miRNA差异表达分析时reads数目的校准(TPM)问题

校准表达量测序差异表达序列文库转录

标题: miRNA差异表达分析时reads数目的校准（TPM）问题

摘要: [miRNA差异表达分析时reads数目的校准（TPM）问题] 在做miRNA的差异表达分析时，很多文章里都要使用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×10^6 总reads数）来校准miRNA的表达量，这样做是为了去除pcr扩增文库时的偏倚吗？然后，如果使用TPM进行校准，那也会产生另外的差异啊我觉得，关键词:[校准表达量测序差异表达序列文库转录]……

关键词:校准表达量测序差异表达序列文库转录

在做miRNA的差异表达分析时，很多文章里都要使用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×10^6/总reads数）来校准miRNA的表达量，这样做是为了去除pcr扩增文库时的偏倚吗？

然后，如果使用TPM进行校准，那也会产生另外的差异啊我觉得，举个极端的例子：样品A中实际总共表达了10个reads，其中miR1表达了2个；样品B总共表达了100个reads，其中miR1表达了20个，——实际上在两个样品中miR1是显著差异表达的，但经TPM校准后，两个样品中其表达量就都成了20 000，就一样了么，那么校准岂不是产生了原来没有的错误？？

我觉得miRNA是短序列，不存在转录组中序列片段长短的问题，那么直接使用reads的count作为其相应miRNA的表达量岂不是更好？

欢迎讨论！

使用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×10^6/总reads数）来校准miRNA的表达量

这其实是个normalization的过程，因为假如你有多个样品（》=2），测序得到的total mapping reads的数目是不一样的，大家必须normalize到同一个水平才方便比较。样品A中实际总共表达了10个reads，其中miR1表达了2个；样品B总共表达了100个reads，其中miR1表达了20个

你说的实际应该是指细胞内真正表达的数量吧，但是实际上通过测序你是拿不到真正意义上的绝对表达量，只是一个相对的表达量。我们在进行2个或者多个样品genes或者miRNA表达差异分析比较的时候，是默认总体RNA表达的一样多的。简单来说就是你例子中sample A和B的RNA总量是一致的，不过A测序测到了10个reads，B测序测的比较多，拿到了100个reads，如果A也达到B的测序深度，其实miR1也就是20个reads，表达量是一致的。

不知道你明白否

哦，明白了，“拿去上机测序的样品总量是一样的”，所以后边才把测得的总量校准到一样！

谢谢你的耐心讲解，终于解了心里纠结很久的困惑！:hand:

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