休止细胞的制备与MTT 法测定脱氢酶活性
2008级生命基地 秦玉洁 学号:[1**********]9 2008级生命基地 施成瑞 学号:[**************]8级生命基地 钱骋 学号:200800140
指导老师 张怀强
（山东大学微生物技术国家重点实验室）
摘要 休止细胞中基本不含内源营养物质，可以很好地用来研究微生物新陈代谢过程及生理生化性质等。MTT 比色法灵敏度高，被广泛用来研究细胞的生物活性。本实验即利用休止细胞，通过MTT 比色法进行酶催化的动力学分析来研究三羧酸循环中的各种脱氢酶活性随底物浓度的变化情况以及在循环体中的相对顺序。
关键词 休止细胞 MTT比色法 三羧酸循环 底物浓度 酶催化的动力学分析
1. 实验背景
酶。故而研究出脱氢酶活性随底物浓度的变化规律以及各种酶催化的相对顺序具有了很大的价值。
2. 实验原理
2.1休止细胞
休止细胞又称静息细胞，把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽
图1 三羧酸循环
（1）
然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强, 可以提高底物转化率, 不易染杂菌, 可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。
三羧酸循环指通过生成的乙酰辅酶A 与草酰乙酸缩合生成柠檬酸(三羧酸) 开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH 及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环的过程。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽，在微生物生理代谢过程中具有重要意义。其中，三羧酸循环的调控决定于各个步骤中脱氢
2.2 MTT 分析法
MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂, MTT噻唑蓝为基础。MTT 即4氮唑化合物，为黄色染料，能接受
被细胞内线粒体脱氢酶活化的氢原子，并被还原成
甲臜沉积在细胞中。后者能被二甲基亚砜（DMSO ）等有机物溶解，故可在560nm 波长下进行检测其OD 值以检测单位时间内脱氢酶活化氢的能力，即酶活。
2.3三羧酸循环中的脱氢作用
在三羧酸循环中，涉及两次脱羧以及四次脱氢过程。，第一次发生在异柠檬酸脱氢酶将异柠檬酸脱氢脱羧氧化为α—酮戊二酸，第二次发生在α—酮戊二酸脱氢酶氧化α—酮戊二酸时，第三次发生在琥珀酸脱氢生成延胡索酸，第四步发生在苹果酸脱氢生成草酰乙酸。在本实验中，由于休止细胞的内源物质几乎消耗完全，故循环终止于草酰乙酸，因而在循环的相对靠前的位置发生的脱氢过程相对更多，产生的还原氢的量相对较多。
2.4 异柠檬酸的别构调节效应
异柠檬酸在三羧酸循环中是异柠檬酸脱氢酶的底物，本实验中，当浓度较低时，随着底物浓度的增加，产生的还原氢的量相对增加，表现出OD 值的相对增加。
然而我们知道，在糖酵解过程中，柠檬酸是PFK-1（磷酸果糖激酶—1）的一个重要的抑制剂，因为柠檬酸循环与丙酮酸的进一步氧化联系在一起的，柠檬酸水平的升高表明有充足底物进入了柠檬酸循环，所以柠檬酸对PFK-1的调节是一种反馈抑制，它调节丙酮酸向柠檬酸循环的供给。所以，在高浓度柠檬酸时，脱氢的量受到抑制，表现为OD 值下降。因此，异柠檬酸的动力学曲线应该为高斯曲线。
2.5 关于以OD 值—S 曲线代替反应速率V —S 曲线
在反应速率V —S 图中，V 测量值应该为反应起始时的速率，然而这个速率相对比较难以测量，本实验采用两个小时内反应的OD 值变化，即用平均速率来代替反应起始速率，从结果来看，影响并不是太大，说明三羧酸循环中这些酶相对来说都是些高效
酶，其酶活性在生理状态下能维持相当长的一段时间而保持不变。
３．材料与方法
3.1供试菌株
大肠杆菌E.coli CVCC249，由山东大学国家重点微生物实验室提供。
3.2实验试剂
甲醛，ＰＨ７．０ ＰＢＳ溶液，ＭＴＴ试剂，二甲基亚砜
3.3 试验方法
3.3.1 休止细胞的制备 (1)
菌株的活化
用接种环将实验所需的E. coli CVCC 249接种到已灭菌的固体斜面培养基上，37 ℃恒温箱培养18—24 h。 (2)
菌株的获得
用接种环在斜面培养基上刮取适量菌转接至液体三角瓶中，恒温振荡培养箱37 ℃振荡培养至OD > 1.（大约1.4左右）。 (3)
细菌的收集
将培养好的细胞菌液放入离心管中，4500 rpm 离心收集细胞，弃去上清培养液，用生理盐水洗涤，洗去培养液，之后4500 rpm离心收集细胞，重复洗涤三次至上清液透明，弃去上清液。 (4)
菌悬液的制备
将离心后的细胞用pH 为7.0 的磷酸缓冲液定量至25 mL，吹悬混匀，为以后实验使用。 (5)
休止细胞的制备
菌悬液放置在4 ℃条件下放置72 h 后，在37 ℃培养4—8 h，休止细胞制备完成，放在4 ℃冰箱中备用。
3.3.2 脱氢酶活性的测定 (1) 在5 mL的离心管中加入1 mL反应底物，并根据底物设置不同的浓度（同一浓度不同底物对细胞脱氢酶活性影响，如表1所示。不同稀释度的各种底物对细菌脱氢酶降活性影响，我们做了三种底物的实验，分别是乙酸钠，琥珀酸钠和柠檬酸钠，如表2，表3和表4所示）。
(2) 加入制备的休止细胞0.4 mL，用等体积的5%甲醛处理30 min灭活的细胞悬液作为对照。在加入细胞之前一定注意将休止细胞摇匀后再加。 (3) 加入MTT 40 μL ，震荡摇匀，此时的溶液应呈黄色，恒温培养箱中37 ℃避光保温2 h。 (4) 加入二甲基亚砜1.3 mL，震荡混匀后，37 ℃保温30min ，此时溶液呈深蓝紫色。
(5) 加入PBS （pH 7.0）1.5 mL，振荡混匀。 (6) 722分光光度计测510 nm的OD ，每个样品浓度至少要进行三次实验，变异系数(coefficient of variation ，CV) 小于5%。
４．结果
4.1 在0.1M/L浓度以不同底物实验，分别测量OD 值，得到的结果如下：
表1 相同浓度不同底物
图2 相同浓度不同底物的OD 值
4.2 以乙酸钠为底物，设置了0，2,2.5,5,10,20*10-3M/L 6个浓度实验，分别检测OD
值，得到的数据如下：
图3 不同浓度时乙酸钠的OD 值浓度曲线 （横坐标为浓度，单位M/L，纵坐标OD 值）
表2 不同浓度乙酸钠底物
4.3 以琥珀酸钠为底物，设置了0，2,2.5,5,10,20*10-3M/L 6个浓度实验，分别检测OD 值，得到的数据如下：
表4 不同浓度琥珀酸钠做底物
图4 不同浓度琥珀酸钠做底物 （横坐标浓度值，单位M/L，纵坐标OD 值）
4.4 以柠檬酸钠为底物，设置了
2.5,4,5,10,20,25,50,100*10-39个浓度梯度实验，测量OD 值，得到的结果如下：
表5 不同浓度柠檬酸钠做底物
图5 不同浓度柠檬酸钠曲线
（横坐标浓度值，单位M/L，纵坐标OD 值）
5.1 观察图2，由于本实验中，由于在α—酮戊二酸的测定中，α酮戊二酸脱氢酶是一个复合酶，酶活性相对较高，2个小时的反应时间相对过长，故生成并溶解于二甲亚砜中的甲臜发生了变化，导致OD 值发生了比较显著的误差。因此并没有产生预期的OD 值大
小顺序：α酮戊二酸>柠檬酸钠>琥珀酸钠>乙酸钠，希望老师能适当的调整时间，从而使实验相对误差减小。
5.2分析图3，可以看出用双曲线可以很好的拟合乙酸钠反应中的反应速率变化，R-S 系数达到97%以上。说明该酶的动力学曲线过
程符合米氏方程曲线，大约在OD 值0.65时，反应速率达到了最大反应速率的一半。 5.3 分析图4，琥珀酸脱氢酶也很好的符合米氏方程曲线，R-S 系数达到97%。在OD 值
0.28左右，反应速率达到了最大反应速率的一半。
5.4 分析图5，对于柠檬酸脱氢酶来说，由于其R-S 系数相对较低，故未能很好的反映出其高斯曲线性质，图中的峰值出现在浓度为0.04M/L附近，之后表现出相对较强的抑
５．分析讨论
制效应。可能说明，在本次实验中，维持休止细胞的代谢水平相对较低，较低水平的循环既可满足细胞能量需求，故抑制作用起着主导的作用。
5.5 从上述各组的标准误差SE 来看，相对来说是比较大的，尤其对柠檬酸钠来说，低浓度的数值，误差更为明显。所以，提高仪器的精确度，尤其是722分光光度计的灵敏度以及准确性，对改进实验都是很好的措施。 5.6 由于噻唑盐的性质，需避光保存，然而在实验过程中，人多嘈杂，难以确保MTT 的纯度，因此改善实验室环境，或者将MTT 存放于公共避光实验室对于提高实验准确性很有必要。
5.7 在实验过程中，作为空白的组，由于实验室条件限制，未能用甲醛处理，直接采用未加底物的休止细胞作为对照，这对于实验的初值的测定，即浓度为0时的OD 值也有一定的影响。
6 实验心得体会
由于本次实验作为开放式实验，稍微不同于以前的实验模式，故有些许的体会和感触。 作为开放式实验，我们对自己的要求也相对有所提高，实验课前的做好预习，将有关实验原理，方法步骤牢记于心方可顺利地进行实验。此外，由于使我们相对自主的进行整个实验过程，故我们对整实验的流程，以及实验中遇到的问题印象深刻，这更促使我们细心操作，耐心完成实验，并且，我们会和老师有较多的交流，能很大的提高我们的解决问题的能力，这些对于我们后续的创新性实验，以及今后的科研工作都有不可替代
的作用。
另外，在实验过程中，同学们相互配合，相互交流，相互探讨，相互帮助，共同商量解决问题，这培养了我们协作合作，细化分工的能力。 当然，在实验过程中，也有一些问题，值得思考。比如在试剂短缺时，我们应该意识到，光等是解决不了问题的，应该主动联系老师或者师姐。 总之，本人觉得，在这样积极主动全面的21现代化知识世纪里，对于我们本科3年级学生来说，积极倡导这种开放式的实验模式，其利处是远远大于弊端的。
参考
文献
（1）．维基百科-三羧酸循环
http://zh.wikipedia.org/wiki/File:Citric_acid_cycle_with_aconitate_2_zh-hans.svg
（2）《生物化学 下》 王镜岩 三羧酸循环 （3）百度百科—休止细胞
http://baike.baidu.com/view/2574737.htm
（4）《MBR 中污泥脱氢酶活性测定方法的改进》周恢 左永生 赵怀颖
李明兴 北京科技大学土木与环境学院
(5) 钱存柔, 黄仪秀 微生物学实验教程[M ] 北京: 北京大学出版社, 2008: 153-156.
休止细胞的制备与MTT 法测定脱氢酶活性
2008级生命基地 秦玉洁 学号:[1**********]9 2008级生命基地 施成瑞 学号:[**************]8级生命基地 钱骋 学号:200800140
指导老师 张怀强
（山东大学微生物技术国家重点实验室）
摘要 休止细胞中基本不含内源营养物质，可以很好地用来研究微生物新陈代谢过程及生理生化性质等。MTT 比色法灵敏度高，被广泛用来研究细胞的生物活性。本实验即利用休止细胞，通过MTT 比色法进行酶催化的动力学分析来研究三羧酸循环中的各种脱氢酶活性随底物浓度的变化情况以及在循环体中的相对顺序。
关键词 休止细胞 MTT比色法 三羧酸循环 底物浓度 酶催化的动力学分析
1. 实验背景
酶。故而研究出脱氢酶活性随底物浓度的变化规律以及各种酶催化的相对顺序具有了很大的价值。
2. 实验原理
2.1休止细胞
休止细胞又称静息细胞，把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽
图1 三羧酸循环
（1）
然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强, 可以提高底物转化率, 不易染杂菌, 可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。
三羧酸循环指通过生成的乙酰辅酶A 与草酰乙酸缩合生成柠檬酸(三羧酸) 开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH 及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环的过程。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽，在微生物生理代谢过程中具有重要意义。其中，三羧酸循环的调控决定于各个步骤中脱氢
2.2 MTT 分析法
MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂, MTT噻唑蓝为基础。MTT 即4氮唑化合物，为黄色染料，能接受
被细胞内线粒体脱氢酶活化的氢原子，并被还原成
甲臜沉积在细胞中。后者能被二甲基亚砜（DMSO ）等有机物溶解，故可在560nm 波长下进行检测其OD 值以检测单位时间内脱氢酶活化氢的能力，即酶活。
2.3三羧酸循环中的脱氢作用
在三羧酸循环中，涉及两次脱羧以及四次脱氢过程。，第一次发生在异柠檬酸脱氢酶将异柠檬酸脱氢脱羧氧化为α—酮戊二酸，第二次发生在α—酮戊二酸脱氢酶氧化α—酮戊二酸时，第三次发生在琥珀酸脱氢生成延胡索酸，第四步发生在苹果酸脱氢生成草酰乙酸。在本实验中，由于休止细胞的内源物质几乎消耗完全，故循环终止于草酰乙酸，因而在循环的相对靠前的位置发生的脱氢过程相对更多，产生的还原氢的量相对较多。
2.4 异柠檬酸的别构调节效应
异柠檬酸在三羧酸循环中是异柠檬酸脱氢酶的底物，本实验中，当浓度较低时，随着底物浓度的增加，产生的还原氢的量相对增加，表现出OD 值的相对增加。
然而我们知道，在糖酵解过程中，柠檬酸是PFK-1（磷酸果糖激酶—1）的一个重要的抑制剂，因为柠檬酸循环与丙酮酸的进一步氧化联系在一起的，柠檬酸水平的升高表明有充足底物进入了柠檬酸循环，所以柠檬酸对PFK-1的调节是一种反馈抑制，它调节丙酮酸向柠檬酸循环的供给。所以，在高浓度柠檬酸时，脱氢的量受到抑制，表现为OD 值下降。因此，异柠檬酸的动力学曲线应该为高斯曲线。
2.5 关于以OD 值—S 曲线代替反应速率V —S 曲线
在反应速率V —S 图中，V 测量值应该为反应起始时的速率，然而这个速率相对比较难以测量，本实验采用两个小时内反应的OD 值变化，即用平均速率来代替反应起始速率，从结果来看，影响并不是太大，说明三羧酸循环中这些酶相对来说都是些高效
酶，其酶活性在生理状态下能维持相当长的一段时间而保持不变。
３．材料与方法
3.1供试菌株
大肠杆菌E.coli CVCC249，由山东大学国家重点微生物实验室提供。
3.2实验试剂
甲醛，ＰＨ７．０ ＰＢＳ溶液，ＭＴＴ试剂，二甲基亚砜
3.3 试验方法
3.3.1 休止细胞的制备 (1)
菌株的活化
用接种环将实验所需的E. coli CVCC 249接种到已灭菌的固体斜面培养基上，37 ℃恒温箱培养18—24 h。 (2)
菌株的获得
用接种环在斜面培养基上刮取适量菌转接至液体三角瓶中，恒温振荡培养箱37 ℃振荡培养至OD > 1.（大约1.4左右）。 (3)
细菌的收集
将培养好的细胞菌液放入离心管中，4500 rpm 离心收集细胞，弃去上清培养液，用生理盐水洗涤，洗去培养液，之后4500 rpm离心收集细胞，重复洗涤三次至上清液透明，弃去上清液。 (4)
菌悬液的制备
将离心后的细胞用pH 为7.0 的磷酸缓冲液定量至25 mL，吹悬混匀，为以后实验使用。 (5)
休止细胞的制备
菌悬液放置在4 ℃条件下放置72 h 后，在37 ℃培养4—8 h，休止细胞制备完成，放在4 ℃冰箱中备用。
3.3.2 脱氢酶活性的测定 (1) 在5 mL的离心管中加入1 mL反应底物，并根据底物设置不同的浓度（同一浓度不同底物对细胞脱氢酶活性影响，如表1所示。不同稀释度的各种底物对细菌脱氢酶降活性影响，我们做了三种底物的实验，分别是乙酸钠，琥珀酸钠和柠檬酸钠，如表2，表3和表4所示）。
(2) 加入制备的休止细胞0.4 mL，用等体积的5%甲醛处理30 min灭活的细胞悬液作为对照。在加入细胞之前一定注意将休止细胞摇匀后再加。 (3) 加入MTT 40 μL ，震荡摇匀，此时的溶液应呈黄色，恒温培养箱中37 ℃避光保温2 h。 (4) 加入二甲基亚砜1.3 mL，震荡混匀后，37 ℃保温30min ，此时溶液呈深蓝紫色。
(5) 加入PBS （pH 7.0）1.5 mL，振荡混匀。 (6) 722分光光度计测510 nm的OD ，每个样品浓度至少要进行三次实验，变异系数(coefficient of variation ，CV) 小于5%。
４．结果
4.1 在0.1M/L浓度以不同底物实验，分别测量OD 值，得到的结果如下：
表1 相同浓度不同底物
图2 相同浓度不同底物的OD 值
4.2 以乙酸钠为底物，设置了0，2,2.5,5,10,20*10-3M/L 6个浓度实验，分别检测OD
值，得到的数据如下：
图3 不同浓度时乙酸钠的OD 值浓度曲线 （横坐标为浓度，单位M/L，纵坐标OD 值）
表2 不同浓度乙酸钠底物
4.3 以琥珀酸钠为底物，设置了0，2,2.5,5,10,20*10-3M/L 6个浓度实验，分别检测OD 值，得到的数据如下：
表4 不同浓度琥珀酸钠做底物
图4 不同浓度琥珀酸钠做底物 （横坐标浓度值，单位M/L，纵坐标OD 值）
4.4 以柠檬酸钠为底物，设置了
2.5,4,5,10,20,25,50,100*10-39个浓度梯度实验，测量OD 值，得到的结果如下：
表5 不同浓度柠檬酸钠做底物
图5 不同浓度柠檬酸钠曲线
（横坐标浓度值，单位M/L，纵坐标OD 值）
5.1 观察图2，由于本实验中，由于在α—酮戊二酸的测定中，α酮戊二酸脱氢酶是一个复合酶，酶活性相对较高，2个小时的反应时间相对过长，故生成并溶解于二甲亚砜中的甲臜发生了变化，导致OD 值发生了比较显著的误差。因此并没有产生预期的OD 值大
小顺序：α酮戊二酸>柠檬酸钠>琥珀酸钠>乙酸钠，希望老师能适当的调整时间，从而使实验相对误差减小。
5.2分析图3，可以看出用双曲线可以很好的拟合乙酸钠反应中的反应速率变化，R-S 系数达到97%以上。说明该酶的动力学曲线过
程符合米氏方程曲线，大约在OD 值0.65时，反应速率达到了最大反应速率的一半。 5.3 分析图4，琥珀酸脱氢酶也很好的符合米氏方程曲线，R-S 系数达到97%。在OD 值
0.28左右，反应速率达到了最大反应速率的一半。
5.4 分析图5，对于柠檬酸脱氢酶来说，由于其R-S 系数相对较低，故未能很好的反映出其高斯曲线性质，图中的峰值出现在浓度为0.04M/L附近，之后表现出相对较强的抑
５．分析讨论
制效应。可能说明，在本次实验中，维持休止细胞的代谢水平相对较低，较低水平的循环既可满足细胞能量需求，故抑制作用起着主导的作用。
5.5 从上述各组的标准误差SE 来看，相对来说是比较大的，尤其对柠檬酸钠来说，低浓度的数值，误差更为明显。所以，提高仪器的精确度，尤其是722分光光度计的灵敏度以及准确性，对改进实验都是很好的措施。 5.6 由于噻唑盐的性质，需避光保存，然而在实验过程中，人多嘈杂，难以确保MTT 的纯度，因此改善实验室环境，或者将MTT 存放于公共避光实验室对于提高实验准确性很有必要。
5.7 在实验过程中，作为空白的组，由于实验室条件限制，未能用甲醛处理，直接采用未加底物的休止细胞作为对照，这对于实验的初值的测定，即浓度为0时的OD 值也有一定的影响。
6 实验心得体会
由于本次实验作为开放式实验，稍微不同于以前的实验模式，故有些许的体会和感触。 作为开放式实验，我们对自己的要求也相对有所提高，实验课前的做好预习，将有关实验原理，方法步骤牢记于心方可顺利地进行实验。此外，由于使我们相对自主的进行整个实验过程，故我们对整实验的流程，以及实验中遇到的问题印象深刻，这更促使我们细心操作，耐心完成实验，并且，我们会和老师有较多的交流，能很大的提高我们的解决问题的能力，这些对于我们后续的创新性实验，以及今后的科研工作都有不可替代
的作用。
另外，在实验过程中，同学们相互配合，相互交流，相互探讨，相互帮助，共同商量解决问题，这培养了我们协作合作，细化分工的能力。 当然，在实验过程中，也有一些问题，值得思考。比如在试剂短缺时，我们应该意识到，光等是解决不了问题的，应该主动联系老师或者师姐。 总之，本人觉得，在这样积极主动全面的21现代化知识世纪里，对于我们本科3年级学生来说，积极倡导这种开放式的实验模式，其利处是远远大于弊端的。
参考
文献
（1）．维基百科-三羧酸循环
http://zh.wikipedia.org/wiki/File:Citric_acid_cycle_with_aconitate_2_zh-hans.svg
（2）《生物化学 下》 王镜岩 三羧酸循环 （3）百度百科—休止细胞
http://baike.baidu.com/view/2574737.htm
（4）《MBR 中污泥脱氢酶活性测定方法的改进》周恢 左永生 赵怀颖
李明兴 北京科技大学土木与环境学院
(5) 钱存柔, 黄仪秀 微生物学实验教程[M ] 北京: 北京大学出版社, 2008: 153-156.