06-Bt杀虫晶体蛋白受体分子的结构与功能

昆虫学报Acta Entomologica Sinica , December 2006, 49(6) :1009-1016ISS N 045426296

Bt 杀虫晶体蛋白受体分子的结构与功能

王　莉

1,2

, 李学锋, 徐宝仁, 吴青君, 张友军

2111, 3

(11中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京　100081; 　21中国农业大学理学院, 北京　100094)

摘要:苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis , Bt ) 杀虫蛋白与昆虫中肠细胞膜上受体的结合是Bt 毒素作用的关键环节和决定Bt 杀虫蛋白选择性的关键因素。受体与Bt 杀虫蛋白结合能力的改变可能是昆虫对Bt 产生抗性的主要原因, 也因此成为近年来国际上的研究热点和焦点, 并取得了突破性的进展。该文就昆虫体内Bt 毒素的4种受体:氨肽酶N 、类钙粘蛋白、碱性磷酸酶以及最近报道的糖脂类受体的结构、功能、受体与毒素的结合特性、受体基因在离体细胞中的表达特性以及受体基因的突变与害虫对Bt 毒素的抗性等方面进行了综述。关键词:昆虫; Bt ; 受体; 结构; 功能

中图分类号:Q966　　文献标识码:A 　　文章编号:045422006) 1009208

Advances in research on of Bt (Bacillus

thuringiensis ) W 1,2

, X U U Qing-Jun , ZH ANG Y ou-Jun

111, 3

(11Institute of Vegetables

and of Agricultural Science , Beijing 100081, China ; 21C ollege of Science , China Agricultural , Beijing 100094, China )

Abstract :Bacillus thuringiensis (Bt ) receptor is very im portant to the toxicity expression of Bt in insects. Change in binding ability between this receptor and Bt insecticidal proteins may be the main mechanism of Bt resistance. In this paper , the types , structure , binding characteristics of the insect receptors , including aminopeptidase N , cadherin-like protein , alkaline phosphatase and glycolipids , the expression of genes of insect receptors in endogenous cells , and the relationships between Bt resistance and receptor are reviewed. K ey w ords :Insect ; Bacillus thuringiensis ; receptor ; structure ; function

　　苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt ) 是世

界上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂, 占微生物杀虫剂总量的95%以上; 同时Bt 基因也是大家最热衷使用的转植物抗虫基因。至2004年, 全世界种植的转Bt 基因农作物面积已达2240万公顷(Zhao et al . ,2005) , 在减少害虫危害, 增加作物产量, 减少化学农药对环境的污染等方面发挥了重要作用。但转Bt 基因农作物和Bt 制剂的使用正面临着致命的威胁, 即害虫对Bt 的抗药性。目前田间已出现了对Bt 高抗性的小菜蛾Plutella xylostella 和粉纹夜蛾Trichoplusia ni 种群, 而实验室及温室内对Bt 产生抗性的害虫至少有12种60个品系, 而且可能更多的抗性害虫会随之出现(G riffitts and Aroian ,2005) 。

目前多项研究已证实:Bt 毒素与昆虫中肠细胞膜上的毒素受体特异性结合, 随后插入质膜形成离子通道, 使细胞发生渗透裂解, 从而导致昆虫死亡。毒素受体缺乏或突变使昆虫中肠的刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles , BBMV ) 与杀虫蛋白(Cry ) 亲和性降低, 是昆虫产生抗性的主要原因(Daniel et al . ,2002) 。有关Bt 受体蛋白的分离鉴定、结合动力学、生化特性等, 梁革梅等(2003) 已有过相关的综述。而近3～4年来, 随着新的受体蛋白种类的发现,Bt 杀虫蛋白受体研究取得显著进展。已基本明确的Bt 受体主要有氨肽酶N (aminopeptidase N , APN ) 、类钙粘蛋白(cadherin-like protein ) 、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , Alp ) 和糖脂类(glycolipids ) 等。本文阐明了上述受体分子结构与功能研究的最新进展。

基金项目:国家自然科学基金项目(30471159,30270900) ; 国家重点基础研究发展计划“973”项目(2006C B102000) 作者简介:王莉, 女, 1978年生, 主要从事农药分子毒理学研究

3通讯作者Author for correspondence , E -mail :zhangyj @mail. caas. net. cn 收稿日期Received :2005-09-04; 接受日期Accepted :2006-05-20

1010昆虫学报Acta Entomologica Sinica 49卷

113　受体基因转染异源细胞系的表达

1　氨肽酶N (APN )

氨肽酶N 是多种昆虫中肠微绒毛膜上的主要

酶, 约占鳞翅目昆虫中肠总蛋白量的55%(Loseva et al . ,2002) , 也是细胞蛋白代谢过程中的生物酶。111　受体氨肽酶N 的种类及结构特征

至今, 已有近十种昆虫的APN 受体基因被克隆

且在异源细胞系中表达(表1) 。这些重组的APN 与BBMV 上纯化的蛋白分子量常常并不完全一致, 如

小菜蛾和苹浅褐卷蛾Epiphyas postvittana 的APN 在S f9细胞表达后产生130kD 的蛋白, 重组的蛋白分

子量稍有增大, 这可能与G PI 的清除及蛋白的糖基化等有关。

家蚕、烟草天蛾和斜纹夜蛾Spodoptera litura 的APN 在异源细胞表达后, 其蛋白固着于细胞表面, 并

氨肽酶N 在不同生物间具有一定的同源性, 如

烟草天蛾Manduca sexta 中肠刷状缘膜囊(BBMV ) 的一种分子量为120kD 的APN 与人、兔、大鼠和小鼠的APN 氨基酸序列的同源性分别达到31%、31%、31%和29%(K night et al . ,1995) 。在昆虫体内氨肽酶N 又以多种形式存在,Nakanishi 等(2002) 从家蚕Bombyx mori 和小菜蛾中肠克隆出了8个APN , 系统分析表明, 这8个APN 组, 为APN1、APN2、Helicoverpa 等昆虫4个不同的组群。

截止2006年1月, 在G enBank 中已注册的昆虫APN 基因有60余个, 其中全序列有33个。这些编码蛋白均有相似的结构特征, 梁革梅等(2003) 文章

与有活性的毒蛋白结合。APN 转入对, , 由此可见Cry1Ac 的一个受体(G ill ) 。而舞毒蛾的APN 在异源细胞S f9

中重组后与毒蛋白Cry1Ac 的亲和力下降, 不能作为毒素受体。苹浅褐卷蛾在异源S f9细胞中表达, 尽管重组蛋白在S f9细胞表面表达, 但并不与Cry1Ac 和Cry1Ba 结合。将对Bt 敏感的烟芽夜蛾

Heliothis virescens 的APN 基因转入对Cry1Ac 和

Cry1Fa 具有先天抗性(不结合这两种毒素) 的果蝇S2细胞中进行表达, 以期将对毒素抗性的S2细胞

中已有详细叙述, 在此不再重述。

112　氨肽酶受体与毒素的结合特性

Lorence 等(1997) 发现毒蛋白结合位点与氨肽酶的催化活性中心位点不同, 并且除去具有锚定APN 作用的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol , G PI ) 后也不影响APN 作为受体的作用。进一步研究受体APN 的结合部位发现, 家蚕的APN1(Y aoi et al . ,1999) 和小菜蛾的APN3(G omez et al . , 2001) 与Cry1Aa 结合均在Ile135与Pro198之间。家蚕和小菜蛾的4组APN (APN1、APN2、APN3和APN4) 均存在与Cry1Aa 和Cry1Ab 的结合区域, 但是当这4组APN 均存在时,Cry1Aa 和Cry1Ab 仍仅结合其中的部分APN , 并且这种结合与APN 的分组无关(Nakanishi et al . ,2002) 。分析其可能原因是, 毒蛋白与APN 结合除受APN 与毒蛋白结合区域结构决定外, 可能还受其他因素的制约。

Rajag opal 等(2003) 从棉铃虫中克隆和表达了两组APN (HaAPN1和HaAPN2) , 配体印迹分析两组APN 与有生物活性的Cry1Aa 、Cry1Ab 和Cry1Ac 蛋白表现出不同的相互作用:3种毒蛋白均与APN1结合而仅Cry1Ac 与APN2作用。说明不同的毒素结合昆虫中肠刷状缘膜囊上不同的APN 。

转化为敏感的细胞, 然而用标记的毒素Cry1Ac 结合已转染表达烟芽夜蛾APN 基因的S2细胞时发现, APN 未增加细胞膜的渗透性, 该细胞仍对毒蛋白表

现抗性, 说明APN 在烟芽夜蛾体外不结合Bt 毒素(Banks ,2003) 。

表1　昆虫中肠氨肽酶N 基因在异源细胞系的表达

T able 1　Expression of aminopeptid ase N gene on

insect midgut in endogenous cells

昆虫种类

Insect s pecies

转染异源细胞

End ogen ous cells

S f9

E . coli

文献出处

Re ference

Y a oi et al . , 1999Den olf et al . , 1997

小菜蛾P lutella xylo stella 家蚕Bombyx mori

烟草天蛾Manduca sexta 舞毒蛾Lymantria dispar

苹浅褐卷蛾E piphya s po stvittana 斜纹夜蛾Spodoptera litura 棉铃虫H elico verpa armigera 烟芽夜蛾H eliothis vir e scen s 烟草天蛾Manduca sexta

S f21S f9S f9S f21

Lou et al . , 1999K arner et al . , 1999S im ps on and New c om b , 2000Agraw al et al . , 2002

T richoplu sia ni R ajag opal et al . , 2003Dro sophila S 2Banks et al . , 2003Dro sophila

G ill and E llar , 2002

114　氨肽酶受体与昆虫对Bt 毒素抗性的关系

Zhu 等(2000) 克隆和测序印度谷螟Plodia

interpunctella 的Bt 抗性品系H D198和敏感品系

RC668, 对比其cDNA 序列发现, 在开放阅读框中有

6期王　莉等:Bt 杀虫晶体蛋白受体分子的结构与功能

1011

4个核苷酸不同, 翻译成蛋白序列有2个氨基酸不

同。经特定等位基因PCR 扩增(PAS A ) 发现抗Bt 的

突变为G lu ,

这个突变位于被认为是Cry1A 与昆虫结合高度保守的同源区域(证明是Cry1Aa 与家蚕和小菜蛾结合区域) 。因而, 这个区域的改变能够影响毒素结合, 导致抗性的产生。Rajag opal 等(2002) 利用双链RNA 使斜纹夜蛾中肠APN 基因沉默导致斜纹夜蛾对Cry1C 毒素抗性增加, 说明斜纹夜蛾中肠APN 是Bt 杀虫蛋白Cry1C 的受体。K night 等(2004) 分析烟草天蛾120kD APN 多糖结构, 直接说明120kD APN 与Cry1Ac 毒素结合。Wang 等(2005) 研究发现Bt 毒素Cry1Ac 在幼虫中肠BBMV 上形成穿孔与BBMV 上APN 的量呈正相关。

但害虫对Bt 的抗性与APN Lee 等(2个精氨、谷氨酸或赖氨酸后, 其对烟草天蛾和舞毒蛾幼虫的杀虫活性急剧下降, 但突变的Cry1Ab 毒素对烟草天蛾中肠BBMV 和纯化的APN 的亲和特性并不一致, 因而推断在烟草天蛾中肠内可能还存在另一重要受体。M orin 等(2003) 实

H D198核苷酸发生点突变, 由Asp

r 185185

典型的类钙粘蛋白的结构特征是一跨膜糖蛋白,N 端位于细胞外,C 端位于细胞质中, 细胞外区域包括多个串连的重复序列, 每个重复有约110个氨基酸残基。烟草天蛾、家蚕、舞毒蛾、烟芽夜蛾、棉铃虫和棉红铃虫Pectinophora gossypiella 等的部分类钙粘蛋白受体基因的全长cDNA 都已经成功克隆并测定了序列。昆虫中肠类钙粘蛋白cDNA 全长均在5000～6000bp 间, 编码1700多个氨基酸, 但成熟的类钙粘蛋白受体大小不一, 从175～270kD 不等, 以210kD 大小为多。根据cDNA 序列推断的编码产物具有共同的结构域。从N C 端依次是:一段N , (repeat ,9个) , 一个近。信号肽序列在蛋白质加工时被切除掉了(G ahan et al . ,2001; D orsch et al . , 2002; Hua et al . ,2004a ) 。

212　受体类钙粘蛋白与毒素的结合特性

受体类钙粘蛋白与Bt 毒素的亲和力很高, 大小为017～310nM , 远大于氨肽酶N 等与毒素的亲和力。

类钙粘蛋白受体近膜区域邻近的重复子(区域) 是与Cry1毒素蛋白结合及形成穿孔的关键区域。但不同昆虫的类钙粘蛋白受体与Bt 杀虫蛋白的结合部位并不完全相同。对Bt-R175受体来说CR9是关键区域, 而对Bt-R1a 受体来说CR12是关键区域(Hua et al . ,2004a ) 。烟草天蛾受体Bt-R1至少有两个与毒素Cry1A 互作的部位(G omez et al . ,2003) 。Cry1Ab 结合区域1(T BR1) 位于钙粘蛋白受体重复子(区域) 7(CR7) 上7个氨基酸残基部位(G omez et al . ,2002) ; 结合位点2(T BR2) 位于钙粘蛋白受体重复子(区域) 11(CR11) (Hua et al . ,2004a ) 。Hua 等(2004a ) 将与Bt-R1存在两个氨基酸结构不同的Bt-R1a 片段体外表达, 配体印迹及血细胞计数化验等

验结果也表明, 烟芽夜蛾幼虫和棉红铃虫幼虫在中肠BBMV 上Cry1A 毒素受体氨肽酶N 正常存在的情况下, 仍可因受体类钙粘蛋白基因突变而产生极高水平的抗性。而Banks 等(2003) 则发现Cry1Ac 可以与110kD 的氨肽酶结合, 但这种结合并不能导致细胞膜的穿孔。

2　类钙粘蛋白

Vadlamudi 等(1993) 首次在烟草天蛾BBMV 上

发现了CrylA 毒素的一种蛋白受体与钙粘蛋白(cadherin ) 的结构很相似, 称其为类钙粘蛋白。该类钙粘蛋白可能是细胞快速繁殖和组织生长期间昆虫幼虫中肠上皮组织所必需的物质(Midboe et al . , 2003) 。

211　受体类钙粘蛋白的结构特征

分析发现Bt-R1a 的重复子(区域) CR11和CR12是

与Cry1Ab 结合的部位, 而CR12是Bt-R1a 与Cry1Ab 作用必须的功能性受体。Nagamatsu 等(1999) 曾发现Bt-R175的N 端最后一个重复子是受体BtR175与Cry1A 毒素相结合的必须部位。G omez 等(2001) 采

受体类钙粘蛋白与钙粘素超家族蛋白(特别是

来自哺乳动物的) 同源性一般。如烟草天蛾的受体类钙粘蛋白Bt-R1与钙粘素超家族蛋白序列的相似性为30%～60%。截止2006年1月, 在G enBank 中已注册的昆虫类钙粘蛋白已有8种21个, 其中全序列有12个。

用噬菌体展示技术首次筛选到了Bt-R1和Bt-R175上与Cry1A 毒素结合的氨基酸序列, 二者分别是869HIT DT NNK 876和1296LDETT N1301。Bt-R1与Bt-R175与杀虫蛋白Cry1A 的结合部位显著不同。

很多实验表明, 不同毒素结合同一类钙粘蛋白

1012昆虫学报Acta Entomologica Sinica 49卷

受体, 如Cry1Ac 、Cry1Ab 和Cry1Aa 等都可以与某些昆虫的受体类钙粘蛋白结合。这几种毒素的同源性很高, 因此不难理解它们有共同的受体。竞争性配体结合试验结果表明, 它们一般在受体类钙粘蛋白上共享同一结合位点。棉红铃虫敏感品系中Cry1Aa 、Cry1Ab 、Cry1Ac 和Cry1Ja 结合同一位点。竞

载体, 在转染异源草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda

细胞系S f21、C os7和Hek293时, 发现表达产物分子量只有195kD , 比BBMV 上的受体约小15kD (K eeton and Bulla ,1997) , 这可能是由于在虫体的中肠组织细胞中和异源细胞系中的翻译后修饰作用不同。从家蚕中肠克隆的Bt-R175基因的cDNA , 在构建了杆状病毒表达载体系统时发现表达Bt-R175受体基因的细胞发生膨胀和裂解, 原因可能是在细胞质膜上有离子通道形成(Nagamatsu et al . ,1999) 。

Tsuda 等(2003) 研究发现从家蚕中肠克隆的Bt-R175基因在哺乳动物细胞系C H ek293表达后,

争实验表明, 这些毒素没有结合其他位点, 改变共同位点导致对三种Cry1A 均产生抗性(G onzalez-Cabrera et al . , 2003) 。213　受体类钙粘蛋白基因在异源细胞中的表达至今, 已报道有4种昆虫的类钙粘蛋白受体基因被克隆并在异源细胞系中表达(表2) 。克隆了烟草天蛾中肠Bt-R1基因的cDNA , 并构建了质粒表达

对Cry1Aa , 说明在昆虫中共同作用。

表2　T able 　midgut in endogenous cells 转染异源细胞

Endogenous cells S f21C os7Hek293S f9C os7Hek293

Drosophila S2

文献出处

Reference

K eeton and Bulla , 1997; M eng et al . , 2001K eeton and Bulla , 1997; D orsch et al . , 2002K eeton and Bulla , 1997Nagamatsu et al . , 1999Ikawa et al . , 2000Tsuda et al . , 2003Hua et al . , 2004b Flannagan et al . , 2005

烟草天蛾Bt-Manduca sexta Bt-R1

家蚕Bt-R175

Bombyx mori Bt-R175

烟草天蛾Bt-R1(a ) Manduca sexta Bt-R1(a )

玉米螟Ostrinia nubilalis

S f9

214　受体类钙粘蛋白与昆虫对Bt 毒素抗性的关系

体(Hua et al . ,2004a ) 。

Cry1Ab 对烟草天蛾的结合域则位于1363～1464氨基酸序列区(Hua et al . ,2004a ) 。钙粘蛋白

目前在鳞翅目昆虫的钙粘蛋白基因中至少发现有5个不同的突变与Cry1Ac 抗性相关。这些突变导致不能产生完整的钙粘蛋白, 从而失去其受体的作用(Xu et al . , 2005) , 导致昆虫产生抗性。如G ahan 等(2001) 发现, 对Cry1Ac 毒素抗性为10128

的这部分区域是毒素对昆虫作用的关键性区域。这部分区域突变将导致毒素对昆虫亲和能力的变化。如将烟芽夜蛾基因1430位的G ln 突变为Ala 增加了Cry1Ac 的亲和力; 而1425位的Leu 仅单一核苷酸突变,CTG 突变为CGG 则明显降低与毒素的亲和能力, 导致昆虫抗性产生(Hua et al . ,2004a ) 。

尽管已在数种昆虫体内发现其中肠类钙粘蛋白受体的突变可以导致害虫对Bt 杀虫蛋白的抗药性, Xu 等(2005) 对棉铃虫抗性和敏感种群杂交、抗性种群回交试验以及连锁分析Cry1Ac 抗性与钙粘蛋白基因座紧密连锁, 也认为钙粘蛋白基因可能成为田间种群在DNA 水平对Bt 抗性检测的首选对象。但不同昆虫对不同Bt 毒素的受体也存在着很大差异, 也有报道认为Cry1Aa 毒素的一种人工缺失突变物影响毒素与受体类钙粘蛋白的结合, 但却不影响毒素与受体氨肽酶N 的结合(Jenkins et al . ,2000) 。最近有关田间小菜蛾抗性种群的抗性分子机制研究发

倍的烟芽夜蛾Y H D2品系的Cry1A 毒素受体类钙粘蛋白基因发生了插入突变, 导致编码的蛋白质缺失C 端的1110个氨基酸残基。抗性昆虫Y H D2可能

有3种不同长度的mRNA 且只能产生具有信号肽序列和5个重复子, 缺少其他部分的蛋白质前体, 因此既不能定位在质膜上, 也不能与毒素进行特异性结合。

M orin 等(2003) 对烟草天蛾和棉红铃虫研究发

现, 棉红铃虫对Cry1Ac 的抗性(抗性比值为3100倍) 与受体类钙粘蛋白基因编码区的3个缺失突变位点(r1、r2和r3) 有关。每一个缺失突变至少导致毒素结合区域的上游缺失8个氨基酸残基。含2个缺失突变位点的昆虫具有抗性, 而含1个缺失突变位点(rs ) 或不含缺失突变位点(ss ) 的昆虫为敏感个

6期王　莉等:Bt 杀虫晶体蛋白受体分子的结构与功能

1013

现, 田间小菜蛾的AF LP 遗传图谱中钙粘蛋白基因

PxCa L P 位于LG 8染色体上而Mode 1抗性基因位于LG 22上, 它们不在同一染色体上, 小菜蛾对Bt 毒素的抗性似乎不限于DNA 水平上钙粘蛋白的突变, 其抗性发展有不同的遗传基础(Baxter et al . ,2005) 。

Cry1Ac 有抗性的烟芽夜蛾的类钙粘蛋白, 导致其与Cry1Aa 的结合能力减小, 但与Cry1Ab 和Cry1Ac 的结合不减小(Jurat-Fuentes and Adang , 2004) 。而Cry1Ac 毒素蛋白抑制烟芽夜蛾和烟草天蛾的Alp 活

性。此外, 配基印迹实验表明烟芽夜蛾的mAlp 也与Cry1Ac 毒素蛋白直接互作, 从而证明Cry1Ac 与膜结合的碱性磷酸酶直接互作(Jurat-Fuentes and Adang , 2004) 。Jurat-Fuentes 和Adang (2004) 基于免疫印迹

3　碱性磷酸酶

碱性磷酸酶(Alp ) 在生物体中广泛分布说明它

对生命有重要作用。尽管在哺乳动物中已进行了大量研究, 但至今对其生物学意义及其作用仍不清楚。311　受体碱性磷酸酶的种类及结构特征

与哺乳动物相比, 昆虫的Alp 分布是有限的, 主要在中肠组织中。昆虫体内存在膜结合(bound , mAlp ) 和可溶性(s oluble , 2磷酸酶。

昆虫在; 分子量约; 能够被L-半胱氨酸抑制(Eguchi ,1995) 。昆虫体内的mAlp 和sAlp 受同一染色体上不同的基因控制。mAlp 具有较高的稳定性和多形性, 被认为是昆虫中肠细胞生成的, 其抗消化液的能力高于sAlp (Eguchi ,1995) 。目前至少发现3种类型的mAlp , 它对蛋白表达活性和蛋白呈现大量的多样性起重要作用(Itoh et al . ,1999) 。

至今, 已克隆出家蚕的mAlp 受体, 其cDNA 全长1974bp , 编码547个氨基酸, 包括一个36个氨基酸组成的信号肽和511个氨基酸组成的成熟蛋白。昆虫mAlp 受体是金属离子依赖性酶。13个氨基酸保守区域对Alp 功能起重要作用, 包括3个氨基酸

组成的底物结合位点和10个氨基酸组成的Zn 和2+

Mg 结合位点(Itoh et al . ,1999) 。C 端含一个疏水的膜锚定区。mAlp 具有N-乙酰半乳糖胺(G alNAc ) , 通过G PI 锚定在BBMV 上, 参与Bt 毒素对昆虫的作用, 毒素蛋白与mAlp 特异性互作, 导致磷酸酶活性受到抑制(Jurat-Fuentes and Adang ,2004) 。312　受体碱性磷酸酶与昆虫对Bt 毒素抗性的关系

Brav o 等(2002) 通过配基印迹和Western 杂交试验表明Cry1A 有大量特异性受体, 并且Cry1Ab 毒素形成穿孔时,APN 和Alp 有很高的活性, 可能参与其中作用。McNall 和Adang (2003) 认为碱性磷酸酶是除以前报道的APN 外与Cry1Ac 结合的新蛋白。通过Western 杂交精确地证明碱性磷酸酶和氨肽酶N 是结合Cry1Ac 的蛋白受体, 并且烟草天蛾的mAlp 与Cry1Ac 毒素蛋白直接互作。有报道认为敲除对

和碱性磷酸酶活性测定等实验又证实昆虫中肠mAlp 的活性与昆虫抗性有直接关系,mAlp 活性减小, 昆虫对毒素的抗性增加, 但的具体作用并不清楚。

Bt 毒素与受体结合过程必然伴随毒素插入膜,

形成穿孔的过程。昆虫抗性产生可能与这些过程变化有关, 因此, 要解释Bt 毒素作用及昆虫抗性产生过程, 不仅要研究抗性、敏感昆虫种群BBMV 上的蛋白, 也要研究BBMV 脂质的物质特性(K umaraswami et al . , 2001) 。

糖脂指含有糖基的脂质化合物, 普遍存在于原核和真核细胞的质膜上, 在神经细胞膜上糖脂含量较高, 是生物体细胞膜结构的重要组分。在脊椎动物中, 糖脂还在细胞间相互识别, 分化及信号转导等起重要作用(K umaraswami et al . , 2001) 。

411　受体糖脂类物质的种类及结构特征

糖脂一般可分为鞘糖脂(glycosphing olipids ) 和甘

油糖脂(glyceroglycolipids ) , 动物以前者为主。鞘糖脂又可分为中性和酸性鞘糖脂, 包括脑苷脂、神经节苷脂等。已知破伤风毒素、霍乱毒素、干扰素、促甲状腺素、绒毛膜促性腺激素和5-羟色胺等作用受体都是不同的糖脂。

糖脂是两性分子。其结构以鞘胺醇(sphing oine ) 等为骨架, 与一条脂肪酸链组成疏水尾部, 亲水头部含一个或多个糖残基与鞘胺醇的羟基结合。412　受体糖脂类物质与昆虫对Bt 毒素抗性的关系

Marroquin 等(2000) 发现在秀丽小杆线虫

Caenorhabditis elegans 中5种基因(称为bre genes ) 与

Bt 抗性的产生相关, bre 基因突变导致线虫对Cry5B

产生抗性; 如果抑制其活性就会造成线虫对Cry5B 和Cry14A 产生抗性。bre 基因编码的4种糖基转移酶蛋白是毒素被转移到肠细胞所必须的(Marroquin et al . , 2000; G riffitts et al . , 2003) 。BRE -3和BRE -

1014昆虫学报Acta Entomologica Sinica 49卷

5体外合成鞘糖脂碳水化合物(G riffitts et al . , 2001) , 因此推断BRE 可能参与鞘糖脂的生物合成,

并且鞘糖脂可能是一种迄今未知的Bt 毒素寄主细胞的受体。K umaraswami 等(2001) 将BBMV 脂质分为4部分:非极性脂质、磷脂、中性糖脂和酸性糖脂。通过分离提取抗性、敏感小菜蛾BBMV 和中肠各组分含量, 发现抗性种群BBMV 和中肠提取结果一致, 中性糖脂含量明显偏低, 仅有敏感种群的一半。抗性和敏感种群中性糖脂含量不同可能影响质膜的理化性质包括膜流动性、疏水性和表面张力, 因此致使Bt 毒素结构域Ⅰ的α-螺旋很难插入质膜, 同时表明它们参与小菜蛾抗性的发展。

G riffitts 等(2005) 提取野生型和bre 突变型生物的脂质进行进一步研究, 结果发现:(1) 虫对Bt 化合物的丢失; 合。Cry1Ac , 竞争亲和实验显示这种结合是特异性的。此外, Cry1Aa 和Cry1Ab 与Cry1Ac 一样结合糖脂; (3) 这种结合依靠碳氢键, 并且与毒素在活体内的活性有关。杀虫作用的晶体蛋白活性也可能被糖脂类寄主细胞受体调控。因此, 证明昆虫中肠中存在的糖脂类也是Bt 毒素的受体。

此外, 还有人认为肌动蛋白(McNall and Adang , 2003) 和一种大分子量的糖蛋白BtR-270(G riffitts and Aroian , 2005) 等也是Bt 毒素的受体。

互作显示Cry1Aa 、Cry1Ab 和Cry1Ac 竞争同一结合位点, 但Cry2A 不结合Cry1Ac 的结合位点(Estela et al . , 2004; Xu et al . , 2005) 。一种昆虫可能有多种不同Cry1毒素结合的受体, 如烟草天蛾的120kD APN 与Cry1Ac 结合; 106kD APN 与Cry1Ab 和Cry1C 结合, 钙粘蛋白是烟草天蛾与Cry1Aa 的结合

蛋白(Sangadala et al . , 2001) 。

昆虫对于Bt 抗性产生可能有多种机制。Cry1Ac 和Cry2Aa 毒素并不共享烟芽夜蛾的同一受体, 对于两种毒素具有交互抗性的品系K C Bhyb , 至少存在两种抗性机制(Jurat-et al . , 2003) ; (Xu et al . , Bt 抗性相关的受体研究目前已有很大突破, 研究发现了更多的相关受体, 进一步明确了几种重要害虫抗性产生的机理, 提出昆虫对Bt 抗性产生是多个受体共同参与的多步作用过程的设想, 为昆虫受体的深入研究拓宽了思路。但昆虫潜在的Bt 抗性机制很多, 抗性特点差别较大。迄今为止, 还有许多昆虫对Bt 的作用受体仍未完全明确, 抗性机制尚未完全清楚, 这些都需要进一步的深入研究。

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5　小结与展望

目前,Bt 毒素受体仍是一个激烈争论的问题,Bt

毒素蛋白与昆虫受体间的相互作用方式甚为复杂, 一种Bt 毒素蛋白在同一种昆虫中可有多种受体, 同一受体可能还有多个位点, 在不同种类的昆虫中其受体可能不同, 而不同种类的Bt 毒素蛋白也可能共享同一受体。

G riffitts 等(2005a ) 推测穿孔形成可能是多个受体参与的多步结合过程, 假设对线虫而言, 与Cry1A4起重要作用的糖脂类可能和糖蛋白两者顺序或同时起作用将Bt 毒素适当插入双层膜内或膜上。

昆虫抗性产生可能是昆虫体内多种受体与毒素共同作用的结果。毒素选择性决定于毒素结构以及不同种类昆虫的不同受体位点。Bt 毒素与棉铃虫

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(责任编辑:黄玲巧)