microRNA （miRNA ）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA ，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF ），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA 广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt 。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt 的单链RNA 前体经过Dicer 酶加工后形成。成熟的miRNA 形成RNA 诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC ）作用于靶点mRNA ，通过对mRNA 剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA 及其靶mRNA 之间的作用机制。
最近有研究指出，miRNA 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA 参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA 。
目前检测miRNA 的方法主要有Northern 印迹分析，微点阵
（microarray ）分析和实时定量PCR （quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。
1、Northern 印迹分析（Northern Analysis）
Northern 印迹是基于杂交检测RNA 的常用方法，它是最早用于miRNA 分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。
不足之处：
1）Northern 分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA 探针与一个RNA 印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA 功能机理的实验中，Northern 印迹分析还是能够满足研究需要的。
2）Northern 印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA 分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA 分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA 分子每细胞。另外，由于Northe rn 印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA 。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a 和let-7b 之间仅有一个碱基的差异，导致Northern 印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern 印迹实验的重复性较弱。
3）Northern 印迹耗时，耗量。进行一次miRNA 检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern 印迹大概需要5到10微克的总RNA 量上样量才能成功检测出miRNA ，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。
2、微点阵（Microarray ）分析
微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA ，它通过测定特定过程中miRNA 的表达水平，来分析了解miRNA 的表达调控机制以及由miRNA 调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA 样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA 的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA 序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA 分析。 不足之处：
1）微点阵仍然需要足够的RNA 初始样本，大约为每个微点阵5微克。
2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern 印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA 。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA 和成熟的活性miRNA 。
3、定量实时PCR （Quantitative Real-time PCR）
定量实时PCR 技术通过扩增技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR 中TaqMan  (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR 引物和一个序列特异的TaqMan 探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR 的检测，从而使得对PCR 后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。
尽管定量实时PCR 相比Northern 分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA 时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA 长度较短，难以设计成熟miRNA 的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA 分子进行定量实时PCR 检测，利用前体miRNA 的水平作为成熟的活性miRNA 的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA 的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA 水平，因此这种方法无法达到预想中的效果。
目前已有新的定量实时PCR 的方法被用来解决检测miRNA 中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop ）状引物进行miRNA 的反转录，然后再进行定量实时PCR 。这个茎环状结构对成熟的miRNA 3′ 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA 分子扩展并且增加一个通用的3′ 引物位点进行实时PCR 。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA 进行PCR 引导。然后就可以利用实时PCR 进行高特异性的定量检测miRNA 的表达水平。这种实时PCR 的优点是：1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA 总量在1到10ng 之间）。2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA 。
3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA 。4）和传统的定量实时PCR 检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。
三种检测方法的比较
参考文献：
［1］Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 2486～2494
［2］Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188
miRNA 主要研究技术
深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt ）RNA ，通过RT-PCR 扩增之后，利用solexa 深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA 表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA （miRNA-kno wn ）、新的miRNA （miRNA-new ）以及可能的新miRNA （miRNA-cadidate new ），并对新发现的miRNA 进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA ，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA 芯片 利用miRNA 芯片（例如Agilent miRNA 芯片），可以高通量分析miRNA 表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA 的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA 在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA 芯片针对已知miRNA 进行研究。筛选到的差异miRNA 可以利用q-pCR 进行验证。
q-PCR q-PCR 技术可以用来检测miRNA 以及其靶mRNA 和相关mRNA 等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA 设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
(欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：http://www.oebiotech.com )
Mimics 以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA 研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics 或拮抗miRNA 的antagomir ，观察靶mRNA 及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA 功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA 之后，找到位于3ˊ-UTR 区的miRNA 结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA 结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector 系统），通过观察miRN A 对发光强度的影响对结合位点加以验证。
miRNA 的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA 表达谱，Northe rn Blot 或核酸原位杂交检测miRNA 的表达，miRNA 克隆、测序等等。另外，在mi RNA 研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。
miRNA 研究中常用的软件和数据库资源
以下是常用的microRNA 靶标数据库和软件资源列表，希望对microRNA 的研究者有所帮助。
（1） miRbase：众所周知的microRNA 基因注释数据库。目前miRBase 只提供了microRNA 的靶标的预测软件的链接（如：PicTar ）。 网址：http://mirbase.org/index.shtml
（2） starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq （或称为HITS-CLIP ）和mR NA 降解组测序数据支持的microRNA 靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：http://starbase.sysu.edu.cn/
（3） Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA 靶标数据库。网址：http://microrna.gr/tarbase/
（4） miRecords：一个整合的microRNA 靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：http://mirecords.biolead.org/
（5） targetScan: 基于靶mRNA 序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA 靶基因。是预测microRNA 靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA 领域大牛Ba rtel 实验室开发的。网址：http://www.targetscan.org/
（6） PicTar：基于microRNA 或microRNA 靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA 靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA 领域大牛Rajewsky 实验室开发的。该文章位列miRNA 相关文章引用Top5。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
（7） PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility ）和自由能预测m icroRNA 的靶标。是著名的生物信息学家Segal 实验室开发的。网址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html
（8） RNA22：基于序列特征预测microRNA 的结合位点。是几个流行的micro RNA 靶标预测软件的其中一个。IBM 公司的研究团队开发的。网址：http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html
（9） miRanda和microRNA.org ：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda 的最新版本又叫mirSVR 。网址：http://www.microrna.org/microrna/home.do
（10） MicroCosm：EMBL-EBI 的Enright 实验室开发的microRNA 靶标数据库。网址：http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/
（11） miRTarBase：整合实验证实的microRNA 靶标的数据库。网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html
（12） miRGator v2.0：整合microRNA 表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：http://mirgator.kobic.re.kr:8080/MEXWebApp/
（13） MiRNAMap:动物的microRNA 基因及其靶标的数据库。网址：http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/
（14） miRDB: 动物microRNA 靶标预测和功能注释数据库。网址：http://mirdb.org/miRDB/
（15） RNAhybrid：一个基于miRNA-target 配对自由能预测microRNA 的靶标的软件。网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/
（16） miRGen：microRNA 基因和microRNA 靶标数据库。网址：http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html
（17） Targetfinder: 使用基于植物的靶标罚分策略预测小RNA 的靶标软件。网址：http://jcclab.science.oregonstate.edu/node/view/56334
（18） miRU, psRNATarget: 一个网页版的植物microRNA 靶标预测工具。网址：http://www.plantgrn.org/psRNATarget/
（19） CleaveLand:一个基于mRNA 降解组数据预测microRNA 靶标的工具。网址：https://homes.bio.psu.edu/people/faculty/Axtell/AxtellLab/Software.html
（20） Target-align：一个就鉴定植物microRNA 靶标的工具。网址：http://www.leonxie.com/targetAlign.php
microRNA （miRNA ）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA ，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF ），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA 广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt 。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt 的单链RNA 前体经过Dicer 酶加工后形成。成熟的miRNA 形成RNA 诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC ）作用于靶点mRNA ，通过对mRNA 剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA 及其靶mRNA 之间的作用机制。
最近有研究指出，miRNA 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA 参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA 。
目前检测miRNA 的方法主要有Northern 印迹分析，微点阵
（microarray ）分析和实时定量PCR （quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。
1、Northern 印迹分析（Northern Analysis）
Northern 印迹是基于杂交检测RNA 的常用方法，它是最早用于miRNA 分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。
不足之处：
1）Northern 分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA 探针与一个RNA 印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA 功能机理的实验中，Northern 印迹分析还是能够满足研究需要的。
2）Northern 印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA 分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA 分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA 分子每细胞。另外，由于Northe rn 印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA 。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a 和let-7b 之间仅有一个碱基的差异，导致Northern 印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern 印迹实验的重复性较弱。
3）Northern 印迹耗时，耗量。进行一次miRNA 检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern 印迹大概需要5到10微克的总RNA 量上样量才能成功检测出miRNA ，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。
2、微点阵（Microarray ）分析
微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA ，它通过测定特定过程中miRNA 的表达水平，来分析了解miRNA 的表达调控机制以及由miRNA 调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA 样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA 的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA 序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA 分析。 不足之处：
1）微点阵仍然需要足够的RNA 初始样本，大约为每个微点阵5微克。
2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern 印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA 。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA 和成熟的活性miRNA 。
3、定量实时PCR （Quantitative Real-time PCR）
定量实时PCR 技术通过扩增技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR 中TaqMan  (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR 引物和一个序列特异的TaqMan 探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR 的检测，从而使得对PCR 后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。
尽管定量实时PCR 相比Northern 分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA 时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA 长度较短，难以设计成熟miRNA 的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA 分子进行定量实时PCR 检测，利用前体miRNA 的水平作为成熟的活性miRNA 的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA 的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA 水平，因此这种方法无法达到预想中的效果。
目前已有新的定量实时PCR 的方法被用来解决检测miRNA 中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop ）状引物进行miRNA 的反转录，然后再进行定量实时PCR 。这个茎环状结构对成熟的miRNA 3′ 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA 分子扩展并且增加一个通用的3′ 引物位点进行实时PCR 。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA 进行PCR 引导。然后就可以利用实时PCR 进行高特异性的定量检测miRNA 的表达水平。这种实时PCR 的优点是：1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA 总量在1到10ng 之间）。2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA 。
3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA 。4）和传统的定量实时PCR 检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。
三种检测方法的比较
参考文献：
［1］Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 2486～2494
［2］Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188
miRNA 主要研究技术
深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt ）RNA ，通过RT-PCR 扩增之后，利用solexa 深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA 表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA （miRNA-kno wn ）、新的miRNA （miRNA-new ）以及可能的新miRNA （miRNA-cadidate new ），并对新发现的miRNA 进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA ，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA 芯片 利用miRNA 芯片（例如Agilent miRNA 芯片），可以高通量分析miRNA 表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA 的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA 在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA 芯片针对已知miRNA 进行研究。筛选到的差异miRNA 可以利用q-pCR 进行验证。
q-PCR q-PCR 技术可以用来检测miRNA 以及其靶mRNA 和相关mRNA 等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA 设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
(欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：http://www.oebiotech.com )
Mimics 以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA 研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics 或拮抗miRNA 的antagomir ，观察靶mRNA 及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA 功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA 之后，找到位于3ˊ-UTR 区的miRNA 结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA 结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector 系统），通过观察miRN A 对发光强度的影响对结合位点加以验证。
miRNA 的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA 表达谱，Northe rn Blot 或核酸原位杂交检测miRNA 的表达，miRNA 克隆、测序等等。另外，在mi RNA 研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。
miRNA 研究中常用的软件和数据库资源
以下是常用的microRNA 靶标数据库和软件资源列表，希望对microRNA 的研究者有所帮助。
（1） miRbase：众所周知的microRNA 基因注释数据库。目前miRBase 只提供了microRNA 的靶标的预测软件的链接（如：PicTar ）。 网址：http://mirbase.org/index.shtml
（2） starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq （或称为HITS-CLIP ）和mR NA 降解组测序数据支持的microRNA 靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：http://starbase.sysu.edu.cn/
（3） Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA 靶标数据库。网址：http://microrna.gr/tarbase/
（4） miRecords：一个整合的microRNA 靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：http://mirecords.biolead.org/
（5） targetScan: 基于靶mRNA 序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA 靶基因。是预测microRNA 靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA 领域大牛Ba rtel 实验室开发的。网址：http://www.targetscan.org/
（6） PicTar：基于microRNA 或microRNA 靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA 靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA 领域大牛Rajewsky 实验室开发的。该文章位列miRNA 相关文章引用Top5。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
（7） PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility ）和自由能预测m icroRNA 的靶标。是著名的生物信息学家Segal 实验室开发的。网址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html
（8） RNA22：基于序列特征预测microRNA 的结合位点。是几个流行的micro RNA 靶标预测软件的其中一个。IBM 公司的研究团队开发的。网址：http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html
（9） miRanda和microRNA.org ：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda 的最新版本又叫mirSVR 。网址：http://www.microrna.org/microrna/home.do
（10） MicroCosm：EMBL-EBI 的Enright 实验室开发的microRNA 靶标数据库。网址：http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/
（11） miRTarBase：整合实验证实的microRNA 靶标的数据库。网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html
（12） miRGator v2.0：整合microRNA 表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：http://mirgator.kobic.re.kr:8080/MEXWebApp/
（13） MiRNAMap:动物的microRNA 基因及其靶标的数据库。网址：http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/
（14） miRDB: 动物microRNA 靶标预测和功能注释数据库。网址：http://mirdb.org/miRDB/
（15） RNAhybrid：一个基于miRNA-target 配对自由能预测microRNA 的靶标的软件。网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/
（16） miRGen：microRNA 基因和microRNA 靶标数据库。网址：http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html
（17） Targetfinder: 使用基于植物的靶标罚分策略预测小RNA 的靶标软件。网址：http://jcclab.science.oregonstate.edu/node/view/56334
（18） miRU, psRNATarget: 一个网页版的植物microRNA 靶标预测工具。网址：http://www.plantgrn.org/psRNATarget/
（19） CleaveLand:一个基于mRNA 降解组数据预测microRNA 靶标的工具。网址：https://homes.bio.psu.edu/people/faculty/Axtell/AxtellLab/Software.html
（20） Target-align：一个就鉴定植物microRNA 靶标的工具。网址：http://www.leonxie.com/targetAlign.php