进行比较研究,从而对鼠生长发育过程中基因表达的变化有了较全面的认识。6.3 基因型及多态性分析
质结合位点发挥重要作用。6.7 在营养与食品卫生领域的应用
采用生物芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系,将为揭示肥胖的发生机理及预防打下基础。此外,营养与肿瘤相关基因表达的研究,如癌基因、抑癌基因的表达与突变;、糖尿病、免疫系。还/金属硫蛋、转运与分布的关系;视黄醇受体/视黄醇受体基因与维生素A的吸收、转运与代谢的关系等。
生物芯片在食品卫生方面也具有较好的应用前景。食品营养成分的分析(蛋白质),食品中有毒、有害化学物质的分析、检测食品中污染的致病微生物的检测,食品中生物毒素(细菌毒素、真菌毒素)的检测等大量的监督检测工作几乎都可以用生物芯片来完成。
6.8 在环境科学领域中的应用
在进化过程中,存在着不同的基因型,片可以对基因状关进行研究。Affymetrixp53基因芯片可以检测该基
因的400多个突变型,而这些突变型又与肿瘤的发生有密切的关系,通过对该基因的检测就可以预测个体肿瘤发生的机率。Koial等人用基因芯片对HIV蛋白酶基因进行检测时发现该基因有许多突变
型,这一结果与用标准方法进行测序的一致性达98%。6.4 杂交测序
由A、T、C、G四种核苷酸单体组合所形成的所有可能八体寡核苷酸探针共有65536种。将这些种类的探针全部固定于活化的载体表面,形成寡核苷酸阵列。然后芯片与样品进行杂交,通过计算机对杂交模式进行分析,就可以得出样品的核苷酸序列信息。6.5 药物开发
基因芯片技术在环境科学领域具有广阔的应用前景。首先是环境污染物的检测、监测与评价:环境污染物主要包括有机化学性污染物、无机污染物、微生物及毒素等,可以用基因芯片检测环境中的各种微生物。通过这些技术,可以对环境质量进行评价。其次,可以利用生物芯片技术研究环境污染物对人体健康的影响:包括环境污染物致癌机理研究,环境污染物对人体敏感基因的作用研究等。此外,生物芯片技术还可以在环境污染物的分布与转归研究,环境污染物治理效果评价,环境修复微生物的筛选与改造等领域发挥作用。
毒理芯片(ToxChip)目前已成为环境毒理学研究的热点。ToxChip可帮助预防环境暴露引起的疾病,还可用于新药的临床试验甚至建议合适的治疗剂量[18]。
6.9 在生物战剂和化学战剂侦检中的应用
基因芯片技术在药物的开发领域也有着广阔的应用前景,例如通过比较正常组织与疾病组织的表达情况,可以发现许多与疾病相关的基因,为寻找药物的靶分子提供了一条新途径。6.6 核酸和蛋白质相互作用的研究
蛋白质与特定的核酸片段结合对基因的表达起着重要的调控作用,通过对蛋白质与核酸相互作用的研究,人们可以更深入的了解生命活动的内在机制。对这些DNA片段的研究一般是通过测定DNA发生突变后核酸和蛋白质的结合情况来推测的。这些测定包括硝化纤维素结合反应,凝胶转换分析,Southwesternblotting,但应用这些方法工作量大,操
生物战剂与化学战剂的侦检是一项很复杂而又十分重要的工作,目前很难对所有的生物与化学战剂进行快速而准确的检测。然而,采用生物芯片技术却可以较容易地完成这一艰巨任务。我们可以采用基因芯片技术检测细菌及其毒素、真菌毒素、病毒、支原体、依原体、立克次氏体等生物战剂;利用免疫芯片或酶芯片检测各种蛋白毒素类生物战剂和侦
作繁琐。Bulyk等人[17]发明了一种方法,可以将单链DNA阵列转换成双链DNA阵列,并且可以对这些双链DNA进行修饰(如甲基化)。经研究证明这些双链DNA阵列可应用于大规模的核酸和蛋白质相互作用的研究,尤其是揭示基因组中特异的蛋白
传感器技术 第21卷 58
检化学战剂。据悉,目前外军都在积极研制用于生物战剂与化学战剂侦检的生物芯片。7 结束语
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综上所述,基因芯片作为生命科学研究的一种新的技术平台,日益受到人们的关注,并已经广泛的应用于生命科学研究的各个领域。随着这一技术的不断完善,它将使科研人员从繁重的常规操作中解脱出来,可以预见在不久的将来它成为实验室中不可缺少的技术平台。参考文献:
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作者简介:
杨明星(1975-),男,河北承德人,硕士生,目前从事生物芯片技术及其在卫生监测中的应用研究。
(上接第53页)
有机地与PSP校准系统结合在一起,充分发挥Lab2VIEW的优势,使PSP校准系统达到了全面自动
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四川绵阳:国防科学技术预先研究空气动力学项目管理办公室,2001.
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化。人机界面友好、直观,操作简单、快捷,大大提高了该系统的运行效率;保证了系统测试参数的准确度;为在风洞中的光学压敏涂料测压试验奠定了坚实可靠的基础。参考文献:
作者简介:
肖亚克(1953-),男,山西原平人,工程师。从事自动化测量、控制工作。