学 术 论 坛2010 NO.30科技创新导报
食品中大肠杆菌的检验方法
邢秀英
(营口市产品质量监督检验所 辽宁营口 115000)
摘 要:食品中大肠杆菌感染已经成为世界性问题,我国情况也不容乐观。本文分析几种有效检验大肠杆菌方法为大肠杆菌检验奉献微薄力量。
关键词:大肠杆菌 检验方法 食品检验 微生物
中图分类号:TS207.4文献标识码:A文章编号:1674-098X(2010)10(c)-0231-01
大肠杆菌基本上是一种食源性病原
菌,人可以通过食用大肠杆菌污染的牛肉、
牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、
水等感染,也可通过人与人、人与动物密切
接触传播。现在食品检验领域里,大肠菌群
作为评价食品卫生质量重要指标之一,目
前已被国内外广泛应用于食品卫生工作
中。为避免食物中大肠杆菌影响人类身体
健康,食品生产、加工及后期检验工作中,
都应运用合理分析技术检验食品中微生物
含量,使其含量在国家《食品安全法》要求
范围内保证食品质量,严格控制大肠杆菌
含量保证消费者身体健康。那么,如何让分
析检验食品中大肠杆菌问题呢？
1 宏观上的方法
国家在宏观上对检验方法进行规划并
在宏观上进行指导。目前国内采用进出口
食品检验大肠杆菌方法主要是分为国家标
准和原国家商检局制订行业标准。
(1)国家标准。现行国家标准主要采取
三个实验步法,即乳糖发酵试验、分离培养
和证实试验。乳糖发酵试验:稀释样品后选
三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆
盐发酵管。36±1℃温度下培养48±2h观察
是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物
转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃温度
下培养18～24小时观察菌落形态。证实试
验:挑取平板上可疑菌落,进行革兰氏染色
观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃温度下
培养24±2h观察产气情况。根据证实为大
肠杆菌阳性管数,查MPN表报告每100ml(g)
大肠菌群MPN值,然后参照食物标准看是
否大肠杆菌含量超标。
(2)原国家商检局制订的行业标准。此
方法等效采用美国FDA标准方法,主要用
于对出口食品中大肠杆菌检测,本方法采
用两个实验步法:推测试验和证实试验。推
测试验:稀释样品后,选三个稀释度,每个
稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48
±2h观察是否产气。证实试验:将产气管培
养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,
36±1℃培养48±2h观察是否产气。以
BGLB产气为阳性,查MPN表报告每ml(g)样
品中大肠菌群MPN值。
2 微观上的方法
具体实验操作中,我认为食品中大
肠杆菌检验中以下几种方法更具有实用
价值。(1)免疫磁珠分离法。免疫磁珠分离法果更加准确,因此在大肠杆菌检测中抗体是将特异性抗体吸附于一种能被吸附磁性定位荧光技术实用性更好。珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样实验主要步骤是对样品进行过滤,用品中大肠杆菌富集起来。具体步骤:①培养荧光染料对留在滤膜上菌细胞染色后,用大肠杆菌;②取样品1ml加大肠杆菌免疫磁荧光显微镜观察计数。由于抗体定位荧光珠20ul;③轻轻混合10分钟;④将试管插入技术运用特定荧光标记特异抗体,过滤后磁架上;⑤吸取上清;⑥加PBS,重复3～5过菌细胞与荧光标记特异抗体作用,只对被程;⑦取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨检菌被染色,对于本底杂菌不染色,克服因醇麦康凯琼脂等选择性培养基。37℃下培其他杂质被染色而导致问题。此技术由于养6～24h挑取可疑菌落进行鉴定。免疫磁无需培养或分离过程因此检测非常快速。珠分离技术实用性在于代替常规选择性增(5)聚合酶链反应技术。过去大肠杆菌菌培养过程,可特异有效地将目的微生物肠毒素检测多采用乳鼠灌胃试验、兔肠撑从样品中快速分离出来。如与快速检验方结扎试验,之后ELISA、寡核普酸和克隆多法相结合,可数倍提高效率并节省大量时核昔酸DNA探针等相继应用,最近PCR亦间。Wright、Cubbon和Chapman用免疫磁珠用于控制检测大肠杆菌肠毒素基因。聚合分离法对食品标本大肠杆菌进行检测,达酶链反应技术即PCR技术,就是根据已知到很好检验效果,与PCR符合率高。持扩增DNA片段序列,人工合成与该DNA(2)生化反应大肠杆菌O157:H7卫生威两条链末端互补两段寡核苷酸引物,在体胁人类健康,目前许多国家使用O157和外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度行扩增一种方法。[1]交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆PCR技术检测的主要步骤:①运用化学菌是必须的。Thompson是使用生化反应来手段对目标DNA提取;②设计并合成引物,检验食品中大肠杆菌代表人物,他等建立引物设计与合成的好坏直接决定PCR扩增了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml成效,通常要求引物位于待分析基因组中置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养高度保守区域,长度为15～30个碱基为宜;物混匀于其中,在44.5℃温度下将混合物③进行PCR扩增;④克隆并筛选鉴定PCR产放置20分钟,然后将混合物在暗室内高强物,将扩增产物进行电泳、染色,在紫外光度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳照射下可见扩增特异区段DNA带,根据该性,然后根据产生蓝光数目与国家标准数带不同即可鉴定不同DNA;⑤DNA序列分目进行比较确定其含量。此检测方法时间析。[2]结果表明该法是一种特异性强、敏感一般不到1h且检测效率非常高。性高、省时、省力的检测方法。(3)胶体金免疫技术胶体金免疫技术是食品检验中微生物检验是一个重要方目前应用广泛的一种简便、快速的血清学面,而微生物中大肠杆菌是威胁人类健康检验方法,主要以胶体金作为标记物进行一个重要方面,本文只是分析了几种大肠抗原抗体反应,此技术最初用于免疫电镜杆菌检验方法,随着食品、生物技术发展,技术,至今在免疫测定中,金标记常与膜载检验微生物方法还将继续推出,继续缩短体配合形成特定模式。此方法主要采用还检验时间,提高检验效率,使检验结果灵敏原法,氯金酸是主要还原材料。中国预防医度和特异性也有了保证。这些常规方法也学科学院微生物研究所利用胶体金技术、随着食品技术发展不断得到改进。双抗体夹心法和显色反应等特点,研制大肠杆菌O157:H7病原体快检金卡,通用于参考文献定性检测食品等样品中O157:H7大肠杆[1]阚欢,王伟.PCR技术在食品检测领域菌,显色程度与样品中细菌含量成正比,最的最新应用进展[J].粮食与食品工业,低测菌量为少于100个菌细胞。主要特点是2004(3):58—60.敏感性高,可用于待检样品初筛,阳性样品[2]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].可进行细菌分离,减少工作量。高等教育出版社,1993.(4)免疫荧光技术。免疫荧光技术分为直接荧光技术与抗体定位荧光技术,主要特点是在显微镜下直接计数样品菌细胞。抗体定位荧光技术比直接荧光技术检测结
科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ231
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食品中大肠杆菌的检验方法
邢秀英
(营口市产品质量监督检验所 辽宁营口 115000)
摘 要:食品中大肠杆菌感染已经成为世界性问题,我国情况也不容乐观。本文分析几种有效检验大肠杆菌方法为大肠杆菌检验奉献微薄力量。
关键词:大肠杆菌 检验方法 食品检验 微生物
中图分类号:TS207.4文献标识码:A文章编号:1674-098X(2010)10(c)-0231-01
大肠杆菌基本上是一种食源性病原
菌,人可以通过食用大肠杆菌污染的牛肉、
牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、
水等感染,也可通过人与人、人与动物密切
接触传播。现在食品检验领域里,大肠菌群
作为评价食品卫生质量重要指标之一,目
前已被国内外广泛应用于食品卫生工作
中。为避免食物中大肠杆菌影响人类身体
健康,食品生产、加工及后期检验工作中,
都应运用合理分析技术检验食品中微生物
含量,使其含量在国家《食品安全法》要求
范围内保证食品质量,严格控制大肠杆菌
含量保证消费者身体健康。那么,如何让分
析检验食品中大肠杆菌问题呢？
1 宏观上的方法
国家在宏观上对检验方法进行规划并
在宏观上进行指导。目前国内采用进出口
食品检验大肠杆菌方法主要是分为国家标
准和原国家商检局制订行业标准。
(1)国家标准。现行国家标准主要采取
三个实验步法,即乳糖发酵试验、分离培养
和证实试验。乳糖发酵试验:稀释样品后选
三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆
盐发酵管。36±1℃温度下培养48±2h观察
是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物
转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃温度
下培养18～24小时观察菌落形态。证实试
验:挑取平板上可疑菌落,进行革兰氏染色
观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃温度下
培养24±2h观察产气情况。根据证实为大
肠杆菌阳性管数,查MPN表报告每100ml(g)
大肠菌群MPN值,然后参照食物标准看是
否大肠杆菌含量超标。
(2)原国家商检局制订的行业标准。此
方法等效采用美国FDA标准方法,主要用
于对出口食品中大肠杆菌检测,本方法采
用两个实验步法:推测试验和证实试验。推
测试验:稀释样品后,选三个稀释度,每个
稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48
±2h观察是否产气。证实试验:将产气管培
养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,
36±1℃培养48±2h观察是否产气。以
BGLB产气为阳性,查MPN表报告每ml(g)样
品中大肠菌群MPN值。
2 微观上的方法
具体实验操作中,我认为食品中大
肠杆菌检验中以下几种方法更具有实用
价值。(1)免疫磁珠分离法。免疫磁珠分离法果更加准确,因此在大肠杆菌检测中抗体是将特异性抗体吸附于一种能被吸附磁性定位荧光技术实用性更好。珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样实验主要步骤是对样品进行过滤,用品中大肠杆菌富集起来。具体步骤:①培养荧光染料对留在滤膜上菌细胞染色后,用大肠杆菌;②取样品1ml加大肠杆菌免疫磁荧光显微镜观察计数。由于抗体定位荧光珠20ul;③轻轻混合10分钟;④将试管插入技术运用特定荧光标记特异抗体,过滤后磁架上;⑤吸取上清;⑥加PBS,重复3～5过菌细胞与荧光标记特异抗体作用,只对被程;⑦取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨检菌被染色,对于本底杂菌不染色,克服因醇麦康凯琼脂等选择性培养基。37℃下培其他杂质被染色而导致问题。此技术由于养6～24h挑取可疑菌落进行鉴定。免疫磁无需培养或分离过程因此检测非常快速。珠分离技术实用性在于代替常规选择性增(5)聚合酶链反应技术。过去大肠杆菌菌培养过程,可特异有效地将目的微生物肠毒素检测多采用乳鼠灌胃试验、兔肠撑从样品中快速分离出来。如与快速检验方结扎试验,之后ELISA、寡核普酸和克隆多法相结合,可数倍提高效率并节省大量时核昔酸DNA探针等相继应用,最近PCR亦间。Wright、Cubbon和Chapman用免疫磁珠用于控制检测大肠杆菌肠毒素基因。聚合分离法对食品标本大肠杆菌进行检测,达酶链反应技术即PCR技术,就是根据已知到很好检验效果,与PCR符合率高。持扩增DNA片段序列,人工合成与该DNA(2)生化反应大肠杆菌O157:H7卫生威两条链末端互补两段寡核苷酸引物,在体胁人类健康,目前许多国家使用O157和外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度行扩增一种方法。[1]交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆PCR技术检测的主要步骤:①运用化学菌是必须的。Thompson是使用生化反应来手段对目标DNA提取;②设计并合成引物,检验食品中大肠杆菌代表人物,他等建立引物设计与合成的好坏直接决定PCR扩增了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml成效,通常要求引物位于待分析基因组中置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养高度保守区域,长度为15～30个碱基为宜;物混匀于其中,在44.5℃温度下将混合物③进行PCR扩增;④克隆并筛选鉴定PCR产放置20分钟,然后将混合物在暗室内高强物,将扩增产物进行电泳、染色,在紫外光度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳照射下可见扩增特异区段DNA带,根据该性,然后根据产生蓝光数目与国家标准数带不同即可鉴定不同DNA;⑤DNA序列分目进行比较确定其含量。此检测方法时间析。[2]结果表明该法是一种特异性强、敏感一般不到1h且检测效率非常高。性高、省时、省力的检测方法。(3)胶体金免疫技术胶体金免疫技术是食品检验中微生物检验是一个重要方目前应用广泛的一种简便、快速的血清学面,而微生物中大肠杆菌是威胁人类健康检验方法,主要以胶体金作为标记物进行一个重要方面,本文只是分析了几种大肠抗原抗体反应,此技术最初用于免疫电镜杆菌检验方法,随着食品、生物技术发展,技术,至今在免疫测定中,金标记常与膜载检验微生物方法还将继续推出,继续缩短体配合形成特定模式。此方法主要采用还检验时间,提高检验效率,使检验结果灵敏原法,氯金酸是主要还原材料。中国预防医度和特异性也有了保证。这些常规方法也学科学院微生物研究所利用胶体金技术、随着食品技术发展不断得到改进。双抗体夹心法和显色反应等特点,研制大肠杆菌O157:H7病原体快检金卡,通用于参考文献定性检测食品等样品中O157:H7大肠杆[1]阚欢,王伟.PCR技术在食品检测领域菌,显色程度与样品中细菌含量成正比,最的最新应用进展[J].粮食与食品工业,低测菌量为少于100个菌细胞。主要特点是2004(3):58—60.敏感性高,可用于待检样品初筛,阳性样品[2]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].可进行细菌分离,减少工作量。高等教育出版社,1993.(4)免疫荧光技术。免疫荧光技术分为直接荧光技术与抗体定位荧光技术,主要特点是在显微镜下直接计数样品菌细胞。抗体定位荧光技术比直接荧光技术检测结
科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ231