生物化学实验报告
费 林 试 剂 热 滴 定 定 糖 法
一、实验目的
1. 学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2. 了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。
3. 熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4. 学习细胞生死状态鉴别的方法。 5. 了解细胞生死状态鉴别的原理。
6. 熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7. 掌握细胞技术方法，计算细胞存活率
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基(如：葡萄糖) 或酮基(如：果糖) 的单糖和某些二糖(如：乳糖、麦芽糖) 。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(Cu2+、Hg 2+、Ag +等) 还原，而糖本身被氧化成各种羟酸类化合物。该特性常用于糖的定性和定量测定。 实验采用费林试剂热滴定法，费林试剂是氧化剂，由甲、乙两种溶液组成。甲液含质量分数为0.05 g/mL的硫酸铜和次甲基蓝(氧化还原指示剂) ；乙液含质量分数为0.1 g/mL的氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。当甲、乙两溶液混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应生成天蓝色的氢氧化铜沉淀。在碱性溶液中，酒石酸钾钠与沉淀的氢氧化铜作用形成可溶性的络合物，该含Cu2+络合物的溶液，被还原后得到砖红色Cu2O 的沉淀。因此，斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在与否。
费林试剂热滴定定糖法的基本原理, 是在沸热条件下, 用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时, 将费林试剂中的铜离子还原为氧化亚铜, 以亚甲基蓝为指示剂, 稍过量的还原糖立即将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝, 指示滴定终点。
三、实验器材
1. 试剂
1.1费林试剂(定量) ：
费林甲液：称取15克硫酸铜(CuSO4·5H 2O) 和0.05克次甲基蓝，溶于1000毫升水中。
费林乙液：称取50克酒石酸钾钠、54克氢氧化钠和4克亚铁氰化钾溶于1000毫升水中。
1.2 标准葡萄糖溶液：称取葡萄糖(预先在105℃烘干，恒重)1克，用少量蒸馏水溶解后加入8毫升浓盐酸(防止微生物生长) ，再用蒸馏水定容至1000毫升。 1.3 6N盐酸溶液。 1.4 10%氢氧化钠溶液。
1.5碘试剂：将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前需稀释10倍。 1.6 PH1~14试纸。 2. 器材
(1) 25毫升碱滴定管。 (6) 万能夹 (2) 移液管(5、10毫升) (7) 铁架台 (3) 100毫升溶量瓶 (8) 点滴板 (4) 100毫升锥形瓶 (9) 水浴锅 (5) 滴管 (10) 600瓦电炉
五、操作步骤
1. 空白测定
准确吸取费林甲、乙液各5毫升和蒸馏水5毫升放入250毫升的锥形瓶中，再用滴定管加入一定量的标准葡萄糖液，混匀后放在石棉网上加热，应使瓶内溶液在2分钟内达到沸腾，以每滴4-5秒的速度由滴定管滴入标准葡萄糖液直至蓝色消失为止。沸腾前加入的标准葡萄糖液量与沸腾后滴定时所用的标准葡萄糖液量的总和，就是测定空白时耗用的标准葡萄糖液毫升数(V1) 。
全部滴定过程必须在沸腾状态下快速进行，一般应在3分钟内完成。因此，除控制滴定速度外，滴定前需加入一部分标准葡萄糖液。加入该液的数量，应在正式滴定前的预备滴定试验时确定，同时练习掌握操作条件 2. 总糖的测定
准确称取面粉1克，加入6N 盐酸10毫升，蒸馏水15毫升，混匀。沸水浴加热半小时后，取出几滴水解液用碘化钾-碘溶液检查水解是否完全，若已经水解完全，则不呈现蓝色。冷却后用10%氢氧化钠中和至中性溶液，过滤，滤液定容至100毫升。准确吸取该溶液10毫升，移入100毫升容量瓶内并定容至刻度，即为测定总糖的样品液。
准确吸取样品液5毫升放于100毫升锥形瓶内，加入费林甲液、乙液各5
毫升，混匀，然后按测定空白同样操作进行滴定，记下耗用标准葡萄糖的毫升数。 3. 计算
(V1-V 2) × 标准葡萄糖液浓度(克/毫升) ×稀释倍数
还原糖(或总糖)%= ×100 称取的样品量(克) ×5
式中：V 1为测定空白时耗用标准葡萄糖液毫升数。 V 2为测定总糖时耗用的标准葡萄糖的毫升数。
六、注意事项
1. 费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 2. 滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。 3. 滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。
七、实验结果
面粉样品质量：1.0123g
(V1-V 2) × 标准葡萄糖液浓度(克/毫升) ×稀释倍数
还原糖(或总糖)%= ×100 称取的样品量(克) ×5
=64.84%
八、分析与讨论
1. 无论做什么实验，如果用到电炉加热，一定要在电炉下面垫上大理石板，以免温度过高损坏实验桌面。
2. 滴定时要注意滴定终点，在滴定过程中，应注意在颜色由蓝色变为紫色时，应减慢滴速，当颜色变为土黄色时，立即停止加入葡萄糖，颜色会再度变回紫色时，不应再滴加葡萄糖。在本次实验中，我组滴定终点起初把握不准确，结果有几次滴定误差较大：
空白滴定消耗葡萄糖量（单位毫升）：10.40 10.42 10.36 10.38
样品滴定消耗葡萄糖量（单位毫升）：7.425 7.750 7.200 7.125 7.100
7.128
3. 在样品测定中，有几次滴定，消耗葡萄糖量逐渐递减，分析原因可能如下： 3.1 滴定终点观察不准确；
3.2 使用移液管滴加费林试剂时，由于管尖端碰壁，再次使用时导致样液被稀释； 4. 在实验初始溶解淀粉时，要求使用200mL 锥形瓶，但是我们只有300mL 和100mL 的锥形瓶，因此我们使用了100mL 锥形瓶，希望藉此增大接触面积，加快水解速度，结果在水浴加热过程中因该锥形瓶太小，结果导致倾斜，水进入瓶内，因此又重新选用了300mL 锥形瓶。之所以出现此次失误，是因为实验预习不够充分，不熟悉实验仪器，没有考虑到锥形瓶和水浴锅的大小。
5. 此次实验我组测得葡萄糖含量为64.84%，测得含量偏低。经过查阅资料，每 100g 面粉中含：
蛋白质12.0克 脂肪0.8克 碳水化合物70克 热量339千卡 无机盐类1.5克 磷180毫克 钙22毫克 铁7.6毫克
而面粉中淀粉水解后测定还原糖含量，可达88.3% 分析含量偏低原因可能如下：
1. 在称取面粉时候，滤纸上有少许淀粉未倒干净，或者电子天平称量不准确造成的质量上的误差。
2. 使用移液管滴加费林试剂时，由于管尖端碰壁，再次使用时导致样液被稀释。 3. 在实验操作过程中，为节约时间，我们曾现将费林甲液、乙液混合并暂时放置在空气中，斐林试剂甲和斐林试剂乙混合后会因酒石酸有一定的还原性而自发地缓慢产生氧化亚铜沉淀，使其有效试剂浓度降低。
生物化学实验报告
费 林 试 剂 热 滴 定 定 糖 法
一、实验目的
1. 学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2. 了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。
3. 熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4. 学习细胞生死状态鉴别的方法。 5. 了解细胞生死状态鉴别的原理。
6. 熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7. 掌握细胞技术方法，计算细胞存活率
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基(如：葡萄糖) 或酮基(如：果糖) 的单糖和某些二糖(如：乳糖、麦芽糖) 。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(Cu2+、Hg 2+、Ag +等) 还原，而糖本身被氧化成各种羟酸类化合物。该特性常用于糖的定性和定量测定。 实验采用费林试剂热滴定法，费林试剂是氧化剂，由甲、乙两种溶液组成。甲液含质量分数为0.05 g/mL的硫酸铜和次甲基蓝(氧化还原指示剂) ；乙液含质量分数为0.1 g/mL的氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。当甲、乙两溶液混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应生成天蓝色的氢氧化铜沉淀。在碱性溶液中，酒石酸钾钠与沉淀的氢氧化铜作用形成可溶性的络合物，该含Cu2+络合物的溶液，被还原后得到砖红色Cu2O 的沉淀。因此，斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在与否。
费林试剂热滴定定糖法的基本原理, 是在沸热条件下, 用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时, 将费林试剂中的铜离子还原为氧化亚铜, 以亚甲基蓝为指示剂, 稍过量的还原糖立即将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝, 指示滴定终点。
三、实验器材
1. 试剂
1.1费林试剂(定量) ：
费林甲液：称取15克硫酸铜(CuSO4·5H 2O) 和0.05克次甲基蓝，溶于1000毫升水中。
费林乙液：称取50克酒石酸钾钠、54克氢氧化钠和4克亚铁氰化钾溶于1000毫升水中。
1.2 标准葡萄糖溶液：称取葡萄糖(预先在105℃烘干，恒重)1克，用少量蒸馏水溶解后加入8毫升浓盐酸(防止微生物生长) ，再用蒸馏水定容至1000毫升。 1.3 6N盐酸溶液。 1.4 10%氢氧化钠溶液。
1.5碘试剂：将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前需稀释10倍。 1.6 PH1~14试纸。 2. 器材
(1) 25毫升碱滴定管。 (6) 万能夹 (2) 移液管(5、10毫升) (7) 铁架台 (3) 100毫升溶量瓶 (8) 点滴板 (4) 100毫升锥形瓶 (9) 水浴锅 (5) 滴管 (10) 600瓦电炉
五、操作步骤
1. 空白测定
准确吸取费林甲、乙液各5毫升和蒸馏水5毫升放入250毫升的锥形瓶中，再用滴定管加入一定量的标准葡萄糖液，混匀后放在石棉网上加热，应使瓶内溶液在2分钟内达到沸腾，以每滴4-5秒的速度由滴定管滴入标准葡萄糖液直至蓝色消失为止。沸腾前加入的标准葡萄糖液量与沸腾后滴定时所用的标准葡萄糖液量的总和，就是测定空白时耗用的标准葡萄糖液毫升数(V1) 。
全部滴定过程必须在沸腾状态下快速进行，一般应在3分钟内完成。因此，除控制滴定速度外，滴定前需加入一部分标准葡萄糖液。加入该液的数量，应在正式滴定前的预备滴定试验时确定，同时练习掌握操作条件 2. 总糖的测定
准确称取面粉1克，加入6N 盐酸10毫升，蒸馏水15毫升，混匀。沸水浴加热半小时后，取出几滴水解液用碘化钾-碘溶液检查水解是否完全，若已经水解完全，则不呈现蓝色。冷却后用10%氢氧化钠中和至中性溶液，过滤，滤液定容至100毫升。准确吸取该溶液10毫升，移入100毫升容量瓶内并定容至刻度，即为测定总糖的样品液。
准确吸取样品液5毫升放于100毫升锥形瓶内，加入费林甲液、乙液各5
毫升，混匀，然后按测定空白同样操作进行滴定，记下耗用标准葡萄糖的毫升数。 3. 计算
(V1-V 2) × 标准葡萄糖液浓度(克/毫升) ×稀释倍数
还原糖(或总糖)%= ×100 称取的样品量(克) ×5
式中：V 1为测定空白时耗用标准葡萄糖液毫升数。 V 2为测定总糖时耗用的标准葡萄糖的毫升数。
六、注意事项
1. 费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 2. 滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。 3. 滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。
七、实验结果
面粉样品质量：1.0123g
(V1-V 2) × 标准葡萄糖液浓度(克/毫升) ×稀释倍数
还原糖(或总糖)%= ×100 称取的样品量(克) ×5
=64.84%
八、分析与讨论
1. 无论做什么实验，如果用到电炉加热，一定要在电炉下面垫上大理石板，以免温度过高损坏实验桌面。
2. 滴定时要注意滴定终点，在滴定过程中，应注意在颜色由蓝色变为紫色时，应减慢滴速，当颜色变为土黄色时，立即停止加入葡萄糖，颜色会再度变回紫色时，不应再滴加葡萄糖。在本次实验中，我组滴定终点起初把握不准确，结果有几次滴定误差较大：
空白滴定消耗葡萄糖量（单位毫升）：10.40 10.42 10.36 10.38
样品滴定消耗葡萄糖量（单位毫升）：7.425 7.750 7.200 7.125 7.100
7.128
3. 在样品测定中，有几次滴定，消耗葡萄糖量逐渐递减，分析原因可能如下： 3.1 滴定终点观察不准确；
3.2 使用移液管滴加费林试剂时，由于管尖端碰壁，再次使用时导致样液被稀释； 4. 在实验初始溶解淀粉时，要求使用200mL 锥形瓶，但是我们只有300mL 和100mL 的锥形瓶，因此我们使用了100mL 锥形瓶，希望藉此增大接触面积，加快水解速度，结果在水浴加热过程中因该锥形瓶太小，结果导致倾斜，水进入瓶内，因此又重新选用了300mL 锥形瓶。之所以出现此次失误，是因为实验预习不够充分，不熟悉实验仪器，没有考虑到锥形瓶和水浴锅的大小。
5. 此次实验我组测得葡萄糖含量为64.84%，测得含量偏低。经过查阅资料，每 100g 面粉中含：
蛋白质12.0克 脂肪0.8克 碳水化合物70克 热量339千卡 无机盐类1.5克 磷180毫克 钙22毫克 铁7.6毫克
而面粉中淀粉水解后测定还原糖含量，可达88.3% 分析含量偏低原因可能如下：
1. 在称取面粉时候，滤纸上有少许淀粉未倒干净，或者电子天平称量不准确造成的质量上的误差。
2. 使用移液管滴加费林试剂时，由于管尖端碰壁，再次使用时导致样液被稀释。 3. 在实验操作过程中，为节约时间，我们曾现将费林甲液、乙液混合并暂时放置在空气中，斐林试剂甲和斐林试剂乙混合后会因酒石酸有一定的还原性而自发地缓慢产生氧化亚铜沉淀，使其有效试剂浓度降低。